專利名稱：一種與Tau蛋白相關(guān)的多肽抗原及抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Tau蛋白相關(guān)的多肽抗原及抗體。
背景技術(shù)：
微管系統(tǒng)是神經(jīng)細(xì)胞骨架成分，主要參與多種細(xì)胞功能。微管由微管蛋白及微管相關(guān)蛋白組成，Tau蛋白是的微管相關(guān)蛋白。正常Tau蛋白的功能是與微管蛋白結(jié)合促進(jìn)其聚合形成微管；與形成的微管結(jié)合，維持微管穩(wěn)定性，降低微管蛋白分子的解離。Tau蛋白基因位于17染色體長臂。正常人中由于Tau蛋白RNA剪輯方式不同，可表達(dá)出至少6種異型。Tau蛋白為含磷酸基蛋白，正常成熟腦中Tau蛋白分子含2～3個磷酸基。而AD患者的Tau蛋白則異常過度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9個磷酸基，并喪失正常生物功能。腦脊液中tau蛋白可能來自死亡的或退化變性的神經(jīng)細(xì)胞。AD患者腦脊液中tau蛋白水平顯著升高，約為健康對照組及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病對照組的2倍。
申請人在研究Tau基因第6外顯子的剪接時(shí)，發(fā)現(xiàn)Tau基因第6外顯子的剪接不同于其外顯子2，3，4A，和10的剪接[1]。隨后的研究證實(shí)，Tau基因第6外顯子剪接位點(diǎn)的選擇利用將導(dǎo)致其閱讀框架的改變，并可能產(chǎn)生截短的，即缺乏與微管蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C-端被截短)的新的Tau蛋白異型[1，2]——Tau蛋白異型6d。這種新的Tau蛋白異型6d是否以蛋白質(zhì)的形式存在，需要進(jìn)一步研究。從其mRNA結(jié)構(gòu)看，Tau蛋白異型6d是利用Tau基因6號外顯子內(nèi)選擇性剪接位點(diǎn)6d而產(chǎn)生，這一剪接造成后面序列的移碼突變而很快遇到終止密碼，3‘端帶有很長的非翻譯區(qū)(見圖1)。目前3‘端的非翻譯區(qū)是公認(rèn)的導(dǎo)致mRNA不穩(wěn)定的重要因素[3，4]。因此，蛋白異型6d是否以蛋白質(zhì)的形式存在不能直接從上述公開的文獻(xiàn)中直接得出結(jié)論。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對Tau蛋白異型6d的確認(rèn)，進(jìn)一步獲得其特異性的多肽抗原以及抗體，并用于對Tau蛋白的檢測。
本發(fā)明提供的特異性多肽抗原具有SEQ ID No.1的氨基酸序列。
本申請人通過對Tau蛋白異型6d氨基酸序列的分析，確定了特異性的多肽片段。
用上述得到的特異性多肽抗原經(jīng)傳統(tǒng)的免疫方法，可獲得多克隆抗體。
用傳統(tǒng)的方法也可以獲得上述多肽抗原的單克隆抗體。
用上述獲得的多克隆抗體檢測和鑒定Tau蛋白異型6d。結(jié)果顯示A.新的Tau蛋白異型6d確實(shí)以蛋白質(zhì)的形式存在著(圖4，5)；B.所制備的6d抗體為高度特異的抗體(圖4，5)[11]。
從圖5中B、C、D的檢測結(jié)果可以看出，本發(fā)明制備的抗體僅對Tau蛋白異型6d產(chǎn)生免疫反應(yīng)；而其他現(xiàn)有的抗體不具備這樣的特性。
海馬與人和動物的記憶、智力、情感等密切相關(guān)。在老年性癡呆病人，海馬是最先受累和病變最重的部位，而在正常成年人和動物腦，其海馬區(qū)的齒狀回是神經(jīng)干細(xì)胞集中區(qū)，認(rèn)為這些神經(jīng)干細(xì)胞與腦的正常功能的維持密切相關(guān)。為了解新的Tau蛋白異型6d在正常人海馬中的表達(dá)和分布，用抗-6d抗體經(jīng)免疫組化法對正常人海馬區(qū)進(jìn)行免疫染色，發(fā)現(xiàn)新的Tau蛋白異型6d陽性細(xì)胞主要集中在齒狀回和CA1-CA3區(qū)，并與神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白MAP2共定位，見圖7。
因此，本發(fā)明提供的抗體可以制備成試劑盒，用于檢測和診斷老年性癡呆致病。


圖1.Tau基因6號外顯子的選擇性剪接異型閱讀框架結(jié)構(gòu)圖。上為Tau/6+剪接異型(Tau/6+)的cDNA和氨基酸序列。中Tau/6p剪接異型(Tau/6p)的cDNA和氨基酸序列。下Tau/6d剪接異型(Tau/6d)的cDNA和氨基酸序列。上圖部分的箭頭標(biāo)志著6p和6d兩個選擇性的剪接位點(diǎn)，StuI、Tau/6p和Tau/6d的終止子(TAA，tga)用下畫線標(biāo)識，*表示3’-端的非翻譯區(qū)，側(cè)翼序列為小寫體。
圖2所合成的特異性多肽的色譜結(jié)果；圖3所合成的特異性多肽的質(zhì)譜結(jié)果；圖4純化以后的抗體；圖5用所獲得的抗-6d多克隆抗體經(jīng)Western Blotting檢測體外表達(dá)的FLAG-Tau/6d。
(A)所構(gòu)建的FLAG-融合的Tau蛋白異型表達(dá)載體結(jié)構(gòu)簡圖。
(B-D)Western Blotting檢測在SY5Y細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的FLAG-融合的Tau蛋白異型。FAT/6-和FFT/6-轉(zhuǎn)染的SY5Y細(xì)胞裂解物各30μg，F(xiàn)AT/6d和FFT/6d轉(zhuǎn)染的SY5Y細(xì)胞裂解物各50μg經(jīng)10％SDS-PAGE分離，右側(cè)為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；(B)用anti-FLAG(M2)單克隆抗體檢測所表達(dá)的Tau蛋白異型.；(C)將(B)的膜洗脫后再用anti-6d的多克隆抗體檢測所表達(dá)的Tau蛋白異型；(D)用5A6單克隆抗體檢測所表達(dá)的Tau蛋白異型，結(jié)果與(B)一致。(E)FAT/6d和FFT/6d經(jīng)脫磷酸化后分子量降到預(yù)計(jì)值；圖6人腦組織中內(nèi)源性Tau蛋白異型6d的時(shí)空分布。所用抗體標(biāo)于左側(cè)，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)列于右側(cè)。(A-C)用5A6單克隆抗體經(jīng)WesternBlotting檢測100μg各樣本中的內(nèi)源性Tau蛋白異型，(A)49kD以上的傳統(tǒng)Tau，(B)36KD以下的Tau蛋白異型6d。(C)將(A)和(B)的膜洗脫后，再用anti-6d的多克隆抗體檢測，僅檢測到25-36Kd范圍的信號，與(B)相似。(D-F)進(jìn)行定量圖7內(nèi)源性Tau蛋白異型6d在成人海馬中的分布，與MAP2的共定位。
(A-D)Tau蛋白異型6d分布，一抗為6d多克隆抗體，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG；(A-D)的標(biāo)尺為500μm。(E-G)Tau蛋白異型6d與MAP2在海馬中的共定位情況。(E)Tau蛋白異型6d的分布，抗體與圖4(A-D)同；(F)MAP2在海馬中的分布，一抗為MAP2單克隆抗體，二抗為Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG；(G)為4E和4F疊加后的圖象。
具體實(shí)施例實(shí)施例1多肽抗原的制備本發(fā)明提供的多肽抗原具有SEQ ID No.1所述的氨基酸序列，即FWSKGDETQGG?？梢酝ㄟ^商業(yè)公司合成。本申請中該多肽抗原由Zymed公司合成、純化，凍干，結(jié)果見圖2、3。
實(shí)施例2Tau蛋白異型6d的特異性多克隆抗體(6d)的制備上述得到的抗原與KLH偶聯(lián)[5]后，免疫動物(兔)[6，7]制備抗血清，純化抗血清獲得6d抗體[8，9]，純化的6d抗體用10％SDS-PAGE分離后經(jīng)Coomassi染色檢測(圖4)[10]。
(1)免疫動物(兔)[6，7]制備抗血清在1ml多肽抗原溶液(1mg/ml，溶于PBS)中加等量弗氏完全佐劑，用雙管微型乳化針(Thomas Scientific 345OD46)進(jìn)行乳化。刮除兔背部毛，70％酒精消毒。用3ml注射器(24-G)針頭以與皮膚呈30°角進(jìn)行皮內(nèi)注射，分24個點(diǎn)進(jìn)行注射，各注射點(diǎn)注射25μl，共免疫3只兔。6周后分別于兔的兩后腿大腿肌肉內(nèi)注射0.5ml新鮮配制的抗原-弗氏完全佐劑乳化液進(jìn)行加強(qiáng)免疫，同上隔2周加強(qiáng)免疫1次，于加強(qiáng)免疫后10天采血經(jīng)ELISA檢測抗體產(chǎn)生水平，加強(qiáng)免疫3次，心臟采血，凝集后收集血清。
(2)純化抗血清獲得6d抗體[8，9]A.飽和硫酸銨法沉淀IgG于4C°用滴管緩慢向血清中加1/2體積的飽和硫酸銨，持續(xù)攪拌4h，12,000Xg離心20min沉淀IgG將沉淀物重懸于33％的飽和硫酸銨至原血清體積，離心洗滌。重洗1次。將沉淀物于4C°緩慢振動溶于PBS至原血清體積的10％，4C°透析48h，換透析緩沖液3次，移去所有的硫酸銨。
B.用抗原-Sepharose經(jīng)免疫親和層析進(jìn)行純化1)制備抗原-Sepharose柱用1mM HCl膨化CNBr-Sepharose 4B，相繼以1mM HCl 300ml和偶聯(lián)緩沖液(pH8.3，0.125M Na2HPO4)300ml洗滌膨化的CNBr-Sepharose 4B，加入合成的6d多肽抗原至終濃度為2mg/ml，4C°振動過夜，250Xg離心10min，加入偶聯(lián)緩沖液，250Xg離心10min。與1M乙醇胺(pH8.0)在4C°孵育5h，250Xg離心10min，以PBS離心洗滌后，裝柱并用PBS平衡。
2)加樣將樣品1-5ml/min加至抗原-Sepharose柱，用30ml PBS洗脫未結(jié)合的成分。
3)洗脫結(jié)合的成分用pH2.3的鹽酸-甘氨酸緩沖液(2-3倍柱體積)進(jìn)行洗脫。
4)收集洗脫液，用離心過濾裝置濃縮獲得的抗體。
實(shí)施例36d抗體用于檢測和鑒定Tau蛋白異型6d是否以蛋白質(zhì)的形式存在用6d為一抗，經(jīng)Western Blotting，檢測不同部位的腦組織中內(nèi)源性Tau蛋白異型6d的表達(dá)水平和時(shí)空分布；同時(shí)克隆Tau蛋白異型6d基因并導(dǎo)入COS細(xì)胞等進(jìn)行體外表達(dá)，經(jīng)Western Blotting對外源性Tau蛋白異型6d進(jìn)行檢測鑒定，結(jié)果顯示A.新的Tau蛋白異型6d確實(shí)以蛋白質(zhì)的形式存在著(圖5，6)；B.所制備的6d抗體為高度特異的抗體(圖5，6)[11]。
實(shí)施例4經(jīng)免疫組化法對Tau蛋白異型6d在腦組織和脊髓中定位研究凍存的脊髓、新鮮前海馬和海馬組織(Harvard Brain Tissue ResourceCenter in Boston和Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders inBaltimore)按Jones的方法[12]進(jìn)行防凍處理將盛有固定液(用PBS配制的6％多聚甲醛，20％蔗糖，20％乙醇，20％乙烯二醇，10％甘油)的容器浸入另一裝有100％乙醇而且四周圍著干冰的容器中迅速制冷，直到固定液開始變硬(約-60C°)。將組織塊放入固定液中，然后轉(zhuǎn)到-20C°，每8小時(shí)輕輕搖動一次，這樣維持7天，再轉(zhuǎn)至4C°并持續(xù)搖動，直到組織塊和固定液的溫度平衡到4C°。
防凍處理后的組織塊轉(zhuǎn)入用PBS配制的30％蔗糖液中，于4C°搖動24小時(shí)，期中12小時(shí)后更換蔗糖溶液一次。然后組織塊可凍存于-70C°或切成50μm厚的切片。切片以預(yù)冷的50mM PBS(pH7.4)洗3次，每次10分鐘；100mMPBS(pH7.4)洗2次，每次10分鐘；含1％BSA和0.3％Triton X-100的PBS封閉30分鐘；一抗于4C°染色過夜；以含0.02％Triton X-100的PBS洗4次，每次15分鐘；二抗室溫染色2小時(shí)，以PBS洗4次，每次15分鐘；將切片鋪于載玻片上，干后封片并于熒光顯微鏡下觀察。
所用抗體一抗有抗-6d的多克隆抗體，1∶200稀釋；Tau5單克隆抗體，1∶500稀釋；MAP2單克隆抗體(Zymed)1∶200稀釋。二抗有FITC-羊抗兔IgG(Zymed)，1∶500稀釋；Cy3-羊抗鼠IgG(Zymed)，1∶1,000稀釋。(圖7)實(shí)施例5用本發(fā)明提供的抗體檢測人脊液中Tau蛋白異型6d的ELISA檢測結(jié)果(見表1)。結(jié)果顯示，用本發(fā)明提供的抗體對Tau蛋白的檢測具有特異性。
表1


表中上半部為對病人組的檢測結(jié)果，下半部為對照組。其中，20例病人組中只有A3和C8呈陰性，其余18個為陽性。
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7.Current Protocols of Immunology，Chapter 11.12--Preparation of polyclpnal antisera.
8.Current Protocols of Immunology，Chapter 10.11--Immunoaffinity chromatography9.Current Protocols of Immunology，Chapter 10.13--Purification if IgG fraction fromantiserum，ascites fluid，or hybridoma supernatent10.Current Protocols of Immunology，(HPLC)
權(quán)利要求
1.一種多肽，具有SEQ ID No.1氨基酸序列。
2.一種抗權(quán)利要求1所述多肽的抗體。
3.一種試劑盒，含有權(quán)利要求2所述的抗體。
4.一種檢測腦脊液中Tau蛋白6d的方法，其特征在于用抗權(quán)利要求1所述的多肽的抗體進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及Tau蛋白相關(guān)的多肽抗原及抗體。本發(fā)明提供的特異性多肽抗原具有SEQ ID No.1的氨基酸序列。用現(xiàn)有的方法可以獲得多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明提供的抗體可以制備成試劑盒，用于檢測和診斷老年性癡呆致病。
文檔編號C07K16/18GK1721437SQ20041004503
公開日2006年1月18日 申請日期2004年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月13日
發(fā)明者羅敏華 申請人:中南大學(xué)