氟化鈣組合物的制作方法
【專利摘要】提供了包含氟化鈣復(fù)合材料的組合物，所述氟化鈣復(fù)合材料包含Ca、F和有機(jī)分子，還提供了使用它們的方法。
【專利說(shuō)明】
氟化鈣組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本公開(kāi)內(nèi)容涉及用于穩(wěn)定化疫苗抗原和用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的復(fù)合材料，所述免疫 應(yīng)答針對(duì)與所述復(fù)合材料一起使用的抗原。
【背景技術(shù)】
[0002] 亞單位疫苗（例如重組蛋白/多肽抗原）僅僅是弱免疫原性的，且因而需要安全且 有效的佐劑。各種佐劑是已知的，包括包含金屬鹽(諸如明礬、磷酸鋁和磷酸鈣）的那些。參 見(jiàn)，例如，Lindblad (2004) Vaccine 22:3658-3668; Jiang等人（2004) Vaccine 23:693-698 〇
[0003] 由于實(shí)用和后勤原因，疫苗的熱穩(wěn)定性是期望的，這是因?yàn)橐呙绲臒岱€(wěn)定性減小 或避免在全世界分銷過(guò)程中對(duì)低溫運(yùn)輸系統(tǒng)(cold-chain)的需要。經(jīng)常應(yīng)用冷凍干燥技術(shù) 來(lái)穩(wěn)定抗原。但是，冷凍干燥不總是可能或有效。此外，繞過(guò)昂貴的且耗時(shí)的冷凍干燥生產(chǎn) 步驟可以增加疫苗向世界上更大數(shù)目的人的可達(dá)性。
[0004] 發(fā)明概述 在一個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容提供了包含Ca、F和Z的氟化鈣復(fù)合材料，其中Z是有機(jī)分子。提 供了它們的生產(chǎn)方法。還提供了使用它們作為佐劑的方法，也提供了使用它們穩(wěn)定抗原免 于溫度效應(yīng)的方法。這樣的方法包括使用一些沒(méi)有經(jīng)過(guò)冷凍干燥的復(fù)合材料。
[0005] 在另一個(gè)方面，提供了包含氟化鈣復(fù)合材料的氟化鈣組合物，所述復(fù)合材料包含 Ca、F和Z，其中Z是有機(jī)分子。
[0006] 在另一個(gè)方面，提供了通過(guò)溶膠凝膠沉淀制備氟化鈣復(fù)合材料的方法，所述方法 包括下述步驟:在沉淀?xiàng)l件下組合CaCl2、NaF和NaZ，和收集不溶于水的氟化鈣復(fù)合材料。在 另一個(gè)方面，提供了通過(guò)所述方法制備的產(chǎn)品。
[0007] 在另一個(gè)方面，提供了佐劑組合物，其包含在上述方面中公開(kāi)的氟化鈣組合物。
[0008] 在另一個(gè)方面，提供了制備在上述方面中公開(kāi)的佐劑組合物的方法。
[0009] 在另一個(gè)方面，提供了免疫原性組合物，其包含抗原和如在上述方面中公開(kāi)的佐 劑組合物。
[0010] 在另一個(gè)方面，提供了制備在上述方面中公開(kāi)的免疫原性組合物的方法。
[0011] 附圖簡(jiǎn)述 圖1:用HepB得到的動(dòng)物結(jié)果:抗體測(cè)量(抗-HBs 14pII)。當(dāng)將抗原吸附在本文描述的 CaF2家族的不同載體上時(shí)，維持抗原的應(yīng)答。
[0012] 圖2:批次8833107相比于8833111的紅外光譜圖。紅外分析顯示球霰石(Vaterite) 型CaC03的存在。
[0013] 圖3:Ca/F/0H復(fù)合材料的水可溶性，揭示所述復(fù)合材料的可溶性比在手冊(cè)中報(bào)道 的CaF2的可溶性更高。
[0014] 圖4:在t=0通過(guò)SDS-PAGE分析來(lái)分析的F4T制劑。泳道：1，分子量標(biāo)準(zhǔn)品；2,樣品緩 沖液;3，CaF2/C0 3 + 脂質(zhì)體;4，F(xiàn)4T + CaF2;5，F(xiàn)4T + CaF2+ 脂質(zhì)體;6，F(xiàn)4T + CaF〗/半胱氨 酸;7，F(xiàn)4T + CaF2/半胱氨酸 + 脂質(zhì)體;8，F(xiàn)4T + CaF2/C03;9，F(xiàn)4T + CaF2/C03 + 脂質(zhì)體；10， F4T。參見(jiàn)實(shí)施例3B。
[0015] 圖5:在4°C1個(gè)月以后通過(guò)SDS-PAGE分析的F4T制劑。泳道：1，分子量標(biāo)準(zhǔn)品；2，F(xiàn)4T 主體(bulk):在-80 °C儲(chǔ)存1個(gè)月并恰好在儲(chǔ)存之前融化的主體;3,在4°C儲(chǔ)存1個(gè)月的F4T主 體;4,在沒(méi)有無(wú)機(jī)物存在下配制并在4°C儲(chǔ)存1個(gè)月的F4T;5，F(xiàn)4T + CaF2;6，F(xiàn)4T + CaF2 + 脂質(zhì)體；7，F(xiàn)4T + CaF2/半胱氨酸；8，F(xiàn)4T + CaF2/半胱氨酸+脂質(zhì)體;9，F(xiàn)4T + CaF2/C03; 10，F(xiàn)4T + CaF2/C03 +脂質(zhì)體。參見(jiàn)實(shí)施例3B。
[0016] 圖6 :在30 °C 1個(gè)月以后通過(guò)SDS-PAGE分析的F4T制劑。泳道：1，分子量標(biāo)準(zhǔn)品；2， F4T主體:在-80°C儲(chǔ)存1個(gè)月并恰好在儲(chǔ)存前融化的主體;3，在30 °C儲(chǔ)存1個(gè)月的F4T主體； 4,在沒(méi)有無(wú)機(jī)物存在下配制并在30°C儲(chǔ)存1個(gè)月的F4T;5，F(xiàn)4T + CaF2;6，F(xiàn)4T + CaF2+脂 質(zhì)體；7，F(xiàn)4T + CaF2/半胱氨酸；8，F(xiàn)4T + CaF2/半胱氨酸 + 脂質(zhì)體;9，F(xiàn)4T + CaF2/C03;10， F4T + CaF2/C03 +脂質(zhì)體。注意到泳道3和4 (不含復(fù)合材料的F4T)的顯著降解。參見(jiàn)實(shí)施 例3B。
[0017]圖7:復(fù)合材料+ ClfAN123免疫原性(抗體）。當(dāng)將抗原吸附到不同的載體上時(shí)，維持 抗原的免疫原性。用穩(wěn)定化的ClfAN123復(fù)合材料(吸附在無(wú)機(jī)載體上)免疫小鼠。通過(guò)ELISA-ClfA N123復(fù)合材料進(jìn)行這些吸附的復(fù)合材料在乳劑制劑中的免疫原性(在Post III上的濃 度(yg/mL))。從左至右，未處理，吸附在CaF2/CaC03上，吸附在CaF 2/N-乙酰半胱氨酸上，吸附 在CaF2上，和吸附在CaF2/半胱氨酸上。參見(jiàn)實(shí)施例4。
[0018] 圖8:批次8833152-7的紅外光譜圖。
[0019]圖9: HepB吸附的抗原的免疫應(yīng)答。參見(jiàn)實(shí)施例5。
[0020]圖10:本文公開(kāi)的氟化鈣復(fù)合材料的電子顯微鏡照片。拍攝在批號(hào)10616125中公 開(kāi)的氟化鈣復(fù)合材料的照片(參見(jiàn)表1和標(biāo)題為"Ca/F/N-乙酰半胱氨酸批號(hào)10616125。"的 實(shí)施例）。
[0021]圖11:用吸附在不同復(fù)合材料上的兩種不同劑量的rF抗原的第二次免疫接種14天 以后血清中的RSV中和滴度。參見(jiàn)實(shí)施例6。
[0022]圖12:用吸附在不同復(fù)合材料上的兩種不同劑量的rF抗原的第二次免疫接種14天 以后血清中的抗-rF IgG濃度。參見(jiàn)實(shí)施例6。
[0023]圖13:根據(jù)由2yg rF和佐劑組成的各種方式，RSV攻擊4天以后肺中的RSV滴度。參 見(jiàn)實(shí)施例7。
[0024]圖14:復(fù)合材料-19F-DT制劑在Balb/c小鼠免疫原性模型中的評(píng)價(jià)。參見(jiàn)實(shí)施例8。 [0025]圖15:復(fù)合材料-19F-DT制劑在Balb/c小鼠免疫原性模型中的評(píng)價(jià)(續(xù)）。參見(jiàn)實(shí)施 例8〇
[0026]圖16:復(fù)合材料-19F-DT制劑在Balb/c小鼠免疫原性模型中的評(píng)價(jià)(續(xù)）。參見(jiàn)實(shí)施 例8〇
[0027]圖17:復(fù)合材料-19F-DT制劑在Balb/c小鼠免疫原性模型中的評(píng)價(jià)(續(xù)）。參見(jiàn)實(shí)施 例8〇
[0028] 圖18:各種復(fù)合材料-PRN的動(dòng)物結(jié)果。參見(jiàn)實(shí)施例9。
[0029] 詳細(xì)描述 本文中公開(kāi)了抗原對(duì)不溶于水的氟化鈣復(fù)合材料的吸附穩(wěn)定抗原免于溫度依賴性的 降解。此外，公開(kāi)了氟化鈣復(fù)合材料通過(guò)增加針對(duì)吸附在其上面的抗原的免疫應(yīng)答而作為 佐劑起作用。
[0030] 組合物 在一些方面，提供了包含氟化鈣復(fù)合材料的氟化鈣組合物，所述復(fù)合材料包含Ca、F和 ZZ'Z"是指有機(jī)(含碳的）分子。"復(fù)合材料"是指當(dāng)干燥時(shí)作為固體存在且不溶于或難溶于 純水的材料。
[0031 ]在一些方面，所述復(fù)合材料包含相等百分比(w/w)的Ca和F。在一些方面，所述復(fù)合 材料包含比F百分比(w/w)更大的Ca百分比(w/w)。"X百分比(w/w)"（其中X是在組合物中發(fā) 現(xiàn)的分子或元素)是指可歸因于X的組合物的總重量的百分比。因而，在本發(fā)明的上下文中， w/w是指干重。對(duì)于其中已知相對(duì)比率的組合物，可以在數(shù)學(xué)上確定百分比（w/w)。例如， CaF2的組合物包含大致51%Ca和大致49%F (w.w):%w/w Ca = [(40g/mol Ca * 100)]/ [40g/mol Ca + (2 * 19g/mol F)] = 51;%w/w F = [(2 * 19g/mol F) * 100]/[40g/mol Ca + (2 * 19g/mol F)] = 49。盡管如此，也可以通過(guò)經(jīng)驗(yàn)方法確定。/^/\￥。例如，在目標(biāo)分 子是酸或堿的情況下，通過(guò)滴定可以確定該分子的百分比(w/w)(在Z是碳酸鹽的情況下，通 過(guò)用HC1滴定可以確定百分比(w/w)/碳酸鹽）?？商鎿Q地，在分子含有部分重量百分比的氮 的情況下，通過(guò)元素分析方法可以確定該分子的百分比(w/w)，在所述元素分析方法中，確 定氮的量，然后使用含氮分子的分子量計(jì)算可歸因于含氮分子的總重量。用于該方法的儀 器可商業(yè)得到，例如得自Antek?, 300 Bammel Westfield Road, Houston, Texas 77090〇 可替換地，通過(guò)氧化-還原滴定方法，可以確定可氧化的有機(jī)分子的百分比(w/w )，例如在高 錳酸鉀存在下在硫酸存在下。
[0032]在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣復(fù)合材料可以如下表示： CaF(2-x)Z(x)/Z(y) 式 I 其中x是0-2(包括端點(diǎn)）的非負(fù)數(shù)字，且y是非負(fù)數(shù)字。在一些方面，y是0_2(包括端點(diǎn)） 的非負(fù)數(shù)字。在一些方面，x和y-起的總和是等于或小于2的非負(fù)數(shù)字。在一些方面，x和y不 都為0。但是，如在已知它們的組成時(shí)將會(huì)理解的，如本文中所述的氟化鈣復(fù)合材料可以不 是均勻的，而是可能包含其中Z與剩余組分主要通過(guò)離子或共價(jià)相互作用而相互作用的區(qū) 域和其中Z與剩余組分通過(guò)弱力而相互作用的區(qū)域（由"/Z"表示）。在該背景下，Z W代表Z的 離子化形式，且Z(y)代表Z的未離子化形式，諸如HZ或AZ或其混合物，其中A是抗衡離子。這樣 的不均勻的復(fù)合材料可以如下表示： CaF(2-x)Z(x)/HZ(y) 式 II 或者 CaF(2-x)Z(x)/AZ(y) 式 III 其中x和y都不為0。
[0033]如本文公開(kāi)的氟化鈣復(fù)合材料將具有在干燥時(shí)形成固體的特征，將不溶于或難溶 于純水，且表現(xiàn)出在5.0-11.0(包括端點(diǎn)）范圍內(nèi)的E. C. P.。
[0034]在一些方面，Z包含當(dāng)離子化時(shí)形成陰離子的官能團(tuán)。這樣的官能團(tuán)包括但不限于 一個(gè)或多個(gè)選自以下的官能團(tuán):羥基、羥基化物、配位輕離子(hydroxo)、氧代、N-羥基化物、 氧肟酸鹽(hydr 〇aXamate)、N-氧化物、碳酸氫鹽、碳酸鹽、羧酸鹽、脂肪酸、硫醇鹽、有機(jī)磷酸 鹽、磷酸二氫鹽(dihydrogenophosphate)、磷酸氫鹽(monohydrogenophosphate)、磷酸的單 酯、磷酸的二酯、磷脂的酯、硫代磷酸酯、硫酸鹽、硫酸氫鹽、烯醇化物、抗壞血酸鹽、含磷抗 壞血酸鹽(口110 8。11038(301^3七6)、酸鹽和亞胺-醇鹽（；[111；[116-013七68)。在一些方面，本文中的 氟化鈣復(fù)合材料包含Z，其中Z是對(duì)鈣具有親合力且與鈣和氟化物形成不溶于水的復(fù)合材料 的陰尚子有機(jī)分子。
[0035]在一些方面，本文中的氟化鈣復(fù)合材料包含Z，其中Z可以歸類為包含選自以下的 化學(xué)種類的成員：羥基、羥基化物、配位羥離子、氧代、N-羥基化物、氧肟酸鹽、N-氧化物、碳 酸氫鹽、碳酸鹽、羧酸鹽和二羧酸鹽、羧酸的鹽、QS21的鹽、皂皮樹(shù)(Quillaja saponaria)樹(shù) 皮的提取物、免疫活性皂苷的提取物、飽和或不飽和脂肪酸的鹽、油酸的鹽、氨基酸的鹽、硫 醇鹽、硫羥乳酸鹽、硫醇-化合物的鹽、半胱氨酸的鹽、N-乙酰半胱氨酸的鹽、L-2-氧代-4-噻 唑烷羧酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽、磷酸氫鹽、磷酸的鹽、磷酸的單酯和它們的鹽、磷酸的二 酯和它們的鹽、3-0-脫?；?4'-單磷?；|(zhì)A的酯、3D-MLA的酯、MPL、磷脂的酯、D0PC、二 油?；字苌?、來(lái)自CPG基序的磷酸鹽、來(lái)自CpG家族的硫代磷酸酯、硫酸鹽、硫酸氫鹽、 硫酸的鹽、烯醇化物、抗壞血酸鹽、含磷抗壞血酸鹽、酚鹽、生育酚、亞胺_醇鹽、胞嘧啶、甲 基-胞嘧啶、尿嘧啶(uracy 1)、胸腺嘧啶、巴比妥酸、次黃嘌呤、肌苷、鳥(niǎo)嘌呤、鳥(niǎo)苷、8-氧代-腺嘌呤、黃嘌呤、尿酸、蝶酸、蝶酰谷氨酸、葉酸、核黃素和光黃素。
[0036]在一些方面，本文中的氟化鈣復(fù)合材料包含Z，其中Z選自：N-乙酰半胱氨酸;硫羥 乳酸鹽;己二酸鹽;碳酸鹽;葉酸;谷胱甘肽;和尿酸。在一些方面，本文中的氟化鈣復(fù)合材料 包含Z，其中Z選自：N-乙酰半胱氨酸;己二酸鹽;碳酸鹽;和葉酸。
[0037]在一些方面，本文中的氟化鈣復(fù)合材料包含Z，其中Z是N-乙酰半胱氨酸，且所述復(fù) 合材料包含5 l%Ca、48%F、不超過(guò)1%N-乙酰半胱氨酸(w/w)至37%Ca、26%F和37%N-乙酰半胱氨 酸(w/w)〇
[0038]在一些方面，本文中的氟化鈣復(fù)合材料包含Z，其中Z是硫羥乳酸鹽，且所述復(fù)合材 料包含51%Ca、48%F、不超過(guò)1%硫羥乳酸鹽(w/w)至42%Ca、30%F、28%硫羥乳酸鹽(w/w)。
[0039]在一些方面，本文中的氟化鈣復(fù)合材料包含Z，其中Z是己二酸鹽，且所述復(fù)合材料 包含51%Ca、48%F、不超過(guò) 1%己二酸鹽(w/w)至38%Ca、27%F、35%己二酸鹽(w/w)。
[0040]在一些方面，本文中的氟化鈣復(fù)合材料包含Z，其中Z是Z是碳酸鹽，且所述復(fù)合材 料包含51 %Ca、48%F、不超過(guò)1 %碳酸鹽(w/w)至48%Ca、34%F、18%碳酸鹽(w/w)。
[0041 ]在一些方面，本文中的氟化鈣復(fù)合材料包含Z，其中Z是葉酸，且所述復(fù)合材料包含 51 %Ca、48%F、不超過(guò) 1 %葉酸(w/w)至 2 2%Ca、16%F、6 2%葉酸(w/w)。
[0042 ]在一些方面，本文中的氟化鈣復(fù)合材料包含Z，其中Z是谷胱甘肽，且所述復(fù)合材料 包含51%Ca、48%F、不超過(guò)1%谷胱甘肽(w/w)至28%Ca、20%F、52%谷胱甘肽(w/w)。
[0043] 在一些方面，本文中的氟化鈣復(fù)合材料包含Z，其中Z是尿酸，且所述復(fù)合材料包含 51%Ca、48%F和不超過(guò) 1%尿酸(w/w)至36%Ca、26%F和38%尿酸(w/w)。
[0044] 在一些方面，包含Ca、F和Z的氟化鈣復(fù)合材料具有以下組成（圖表1):




[0045] 在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣組合物是藥物上可接受的。
[0046] 在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣復(fù)合材料呈顆粒形式。在一些方面，所述復(fù)合材料 顆粒是在納米顆粒(nanoparticle)或微米顆粒(microparticle)尺寸范圍內(nèi)。
[0047] "納米顆粒"是指在1 nm - 999 nm(包括端點(diǎn)）的范圍內(nèi)的顆粒。在該定義內(nèi)包括 在以下范圍內(nèi)的顆粒：（A) 50nm至100nm(包括端點(diǎn)）；45nm至llOnm(包括端點(diǎn)）；40nm至 120nm(包括端點(diǎn)）；35nm至130nm(包括端點(diǎn)）；30nm至140nm(包括端點(diǎn)）；25nm至150nm(包括 端點(diǎn)）；20nm至160nm(包括端點(diǎn)）；15nm至170nm(包括端點(diǎn)）；1 Onm至180nm(包括端點(diǎn)）；（B)不 小于lOnm、不小于15nm、不小于20nm、不小于25nm; (C)不超過(guò)150nm、不超過(guò)200nm、不超過(guò) 2 5 Onm、不超過(guò)3 OOnm、不超過(guò)3 50nm、不超過(guò)40 Onm、不超過(guò)45 Onm、不超過(guò)5 OOnm、不超過(guò) 5 5 Onm、不超過(guò)6 OOnm、不超過(guò)6 50nm、不超過(guò)70 Onm、不超過(guò)7 5 Onm、不超過(guò)8 OOnm、不超過(guò) 850nm;或（D)大致約25 nm。
[0048] "微米顆粒"是指在lym - 999ym(包括端點(diǎn)）的范圍內(nèi)的顆粒。在該定義內(nèi)包括在 不超過(guò)50ym、不超過(guò)lOOym、不超過(guò)150ym、不超過(guò)200ym、不超過(guò)250ym、不超過(guò)300ym、不超過(guò) 350ym、不超過(guò)400ym、不超過(guò)450ym、不超過(guò)500ym、不超過(guò)550ym、不超過(guò)600ym、不超過(guò)650y m、不超過(guò)700ym、不超過(guò)750ym、不超過(guò)800ym、不超過(guò)850ym、不超過(guò)900ym、不超過(guò)950ym的范 圍內(nèi)的顆粒。
[0049] 在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣組合物包含超過(guò)一種復(fù)合材料，其中每種復(fù)合材 料包含如在上述段落中公開(kāi)的Ca、F和Z，且其中每種復(fù)合材料彼此的差別在于Ca、F或Z的百 分比(w/w)或在于Z的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0050] 在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣組合物包含抗原，其中所述抗原吸附至氟化鈣復(fù) 合材料。
[0051] "抗原"是指能夠在人或動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答的蛋白、多糖、肽、核酸、蛋白-多糖綴 合物、分子或半抗原。抗原可以是衍生的、同源的或合成的以模仿來(lái)自病毒、細(xì)菌、寄生物、 原生動(dòng)物或真菌的分子。在本發(fā)明的一個(gè)替代實(shí)施方案中，抗原是衍生的、同源的或合成的 以模仿來(lái)自腫瘤細(xì)胞或瘤形成的分子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是衍生的、同源 的或合成的以模仿來(lái)自在變態(tài)反應(yīng)、阿爾茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖和煙堿依賴中涉 及的物質(zhì)的分子。
[0052] Lindemann (1985) Scandinavian Journal of Dental Research, 93:381-83描 述了清蛋白、硫酸軟骨素和糖蛋白在氟化f丐(Ca F2)上的吸附。Cheung等人(2007) Journal of applied Microbiology 102:701-710)報(bào)道了微生物在CaF2上的吸附。最近，Zhang等人 (2010) Chem. Eur. J. 16:5672-5680描述了布洛芬在單分散CaF2中空納米球(nanosphere) 上的 吸附。 通過(guò)在適當(dāng)?shù)?緩沖液 中將抗原混合至納米或微米顆粒形式的無(wú)機(jī)材料 的水懸浮液中，進(jìn)行抗原在無(wú)機(jī)材料上的吸附。根據(jù)關(guān)于所述抗原已知的或確定的條件，選 擇時(shí)間、溫度、PH、鹽和賦形劑的存在的最優(yōu)化。取決于抗原的性質(zhì)和化學(xué)組成，可能發(fā)生下 述相互作用吸附模式中的至少一種:通過(guò)配體交換、通過(guò)靜電力或通過(guò)疏水力實(shí)現(xiàn)的吸附。 基于個(gè)例來(lái)最優(yōu)化抗原/無(wú)機(jī)物比率。通過(guò)使用較小尺寸的顆粒，可以增加可利用的無(wú)機(jī)物 表面。
[0053]在一些方面，在溫和攪拌下在室溫歷時(shí)2小時(shí)吸附抗原。在一些方面，制備氟化鈣 組合物的方法包括在形成氟化鈣復(fù)合材料的過(guò)程中將一種或多種抗原吸附至所述氟化鈣 復(fù)合材料的步驟。在一些方面，制備氟化鈣組合物的方法包括在形成氟化鈣復(fù)合材料以后 將一種或多種抗原吸附至所述氟化鈣復(fù)合材料的步驟。
[0054]對(duì)于各種有機(jī)化合物(Z)，在顆粒的表面處測(cè)量的電荷會(huì)變化(參見(jiàn)表2A)。該顆粒 性質(zhì)可以用于最優(yōu)化通過(guò)相互作用的靜電模式實(shí)現(xiàn)的抗原吸附。
[0055]在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣組合物用于穩(wěn)定化抗原。在該應(yīng)用的一些方面，將 抗原熱穩(wěn)定化。在該應(yīng)用的一些方面，將抗原吸附至所述氟化鈣復(fù)合材料。
[0056]在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣組合物用于醫(yī)學(xué)。在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣 組合物用于在哺乳動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答。在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣組合物用于在人 中引起免疫應(yīng)答。在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣組合物用于預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物免于 由病毒、細(xì)菌或寄生物造成的疾病。在一些方面，本文公開(kāi)的氟化鈣組合物用于預(yù)防和/或 治療人免于由病毒、細(xì)菌或寄生物造成的疾病。對(duì)于這樣的應(yīng)用，通過(guò)施用給有此需要的受 試者，可以遞送本文公開(kāi)的組合物。施用可以是通過(guò)許多途徑，包括肌內(nèi)地、皮下地、皮內(nèi) 地、舌下地、向扁桃體或鼻內(nèi)地遞送。
[0057] 從固體顆粒制備組合物的方法 CaF2可商業(yè)得到(Riedel de Hagn?)。用在本文公開(kāi)的組合物中的純CaF2可以通過(guò)下 述方案從固體CaF2制備。
[0058] 方案 1: 1. 將CaF2固體顆粒放在容器中。 2. 加入水。 3. 混合CaF2 +水。 4. 將混合物靜置。 5. 將直到或超過(guò)y2的上清液除去并用水替換。 6. 重復(fù)步驟3 - 5。 7?濃縮CaF2固體(通過(guò)，例如，離心）。
[0059] 用在本文公開(kāi)的組合物中的復(fù)合材料可以通過(guò)下述方案制備。起始組分可商業(yè)得 到。
[0060] 方案 2: 1. 制備包含選擇的化合物Z的溶液。 2. 加入CaF2固體顆粒。 3. 混合CaF2固體顆粒+包含Z的溶液。 4. 將混合物靜置。 5. 將直到或超過(guò)y2的上清液除去并用水替換。 8.重復(fù)步驟3 - 5。 6. 濃縮得到的固體(通過(guò)，例如，離心）。
[00611 從水溶液制備組合物的方法 已知在溶液中從起始組分合成CaF2的方法。例如，Sun等人(2008) Dental materials 24:111-116報(bào)道了通過(guò)噴霧干燥下述制備納米尺寸氟化鈣，但是該方法具有使用氫氧化鈣 溶液的缺點(diǎn)，所述氫氧化鈣溶液容易從空氣吸附C0 2,從而產(chǎn)生不希望的碳酸鈣污染。參見(jiàn) Kalinkin (2005) Inorganic Materials 41:1073-1079。根據(jù)Feldmann等人（2006) Small 2:1248-1250,也可以制備納米級(jí)氟化鈣，但是該方法具有使用硝酸鹽的缺點(diǎn)，所述硝酸鹽 即使在痕量水平濃度對(duì)于人注射用制劑也是有問(wèn)題的。通過(guò)溶膠凝膠沉淀方法，可以合成 CaF20
[0062]在Nandiyanto等人（2011) "Liquid-phase Synthesis of CaF2 Particles and Their Low Refractive Index Characterization'，KONA Powder and Particle Journal 29:141-155中，描述了溶膠凝膠沉淀方法。Nandiyanto顯示，某些參數(shù)影響在溶膠凝膠方法 下的顆粒形成。例如，為了影響顆粒生長(zhǎng)步驟，可以調(diào)節(jié)計(jì)時(shí)和溫度。
【申請(qǐng)人】通過(guò)包括如在 下述步驟中一般地描述的和在實(shí)施例中詳細(xì)地描述的洗滌步驟而修改了所述溶膠凝膠方 法。在一些方面，洗滌步驟的包括是減小顆粒生長(zhǎng)步驟的另一種途徑。觀察到，在通過(guò)稀釋 進(jìn)行洗滌的過(guò)程中，原材料的濃度下降。還預(yù)見(jiàn)到，在洗滌過(guò)程中，將發(fā)生新形成的顆粒的 稀釋。根據(jù)如方案3所修改的反應(yīng)I，通過(guò)溶膠凝膠沉淀可以制備用在本文公開(kāi)的組合物中 的CaF 2。
[0063] CaCl2 + NaF-CaF ⑵ + NaCl 反應(yīng) I。
[0064] 方案 3: 1. 制備包含NaF的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。(NaF可商業(yè)得到.） 2. 制備包含CaCl2的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。（CaCl2可商業(yè)得到.） 3. 混合步驟1和2的溶液。 4. 將混合物靜置。 5. 將直到或超過(guò)y2的上清液除去并用水替換。 6. 將保留的液體混合，并將混合物靜置。 7. 重復(fù)步驟5 - 6。 8. 濃縮得到的固體(通過(guò)，例如，離心）。
[0065] 通過(guò)在反應(yīng)中包括Z，進(jìn)一步修改用在本公開(kāi)內(nèi)容中的溶膠凝膠方法。在一些方 面，提供了通過(guò)溶膠凝膠沉淀制備氟化鈣復(fù)合材料的方法，所述方法包括下述步驟:在沉淀 條件下組合CaCl 2、NaF和NaZ，和收集不溶于水的氟化鈣復(fù)合材料。在一些方面，所述方法包 括洗滌所述氟化鈣復(fù)合材料的步驟。在一些方面，提供了通過(guò)溶膠凝膠沉淀制備氟化鈣復(fù) 合材料的方法，所述方法包括下述步驟:在沉淀?xiàng)l件下組合CaCl 2、NaF和NaZ，和收集不溶于 水的氟化鈣復(fù)合材料。
[0066] 通過(guò)遵循方案4,根據(jù)反應(yīng)II可以制備用在本文公開(kāi)的組合物中的氟化鈣復(fù)合材 料。
[0067] CaCl2 + NaF + AZ-CaF(2-x)Zx/Zy + NaCl 反應(yīng) II 其中A是金屬，且x和y如在式I中所述。在一些方面，A是Ca或Na。
[0068] 方案 4: 1. 制備包含選擇的NaZ的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。 2. 制備包含NaF的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。 3. 制備包含CaCl2的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。 4. 將步驟1和2的溶液組合，然后與步驟3的溶液組合，然后混合。 5. 將混合物靜置。 6. 將直到或超過(guò)y2的上清液除去并用水替換。 7. 將保留的液體混合，并將混合物靜置。 8. 重復(fù)步驟6 - 7。 9. 濃縮得到的固體(通過(guò)，例如，離心）。
[0069] 可替換地，通過(guò)遵循方案5,根據(jù)反應(yīng)II可以制備用在本文公開(kāi)的組合物中的氟化 鈣復(fù)合材料。
[0070] 方案 5: 1. 制備包含NaF的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。 2. 制備包含CaCl2和選擇的有機(jī)Z的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。 3. 混合步驟1和2的溶液。 4. 將混合物靜置。 5. 將直到或超過(guò)y2的上清液除去并用水替換。 6. 將保留的液體混合，并將混合物靜置。 7. 重復(fù)步驟5 - 6。 8. 濃縮得到的固體(通過(guò)，例如，離心）。
[0071] 可替換地，通過(guò)遵循方案6,根據(jù)反應(yīng)II可以制備用在本文公開(kāi)的組合物中的氟化 鈣復(fù)合材料。
[0072] 方案 6: 1. 制備包含NaF和選擇的有機(jī)Z的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。 2. 制備包含CaCl2的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。 3. 混合步驟1和2的溶液。 4. 將混合物靜置。 5. 將直到或超過(guò)y2的上清液除去并用水替換。 6. 將保留的液體混合，并將混合物靜置。 7. 重復(fù)步驟5 - 6。 8. 濃縮得到的固體(通過(guò)，例如，離心）。
[0073] 可替換地，根據(jù)方案7,使用抗壞血酸鈣可以制備用在本文公開(kāi)的組合物中的氟化 鈣復(fù)合材料。
[0074] 方案 7: 1. 制備包含CaC^HwOu的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。 2. 制備包含NaF的溶液(并通過(guò)過(guò)濾滅菌）。 3. 混合步驟1和2的溶液。 4. 將混合物靜置。 5. 將直到或超過(guò)y2的上清液除去并用水替換。 6. 將保留的液體混合，并將混合物靜置。 7. 重復(fù)步驟5 - 6。 8. 濃縮得到的固體(通過(guò)，例如，離心）。
[0075] 在一些方面，制備氟化鈣組合物的方法包括在沉淀?xiàng)l件下將一種或多種抗原與 CaCl2、NaF和NaZ組合。在一些方面，制備氟化鈣組合物的方法包括洗滌所述氟化鈣復(fù)合材 料的步驟，其中所述洗滌步驟還包括將一種或多種抗原與所述氟化鈣復(fù)合材料組合。在一 些方面，制備氟化鈣組合物的方法包括將所述氟化鈣復(fù)合材料與一種或多種抗原混合的步 驟。
[0076] 在一些方面，公開(kāi)了通過(guò)本文所述的方法制備的產(chǎn)品。
[0077] 佐劑組合物 在一些方面，提供了一種佐劑組合物，其包含本文公開(kāi)的氟化鈣組合物。"佐劑組合物" 是指，與單獨(dú)抗原的施用相比，能夠增加對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答的本文公開(kāi)的氟化鈣組合 物。在一些方面，本文公開(kāi)的佐劑組合物還包含免疫刺激劑。
[0078]在一個(gè)方面，該免疫刺激劑可以是皂苷。用在本發(fā)明中的一種特別合適的皂苷是 Quil A及其衍生物。Quil A是從南美洲樹(shù)阜皮樹(shù)(Quillaja Saponaria Molina)分離出的 阜苷制劑，且由Dalsgaard等人在 1974年（"Saponin adjuvants"，Archiv. fur die gesamte Virusforschung,第44卷，Springer Verlag, Berlin,第243-254頁(yè)）首次描述 為具有佐劑活性。已經(jīng)通過(guò)HPLC分離了Quil A的純化片段，其保留佐劑活性，沒(méi)有與Quil A 有關(guān)的毒性(EP 0 362 278)，例如QS7和QS21 (也被稱作QA7和QA21KQS-21是從皂皮樹(shù)的 樹(shù)皮衍生出的天然皂苷，其誘導(dǎo)⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)、Thl細(xì)胞和優(yōu)勢(shì)的IgG2a抗體 應(yīng)答。在本發(fā)明的上下文中，QS21是一種優(yōu)選的皂苷。
[0079]在本發(fā)明的合適形式中，在所述佐劑組合物內(nèi)的阜苷佐劑是阜皮樹(shù)（saponaria molina) quil A的衍生物，優(yōu)選地是Quil A的免疫活性級(jí)分，諸如QS-17或QS-21，適當(dāng)?shù)?是QS-21。
[0080] 在一個(gè)具體的方面，將QS21提供在它的低反應(yīng)原性組合物中，其中將它用外源固 醇(諸如膽固醇)猝滅。存在低反應(yīng)原性組合物的幾種特定形式，其中將QS21用外源膽固醇 猝滅。在一個(gè)具體的方面，所述皂苷/固醇是呈脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的形式(W0 96/33739)。在該方 面，所述脂質(zhì)體適當(dāng)?shù)睾兄行灾|(zhì)，例如磷脂酰膽堿，其適當(dāng)?shù)卦谑覝厥欠墙Y(jié)晶的，例如 卵黃磷脂酰膽堿、二油?；字Ｄ憠A(D0PC)或二月桂基磷脂酰膽堿。所述脂質(zhì)體還可以 含有帶電荷的脂質(zhì)，對(duì)于由飽和脂質(zhì)組成的脂質(zhì)體而言，所述帶電荷的脂質(zhì)增加脂質(zhì)體-QS21結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在這些情況中，帶電荷的脂質(zhì)的量適當(dāng)?shù)厥? -20%w/w，優(yōu)選地是5-10%。 固醇與磷脂的比率是l-50%(m〇l/m〇l)，適當(dāng)?shù)厥?0-25%。
[0081] 合適的固醇包括谷固醇、豆固醇、麥角固醇、麥角鈣化醇和膽固醇。在一個(gè)特定 方面，所述佐劑組合物包含膽固醇作為固醇。這些固醇是本領(lǐng)域眾所周知的，例如膽固醇作 為在動(dòng)物脂肪中發(fā)現(xiàn)的天然存在的固醇公開(kāi)在Merck Index，第11版，第341頁(yè)。
[0082]在活性皂苷級(jí)分是QS21的情況下，QS21:固醇的比率將通常是在1:100至1:1 (w/ w)的量級(jí)，適當(dāng)?shù)卦?:10至1:1 (w/w)之間，且優(yōu)選地在1:5至1:1 (w/w)之間。適當(dāng)?shù)卮嬖?過(guò)量的固醇，QS21:固醇的比率是至少1:2 (w/w)。在一個(gè)方面，QS21:固醇的比率是1:5 (w/ w)。所述固醇適當(dāng)?shù)厥悄懝檀肌?br>[0083] 在另一個(gè)方面，所述佐劑組合物包含免疫刺激劑，其為T(mén)ol 1-樣受體4 (TLR4)激動(dòng) 劑。"TLR激動(dòng)劑"是指這樣的組分:其能夠作為直接配體或通過(guò)內(nèi)源性或外源性配體的產(chǎn)生 而間接地造成經(jīng)由TLR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答(Sabroe等人，J1 2003 pl630-5)。 TLR4激動(dòng)劑能夠造成經(jīng)由TLR-4信號(hào)傳導(dǎo)途徑的信號(hào)應(yīng)答。TLR4激動(dòng)劑的一個(gè)合適的例子 是脂多糖，適當(dāng)?shù)厥侵|(zhì)A的無(wú)毒衍生物，特別是單磷酰脂質(zhì)A或更特別是3-脫酰的單磷酰 脂質(zhì)A (3D - MPL)。
[0084] 3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.在名稱MPL下銷售，并且在本文件 中自始至終稱作MPL或3D-MPL。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)4,436,727、4,877,611、4,866,034和 4,912,094。30-10^主要促進(jìn)具有正1 8(!111)表型的〇)4+1'細(xì)胞應(yīng)答。根據(jù)在68 2 220 211 A中公開(kāi)的方法，可以生產(chǎn)3D-MPL。在化學(xué)上，它是具有3、4、5或6個(gè)?；湹?-脫酰的 單磷酰脂質(zhì)A的混合物。在本發(fā)明的組合物中，可以使用小顆粒3D-MPL來(lái)制備佐劑組合物。 小顆粒3D-MPL具有使它可以通過(guò)0.22 wii過(guò)濾器無(wú)菌過(guò)濾的顆粒尺寸。這樣的制劑描述在 WO 94/21292中。優(yōu)選地，使用粉狀3D-MPL來(lái)制備本發(fā)明的佐劑組合物。
[0085]可以使用的其它TLR4激動(dòng)劑是氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯（AGP)，諸如在W098/ 50399或美國(guó)專利號(hào)6，303，347 (也公開(kāi)了制備AGP的方法）中公開(kāi)的那些，適當(dāng)?shù)厥侨缭诿?國(guó)專利號(hào)6，764，840中公開(kāi)的RC527或RC529或AGP的藥物上可接受的鹽。一些AGP是TLR4激 動(dòng)劑，且一些是TLR4拮抗劑。認(rèn)為二者都可用作免疫刺激劑。
[0086] 其它合適的TLR-4激動(dòng)劑如在W02003/011223中和在W0 2003/099195中所述，諸如 在W02003/011223的第4-5頁(yè)上或在W02003/099195的第3-4頁(yè)上公開(kāi)的化合物I、化合物II 和化合物 III，且特別是在 W02003/011223 中作為 ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、 ER804057m ￡1?804058、￡1?80405941?804442、￡1?804680和￡1?804764公開(kāi)的那些化合物。例如， 一種合適的TLR-4激動(dòng)劑是ER804057。
[0087]在一個(gè)特定方面，所述佐劑組合物包含皂苷和TLR4激動(dòng)劑兩者。在一個(gè)具體實(shí)例 中，所述佐劑組合物包含QS21和3D-MPL。
[0088] TLR-4激動(dòng)劑(諸如脂多糖，諸如3D-MPL)可以以1-100 yg/人劑量的佐劑組合物之 間的量使用。3D-MPL可以以約50 yg的水平使用，例如40-60 yg之間，適當(dāng)?shù)?5-55 yg之間， 或49-51 yg之間或50 yg。在另一個(gè)方面，所述佐劑組合物的人劑量包含約25 yg水平的3D-MPL，例如20-30 yg之間，合適的21-29 yg之間或22-28 yg之間或28-27 yg之間或24-26 yg 之間，或25 yg。
[0089] 皂苷(諸如QS21)可以以1-100 yg/人劑量的佐劑組合物之間的量使用。QS21可以 以約50 yg的水平使用，例如40 - 60 yg之間，適當(dāng)?shù)?5-55 yg之間或49-51 yg之間或50 y g。在另一個(gè)方面，所述佐劑組合物的人劑量包含約25 yg水平的QS21，例如20-30 yg之間， 適當(dāng)?shù)?1-29 yg之間或22-28 yg之間或28-27 yg之間或24-26 yg之間，或25 yg。
[0090]在TLR4激動(dòng)劑和皂苷都存在于佐劑組合物中的情況下，那么TLR4激動(dòng)劑與皂苷的 重量比適當(dāng)?shù)厥窃?:5至5:1之間，適當(dāng)?shù)厥?:1。例如，在3D-MPL以50 yg或25 yg的量存在 的情況下，那么適當(dāng)?shù)豎S21也可以分別以50 yg或25 yg/人劑量的佐劑組合物的量存在。 [0091] 在一個(gè)方面，所述免疫刺激劑是TLR9激動(dòng)劑，例如如在W0 2008/142133中所述。在 一個(gè)具體實(shí)例中，所述TLR9激動(dòng)劑是免疫刺激性的寡核苷酸，尤其是含有未甲基化的CpG基 序的寡核苷酸。這樣的寡核苷酸是眾所周知的，并且描述于例如WO 96/02555、W0 99/33488 和US 5，865，462中。用在本文描述的佐劑組合物中的合適TLR9激動(dòng)劑是含有CpG的寡核苷 酸，其任選地含有被至少三個(gè)(合適地，至少六個(gè)或更多個(gè))核苷酸隔開(kāi)的兩個(gè)或更多個(gè)二 核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸和隨后的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸。
[0092] 在一個(gè)方面，所述寡核苷酸中的核苷酸間鍵是二硫代磷酸酯，或可能是硫代磷酸 酯鍵，盡管也可以使用磷酸二酯和其它核苷酸間鍵，包括具有混合的核苷酸間鍵的寡核苷 酸。用于產(chǎn)生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278， 302和W095/26204中。預(yù)見(jiàn)到包含不同核苷酸間鍵的寡核苷酸，例如混合的硫代磷酸酯磷酸 二酯?？梢允褂檬构押塑账岱€(wěn)定的其它核苷酸間鍵。
[0093] 適合于包含在本文描述的佐劑組合物中的CpG寡核苷酸的例子具有以下序列。在 一個(gè)方面，這些序列含有硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵。
[0094] 替代性的CpG寡核苷酸可以包含上面的序列，它們?cè)谄渲芯哂袑?duì)所述序列的不連 續(xù)缺失或添加。
[0095] 在一個(gè)方面，所述免疫刺激劑是母育酚。母育酚是本領(lǐng)域眾所周知的，且描述在 EP0382271中。在一個(gè)特定方面，所述母育酚是a-生育酚或其衍生物諸如a-生育酚琥珀酸酯 (也被稱作維生素E琥珀酸酯）。
[0096] 在一個(gè)方面，本文公開(kāi)的佐劑組合物包含吸附至氟化鈣復(fù)合材料的免疫刺激劑。 在一個(gè)方面，佐劑組合物包含吸附至氟化鈣復(fù)合材料的免疫刺激劑，其中所述吸附至氟化 鈣復(fù)合材料的免疫刺激劑是MPL。
[0097] 在一個(gè)方面，公開(kāi)了本文公開(kāi)的佐劑組合物，與當(dāng)將抗原與氟化鈣組合物一起或 單獨(dú)地施用時(shí)針對(duì)所述抗原產(chǎn)生的免疫相比，所述佐劑組合物用于增加對(duì)所述抗原的免疫 應(yīng)答。在一個(gè)方面，公開(kāi)了本文公開(kāi)的佐劑組合物，與當(dāng)將抗原與磷酸鈣一起施用時(shí)針對(duì)所 述抗原產(chǎn)生的免疫相比，所述佐劑組合物用于增加對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答。通過(guò)施用給有 此需要的受試者，可以遞送本文公開(kāi)的組合物。施用可以是通過(guò)許多途徑，包括肌內(nèi)地、皮 下地、皮內(nèi)地、舌下地、向扁桃體或鼻內(nèi)地遞送。
[0098] 制備佐劑組合物的方法 在一些方面，公開(kāi)了制備如在本文公開(kāi)的佐劑組合物的方法，所述方法包括將免疫刺 激劑與本文描述的氟化鈣復(fù)合材料組合的步驟。在一些方面，公開(kāi)了制備如在本文公開(kāi)的 佐劑組合物的方法，所述方法包括將抗原吸附至如本文中所述的氟化鈣復(fù)合材料的步驟。 [0099] 免疫原性組合物 在一些方面，提供了包含抗原和如本文中所述的佐劑組合物的免疫原性組合物。在一 些方面，提供了要肌內(nèi)地、皮下地、皮內(nèi)地、舌下地、向扁桃體或鼻內(nèi)地遞送的如本文公開(kāi)的 免疫原性組合物。
[0100] 在一些方面，提供了如在本文公開(kāi)的免疫原性組合物，其中所述組合物的pH是在 約pH5至pH9之間。在一些方面，提供了適合于人施用的如本文公開(kāi)的免疫原性組合物。在一 些方面，提供了如本文公開(kāi)的免疫原性組合物，其包含一種或多種藥物上可接受的賦形劑， 尤其是緩沖劑、Tris緩沖劑;或組氨酸緩沖劑。在一些方面，提供了如在本文公開(kāi)的免疫原 性組合物，其中所述組合物在無(wú)菌條件下制備。在一些方面，提供了如在本文公開(kāi)的免疫原 性組合物，其中所述組合物是無(wú)致熱原的。在一些方面，提供了如在本文公開(kāi)的免疫原性組 合物，其中所述組合物是等滲的。在一些方面，提供了如在本文公開(kāi)的免疫原性組合物，其 中所述組合物包含糖或多元醇。
[0101] 在一些方面，提供了如在本文公開(kāi)的免疫原性組合物，其中至少一種抗原和至少 一種免疫刺激劑吸附至如百分比(w/V) Ca、F和Z以及Z的化學(xué)結(jié)構(gòu)所定義的單一類型的復(fù) 合材料。在一些方面，提供了如在本文公開(kāi)的免疫原性組合物，其中超過(guò)一種抗原和超過(guò)一 種免疫刺激劑吸附至如百分比(W/V) Ca、F和Z以及Z的化學(xué)結(jié)構(gòu)所定義的單一類型的復(fù)合 材料。在一些方面，提供了如本文公開(kāi)的免疫原性組合物，其至少包含如百分比(w/V) Ca、F 和Z以及Z的化學(xué)結(jié)構(gòu)所定義的第一類和第二類復(fù)合材料，其中至少一種抗原、至少一種免 疫刺激劑或二者吸附至所述第一類復(fù)合材料，且其中至少一種抗原、至少一種免疫刺激劑 或二者吸附至所述第二類復(fù)合材料。在一些方面，提供了如本文公開(kāi)的免疫原性組合物，其 包含至少一種如百分比(w/w) Ca、F和Z以及Z的化學(xué)結(jié)構(gòu)所定義的復(fù)合材料，其中至少一種 抗原、至少一種免疫刺激劑或二者吸附至所述至少一種復(fù)合材料，且其中至少一種抗原、至 少一種免疫刺激劑或二者吸附至不同的金屬鹽佐劑。在一些方面，所述第二種金屬鹽佐劑 是磷酸鈣。
[0102]在一些方面，提供了本文公開(kāi)的免疫原性組合物，與當(dāng)將抗原與氟化鈣組合物一 起或單獨(dú)地施用時(shí)針對(duì)所述抗原產(chǎn)生的免疫相比，所述免疫原性組合物用于增加對(duì)所述抗 原的免疫應(yīng)答。在一個(gè)方面提供了本文公開(kāi)的免疫原性組合物，與當(dāng)將抗原與磷酸鈣一起 施用時(shí)針對(duì)所述抗原產(chǎn)生的免疫相比，所述免疫原性組合物用于增加對(duì)所述抗原的免疫應(yīng) 答。通過(guò)施用給有此需要的受試者，可以遞送本文公開(kāi)的組合物。施用可以是通過(guò)許多途 徑，包括肌內(nèi)地、皮下地、皮內(nèi)地、舌下地、向扁桃體或鼻內(nèi)地遞送。
[0103] 制備免疫原性組合物的方法 在一些方面，提供了制備如在本文公開(kāi)的免疫原性組合物的方法，所述方法包括將本 文描述的氟化鈣組合物與本文公開(kāi)的佐劑組合物組合的步驟。
[0104] 使用組合物的方法 提供了用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中由病毒、細(xì)菌或寄生物造成的感染或疾病的方法， 所述方法包括將治療有效量的本文描述的氟化鈣組合物、佐劑組合物或免疫原性組合物給 藥至所述哺乳動(dòng)物。提供了用于治療或預(yù)防人中由病毒、細(xì)菌或寄生物造成的感染或疾病 的方法，所述方法包括將治療有效量的本文描述的氟化鈣組合物、佐劑組合物或免疫原性 組合物給藥至所述人。
[0105] 提供了在有此需要的哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述 哺乳動(dòng)物施用有效量的本文描述的氟化鈣組合物、佐劑組合物或免疫原性組合物。提供了 在有此需要的人中誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述人施用有效量的本文描 述的氟化鈣組合物、佐劑組合物或免疫原性組合物。
[0106] 除非另外解釋，在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本公開(kāi)內(nèi)容所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。單數(shù)術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"（a)、"一種(an)"和"所述(the)"包 括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另外清楚地指出。類似地，詞語(yǔ)"或"意圖包括"和"，除非上下文 另外清楚地指出。術(shù)語(yǔ)"多個(gè)"表示兩個(gè)或更多個(gè)。另外，關(guān)于物質(zhì)的濃度或水平(諸如溶液 組分濃度或其比率)和反應(yīng)條件(諸如溫度、壓力和周期時(shí)間）給出的數(shù)字限制意圖是近似 值。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"約"意圖指所述量± 1 〇%。
[0107]將參考以下非限制性的附圖和實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。 實(shí)施例
[0108] 分析方法: 相等補(bǔ)償點(diǎn) 相等補(bǔ)償點(diǎn)（Equal Compensation Point)測(cè)量:通過(guò)電位滴定（J.R.Feldkamp等人， Journal of Pharmaceutical Sciences, 1981，第70卷，第6期第638-640頁(yè)），進(jìn)行相等 補(bǔ)償點(diǎn)（E.C.P.)的測(cè)量。結(jié)果呈現(xiàn)在總圖中，所述總圖通過(guò)4條不同滴定曲線的并置而得 到:其中的兩條在水中測(cè)量，且另外兩條在有各種KC1 (或KN03)濃度存在下測(cè)量。例如，在 批次0&鄺/〇)3# 88331724中，得到兩個(gè)相等補(bǔ)償點(diǎn)（￡.(：.?.):在1120/1((：1系統(tǒng)中的6.4和 8.7。在該情況下，在pH 6.4以下，顆粒表面帶負(fù)電荷;在pH 6.4和pH 8.7之間，顆粒表面帶 正電荷;且在口!18.7以上，表面顆粒帶負(fù)電荷(方案8)。關(guān)于得到的￡.(：.?.1120/1^0 3值之間 的對(duì)比，參見(jiàn)表2A (下文）。
[0109] 干重 將懸浮液勾衆(zhòng)以后，將等分試樣（10 ml)在80 °C在5天中蒸發(fā)至干燥。樣品的重量(按mg 計(jì))代表在1 〇 ml懸浮液中存在的干燥材料量。該重量除以10，代表干燥材料量/ml懸浮液。 [0110] 紅外光譜圖 將所述干燥材料(如本文中所述得到）用手研磨，并原樣用于紅外分析。將幾mg樣品放 在Perkin Elmer FT-Infra Red儀器的多反射支架上。從4000cm-l至600cm_l，以透射比％模 式掃描光譜。有趣的是，注意到，吸附在無(wú)機(jī)材料上的有機(jī)材料總是在紅外光譜學(xué)中產(chǎn)生非 常寬的信號(hào)(相比于產(chǎn)生非常尖銳的信號(hào)的純有機(jī)材料）。
[0111] 關(guān)于吸附在CaF2中空球上的布洛芬(C.Zhang等人，2010，Chem. Eur. J?第16 卷第5672-5680頁(yè)）或油酸鹽（oleatate)吸附的螢石（CaF2) (Handbook of Infrared Spectroscopy of U1trathin Films. V.T. Tolstoy , I.V. Chernyshova和V?A? Skryshevsky. 2003 John Wiley & Sons, Inc?(第552頁(yè)），描述了這方面的例子。
[0112] 通過(guò)Antek測(cè)定氮含量 將懸浮液在沒(méi)有任何其它處理下注射進(jìn)Antex儀器中。因此，以ygN/ml為單位表示咐農(nóng) 度，且代表關(guān)于上清液溶液和吸附的材料兩者發(fā)現(xiàn)的總N含量。還對(duì)最后一次洗滌上清液 (W-10)進(jìn)行分析。
[0113] Ca和F元素分析 將含有500mg干燥材料的懸浮液過(guò)濾以取出固體部分，將其煅燒。礦化以后，將一部分 用于Ca%測(cè)定(+/-0.5%)，且將另一部分用于F%測(cè)定(+/-1%)。
[0114]抗氧化能力 在有硫酸溶液存在下，高錳酸鉀(KMn04)是最強(qiáng)的氧化劑之一。紫色高錳酸根陰離子被 還原成氧化猛(manganate oxide)(Mn02棕色）。這可以根據(jù)中色（incolor) Mn++陽(yáng)離子進(jìn) 一步還原，從而產(chǎn)生5個(gè)電子交換。在這樣的條件下，大多數(shù)有機(jī)材料都被完全氧化，而無(wú)機(jī) 物質(zhì)(諸如CaF 2)，是不敏感的。 MnOf (紫色）+ 4H+ + 3e -->Mn02 + 2H20 Mn〇2 + 4H+ + 2e -->Mn++ (中色）+ 2H2O。
[0115] 通常，將5個(gè)樣品（0.1、0.2、0.3、0.4和0.5ml懸浮液)放在透明的高分子容器(當(dāng)將 氟化物衍生物放在酸性介質(zhì)中時(shí)，避免玻璃容器）中。向它們中的每一個(gè)中，加入lml 5M的 H2S〇4 (將酸加入水中，且決不得將水加入酸中）。通過(guò)逐滴加入1 .OmM的KMn04 (紫色)直到 變色在3分鐘中持續(xù)，進(jìn)行滴定。因而，得到以yl 1 .OmM的KMn04/ml懸浮液表示的抗氧化能 力。可以以y 1 1. OmM的KMn04/mg干燥材料轉(zhuǎn)化那些值。用已知量的半胱氨酸或N-乙酰半胱 氨酸溶液（1.0 mM)進(jìn)行類似的滴定。因而，可以確立KMn04的消耗量和半胱氨酸或N-乙酰半 胱氨酸含量之間的關(guān)聯(lián)。此外，考慮到在懸浮液中存在的干燥材料的重量，可以計(jì)算按干燥 材料計(jì)的有機(jī)材料(半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸）的量，并以%w/w可氧化的有機(jī)材料/干重 表不。
[0116]商購(gòu)可得的化學(xué)藥品 已經(jīng)使用下述市售產(chǎn)品： ? CaC03固體：0MYA? 產(chǎn)品0MYAPURE 35; ? CaC〇3固體顆粒:Sigma-Aldrich產(chǎn)品 12010; ?氟化鈉：Merck? 產(chǎn)品 1064490250; ?氯化鈣：Merck? 產(chǎn)品n° 1023780500; ?半胱氨酸：Aldrich?產(chǎn)品168149;半胱氨酸：Merck產(chǎn)品1028380100; ? N-乙酰半胱氨酸：Sigma?產(chǎn)品A5099; ?硫甘油：Sigma?產(chǎn)品88640; ?磷酸乙醇胺：Sigma?產(chǎn)品P0503-100; #氟化鈣：汜6(161(16版§111"1產(chǎn)品01123; ?碳酸氫鈉:Merck? 產(chǎn)品 1063295000; ?碳酸鈉：Merck? 產(chǎn)品 1063981000; ?二水合氯化鈣(CaCl2.2H20): Merck? 產(chǎn)品2382; ?二水合氯化鈣(CaC1.2.2H20): Sigma Aldrich? 產(chǎn)品 12022; ?二水合磷酸氫二鈉：Merck?產(chǎn)品1065805000; ?檸檬酸三鈉：Merck?產(chǎn)品1110371000; ?氫氧化鈉：Merck? 產(chǎn)品 1064981000; ?抗壞血酸鈣：Fluka?產(chǎn)品11138; ?谷胱甘肽：Merck? 產(chǎn)品 104090.0050; ?谷胱甘肽氧化物：Sigma?產(chǎn)品G46265G; ?硫輕乳酸:Sigma Aldrich? 產(chǎn)品 T3,100-3; ?己二酸：Carlo ERBA? 產(chǎn)品401785; ?尿酸：Fluka? 產(chǎn)品51449; ?六水合氯化鈣：Merck?產(chǎn)品102072.1000; ?葉酸：Fluka? 產(chǎn)品01769; ?次黃嘌呤：Fluka產(chǎn)品56700 ?黃嘌呤：Sigma? 產(chǎn)品 X7375-256 ?鳥(niǎo)嘌呤：Aldrich? 產(chǎn)品 G11950-100G ?胞嘧啶：Fluka?產(chǎn)品30430 ?胸腺嘧啶：Sigma?產(chǎn)品T0376-5G。
[0117] 實(shí)施例1.氟化鈣的溶膠-凝膠形成的特征 形成了氟化鈣復(fù)合材料，并通過(guò)各種方法進(jìn)行了表征。該表征的結(jié)果總結(jié)在該實(shí)施例 中。在實(shí)施例1中提及的每個(gè)批次的形成的細(xì)節(jié)可以參見(jiàn)實(shí)施例2。



[0118] 溶膠-凝膠形成允許人們影響顆粒尺寸，例如，通過(guò)改變?cè)贜andiyanto中公開(kāi)的起 始溶液的濃度。各種選擇的有機(jī)化合物在溶液中的應(yīng)用允許人們得到具有不同表面電荷 (通過(guò)它們的E. C.P.值測(cè)量，表2A)的復(fù)合材料顆粒。

[0119] 當(dāng)在CaF2沉淀過(guò)程中同時(shí)使用碳酸鹽時(shí)，得到Ca/F/C〇3復(fù)合材料顆粒。通過(guò)改變碳 酸氫鹽或碳酸鹽的相對(duì)量，得到表現(xiàn)出不同表面性質(zhì)的復(fù)合材料(表2B)。
[0120] 對(duì)于低碳酸鹽摩爾比，形成的復(fù)合材料表現(xiàn)出球霰石型的碳酸鹽。這是令人驚訝 的，這是因?yàn)槠渌嗣枋龅那蝣笔纬娠@示，需要高濃度（1M的CaCl2 + 1M的K2⑶3)才能得 到球霰石型的碳酸鹽。Mori等人（2009) Materials Science and Engineering 29:1409-1414和Parkin等人(2009) Optics Express 17:21944-21955。通過(guò)本文公開(kāi)的方法得到的 球霰石型的碳酸鹽對(duì)于具有免疫學(xué)性質(zhì)的有機(jī)材料的吸附而言是重要的（參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分： MPL的吸附）。
[0121] 當(dāng)在沉淀過(guò)程中使用半胱氨酸時(shí)，得到Ca/F/半胱氨酸復(fù)合材料顆粒。通過(guò)改變加 入的次序，得到表現(xiàn)出不同表面性質(zhì)的復(fù)合材料(表3)。
[0122] 在本文中得到的納米顆粒表現(xiàn)出比手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)值(其通常與單晶有關(guān))更高的可溶 性。例如，圖3呈現(xiàn)了 Ca/F/OH納米顆粒批次11000123的水溶性。該復(fù)合材料的可溶性比在手 冊(cè)中報(bào)道的CaF2的可溶性(0.14mM)更高。因而，這些類型的納米復(fù)合材料顆粒在使用肌內(nèi) (頂)施用模式的疫苗領(lǐng)域中具有巨大利益。
[0123] 如在分析方法中所述，通過(guò)Antek分析了氮含量。從那些結(jié)果認(rèn)為，大部分的氮(源 自在制備過(guò)程中使用的選擇的起始有機(jī)材料)位于不溶性顆粒上(參見(jiàn)表4A)。
[0124]如在分析方法中所述，使用抗氧化能力來(lái)確定％(w/w)可氧化的有機(jī)材料/干重。結(jié) 果顯亦在表4B中。
[0125] 實(shí)施例2.復(fù)合材料的形成 根據(jù)在詳細(xì)描述中提供的一般方案，形成了各種復(fù)合材料。除非相反說(shuō)明，否則商業(yè)得 到本文中使用的原材料。
[0126] 1°商業(yè)固體顆粒的處理 {CaC03}固體水洗滌：批號(hào)8833111 如所述的(方案1)，用250ml水處理264.8mg碳酸鈣(來(lái)自查詢：OMYA ? )。給出了上清液 pH (參見(jiàn)表5)。
[0127] 終體積為30ml，并在該懸浮液上測(cè)量E.C.P.。將10 ml該懸浮液在80°C蒸發(fā)至干燥 并稱重。以相對(duì)于起始粉末的重量的百分比，表達(dá)得率。對(duì)干燥材料的樣品進(jìn)行紅外分析， 其顯示了 CaC03的方解石類型。
[0128] {CaC03}固體水洗滌：批號(hào)8833167 如同批號(hào)8833111 (表5)那樣處理247.9mg合成的碳酸鈣(其通過(guò)用C02在Ca(0H)2溶液 中作泡狀通過(guò)來(lái)沉淀，得自Mineral Technology? (Multiplex MM批次U203))〇
[0129] {CaC03}固體水洗滌：批號(hào) 11000077 如同批號(hào)8833111 (表5)那樣處理0.8288得自似11〇]\^七61'1&18 16(3]111〇1〇87?的111區(qū)]1 Gravity Controlled Precipitation NPCC111(合成的碳酸?丐）。
[0130] 用他?溶液處理的{0&〇)3}固體：批號(hào)8833107 將氟化鈉(710.7mg)溶解在水中并將pH調(diào)至pH 7.43，從而形成168 ml的總體積，將其 通過(guò)過(guò)濾滅菌。向該溶液中，加入265. lmg CaC03固體顆粒(0MYA ? )。如所述的，進(jìn)行水洗滌 (方案2)。給出了上清液pH(參見(jiàn)表5 )，終體積為30ml。將10 ml該懸浮液在80 °C蒸發(fā)至干燥 并稱重。以相對(duì)于起始粉末的重量的百分比，表達(dá)得率。對(duì)干燥材料的樣品進(jìn)行紅外分析， 其顯示了球霰石型的CaC03的存在（圖2)。
[0131] 用他?溶液處理的{0&〇)3}固體:批號(hào)9923127 用7.0843g溶解在l升水中的NaF處理2.6612gCa⑶ 3(0MYA?)，從而產(chǎn)生9.52的起始 PH，并像關(guān)于批號(hào)8833107那樣處理（表5)。得率為74.8%。給出了元素Ca和F分析（表5)。 CaC03的理論元素組成是Ca: 40%和⑶3:60%;而CaF2給出Ca: 51.28%和F: 48.72%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)給 出Ca:48%和F:41.9%，從而顯示氟化物％因?yàn)檫^(guò)低而不是純的CaF2,且Ca%因?yàn)檫^(guò)低而不是純 的CaC0 3。對(duì)干燥材料的樣品進(jìn)行紅外分析，顯示與在圖2中呈現(xiàn)的樣品編號(hào)8833107之一類 似的球霰石型碳酸鹽的存在。HC1滴定顯示，該粉末僅是2.6%碳酸鹽。因而，得到了0 &^/〇)3 的復(fù)合材料，其中CaC03部分屬于球霰石型，且因而不同于起始CaC03材料。
[0132] 用CaCl2溶液處理的{CaC03}固體：批號(hào)8833164 將氯化鈣(2.0223 g)溶解在水中并將pH調(diào)至pH 7.48,從而形成180 ml的總體積，將其 通過(guò)過(guò)濾滅菌。向該溶液中，加入276.8mg CaC03固體顆粒(0MYA? )。像關(guān)于批號(hào)8833107那 樣進(jìn)行水洗滌和處理(表5)。
[0133] 用半胱氨酸溶液處理的{CaC03}固體:批號(hào)8833110 將半胱氨酸(2.0111 g)溶解在水中并將pH調(diào)至pH 8.18,從而形成168 ml的總體積，將 其通過(guò)過(guò)濾滅菌。向該溶液中，加入277.4mg CaC03固體顆粒(OMYA ? )。如所述的，進(jìn)行水洗 滌(方案2)。給出了上清液pH(參見(jiàn)表5)。
[0134] 用N-乙酰半胱氨酸溶液處理的{CaC03}固體：批號(hào)8833139 將N-乙酰半胱氨酸(3.1058 g)溶解在水中并將pH調(diào)至pH 8.11，從而形成180 ml的總 體積，將其通過(guò)過(guò)濾滅菌。向該溶液中，加入266 ? 3mg CaC〇3固體(Sigma-Aldrich)。如所述 的，進(jìn)行水洗滌(方案2)。給出了上清液pH(參見(jiàn)表5)。
[0135] 用硫甘油處理的{CaC03}固體:批號(hào)8833114 將硫甘油（1.5ml)溶解在水中并將pH調(diào)至pH 9.50,從而形成168 ml的總體積，將其通 過(guò)過(guò)濾滅菌。向該溶液中，加入263.5 mg (2.63mmol) CaC〇3固體(0MYA?)。如所述的，進(jìn)行 水洗滌(方案2)。在表6中給出了上清液pH。
[0136] 用磷酸乙醇胺處理的{CaC03}固體:批號(hào)8833109 將磷酸乙醇胺(2.3582 g)溶解在水中并將pH調(diào)至pH 6.54,從而形成168 ml的總體積， 將其通過(guò)過(guò)濾滅菌。向該溶液中，加入270.6 mg CaC03固體顆粒(0MYA?)。如所述的，進(jìn)行 水洗滌(方案2)。給出了上清液pH(參見(jiàn)表6)。
[0137] {CaF〗}固體水洗滌：批號(hào)8833141 如所述的，用250ml水處理316. Omg氟化鈣(方案1)。給出了上清液pH(參見(jiàn)表6)。
[0138] 用半胱氨酸溶液處理的{CaF2}固體:批號(hào)8833142 將半胱氨酸（2.0735 g) (Merck)溶解在水中并將pH調(diào)至pH 8.15,從而形成182 ml的 總體積，將其通過(guò)過(guò)濾滅菌。向該溶液中，加入353.1 mg氟化鈣。如所述的，進(jìn)行水洗滌(方 案2)。給出了上清液pH(參見(jiàn)表6)。
[0139] 用N-乙酰半胱氨酸溶液處理的{CaF〗}固體:批號(hào)8833148 將N-乙酰半胱氨酸(3.01924 g)溶解在水中并將pH調(diào)至pH 8.20,從而形成180 ml的總 體積，將其通過(guò)過(guò)濾滅菌。向該溶液中，加入362.89 mg氟化鈣。如所述的，進(jìn)行水洗滌(方案 2)。給出了上清液pH(參見(jiàn)表6)。
[0140] 在pH 8.26用碳酸鹽處理的{CaF2}固體:批號(hào)8833149 將碳酸氫鈉（1.51058 g)溶解在180ml水中，得到pH 8.28。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。向 該溶液中，加入377.99 mg氟化鈣。如所述的，進(jìn)行水洗滌(方案2)。給出了上清液pH(參見(jiàn)表 6)〇
[0141] 在pH 11.54用碳酸鹽處理的{CaF2}固體:批號(hào)8833150 將碳酸鈉（1.88348 g)溶解在180ml水中，得到pH 11.54。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。向該 溶液中，加入383.85 mg氟化鈣。如所述的，進(jìn)行水洗滌(方案2)。給出了上清液pH(參見(jiàn)表 6)〇
[0142] 用磷酸乙醇胺處理的{CaF2}固體:批號(hào)9923130 將磷酸乙醇胺(2.3517 g)溶解在水中并將pH調(diào)至pH 6.55,從而形成180 ml的總體積， 將其通過(guò)過(guò)濾滅菌。向該溶液中，加入351.41 mg氟化鈣。如所述的，進(jìn)行水洗滌(方案2)。給 出了上清液pH和滲透壓(參見(jiàn)表6)。
[0143] 用硫甘油處理的{CaF2}固體:批號(hào)9923131 將硫甘油（1.5ml)溶解在水中并將pH調(diào)至pH 9.44,從而形成180 ml的總體積，將其通 過(guò)過(guò)濾滅菌。向該溶液中，加入350.6 mg氟化鈣。如所述的，進(jìn)行水洗滌(方案2)。給出了上 清液pH和滲透壓(參見(jiàn)表6)。
[0144] 2°溶膠-凝膠沉淀 加入CaCl2溶液中的Na2HP〇4溶液:批號(hào)391080 將二水合氯化鈣（1.8370g)溶解在900ml水中，得到6.37的pH。通過(guò)過(guò)濾滅菌以后，將該 溶液放在2升無(wú)菌的Duran-Schott中。將二水合磷酸氫二鈉(2.2250g)溶解在900ml水中，得 到9.32的pH。通過(guò)過(guò)濾滅菌以后并在無(wú)菌條件下，將該溶液加入CaCl 2溶液中。傾析過(guò)夜以 后，拋棄1500ml上清液并用1500ml無(wú)菌水替換。將那些洗滌重復(fù)12次。最后將懸浮液通過(guò)離 心濃縮至200ml的總體積。那些顆粒表現(xiàn)出7.8的E.C.P. H20/KCL (參見(jiàn)表7)。
[0145] 加入Na2HP〇4溶液中的CaCl 2溶液:批次391082 將二水合磷酸氫二鈉(2.22382g)溶解在900ml水中。通過(guò)過(guò)濾滅菌以后，將該溶液放在 2升無(wú)菌的Duran-Schott中。將二水合氯化f丐（1.83972g)溶解在900ml中。通過(guò)過(guò)濾滅菌以 后并在無(wú)菌條件下，將該溶液加入磷酸氫二鈉中。以下處理類似于批號(hào)391080 (表7)。
[0146] 加入CaCl2溶液中的Na2HP〇4和檸檬酸鹽溶液:批號(hào)391084 將二水合氯化鈣（1.8413g)溶解在900ml水中。通過(guò)過(guò)濾滅菌以后，將該溶液放在2升無(wú) 菌的Duran-Schott中。將二水合磷酸氫二鈉(2.2247g)溶解在900ml水中并通過(guò)過(guò)濾滅菌。 將檸檬酸三鈉(4.0259g)溶解在180ml水中，產(chǎn)生8.49的pH，并通過(guò)過(guò)濾滅菌。在無(wú)菌條件 下，將檸檬酸鹽溶液加入磷酸氫二鈉溶液中并將該混合物加入CaCl 2溶液中。以下處理類似 于批號(hào)391080 (表7)。
[0147] 加入CaCl2溶液中的Na2HP〇4和賴氨酸溶液:批號(hào)391086 將二水合氯化鈣（1.8350g)溶解在900ml水中。通過(guò)過(guò)濾滅菌以后，將該溶液放在2升無(wú) 菌的Duran-Schott中。將二水合磷酸氫二鈉溶解在900ml水中并通過(guò)過(guò)濾滅菌。向100ml水 中加入15g賴氨酸堿。加入鹽酸(0.1 N) (40ml)以得到10.1的pH。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并 加入磷酸氫二鈉溶液中，并將該混合物加入CaCl2溶液中。以下處理類似于批號(hào)391080 (表 7)。
[0148] CaF2:批號(hào) 8833172D 將氟化鈉（8.4158g)溶解在500ml水中并調(diào)至pH 7.25。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并將 100ml該溶液放在無(wú)菌的250ml Duran-Schott燒瓶中。
[0149] 將氯化鈣（13.3555g)溶解在600ml水中并調(diào)至pH 7.07。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并 將100 ml該溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案3進(jìn)行水洗滌。給出了上清液pH(參見(jiàn)表8)。
[0150] CaF2:批號(hào) 8833190 將氟化鈉(8.4231g)溶解在500ml水中。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化鈣（11.1093g)溶解在500ml水中。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并加入NaF溶 液中。根據(jù)方案3進(jìn)行水洗滌。在表8中給出了上清液pH。
[0151] CaF2:批號(hào) 9440194 將氟化鈉(8.4273g)溶解在500ml水中。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并放在無(wú)菌的1升Duran- Schott燒瓶中。將氯化鈣（11.1174g)溶解在500ml水中。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并加入NaF溶 液中。根據(jù)方案3進(jìn)行水洗滌。在表8中給出了上清液pH。
[0152] 0&/^/011:批號(hào)11000123 將氟化鈉(4.2055g)溶解在504.2ml水中，pH為9.40。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并放在無(wú)菌 的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化鈣（11.1107g)溶解在508.2ml水中。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅 菌，并加入NaF溶液中。根據(jù)方案3進(jìn)行水洗滌。在表8中給出了上清液pH。
[0153] 在碳酸鹽域中的 Ca/F/C03 :批次 8833152-8833157 Na2C03溶液:將10 ? 6031g溶解在500ml水中（得到pH 11 ? 61)并通過(guò)0? 2ym過(guò)濾滅菌。NaF 溶液:將8.41413g溶解在500ml水中（得到pH 9.66)并通過(guò)0.2_過(guò)濾滅菌。0&(：12溶液:將 13 ? 3250g溶解在600ml水中（得到pH 10 ? 07)并通過(guò)0 ? 2ym過(guò)濾滅菌。
[0154] 從那些溶液起始，通過(guò)遵循根據(jù)表9的步驟1-3,進(jìn)行Ca/F/C03批次8833152-8833157。
[0155] 根據(jù)方案6進(jìn)行水洗滌。在表10中給出了上清液pH。
[0156] 因而，降低⑶3-濃度(或增加F-濃度)產(chǎn)生越來(lái)越少的產(chǎn)品量和更低的W10 pH 值。
[0157] 在最高F-濃度得到的樣品（#8833157)產(chǎn)生了最低E.C.P.值。這提示，那些得到 的沉淀物由CaC0 3顆粒組成，可能隨著F-濃度增加而含有遞增的CaF2含量。
[0158] 因而，在系列Ca/F/C038833152-8833157中，我們具有： -越來(lái)越少的C03-，其被越來(lái)越多的F-補(bǔ)償(通過(guò)起始摩爾比）； -類似的濃度，用干重mg/ml來(lái)表示(除了低得多的8833157以外）； -C03-含量的下降(通過(guò)滴定和通過(guò)IR (870cm-l參見(jiàn)圖8)證實(shí)； -方解石形式的減少（IR 1430 cm-1參見(jiàn)圖8)，球霰石較多（IR 1490和1420 cm-1參見(jiàn) 圖8);#8833155、#8833156和#8833157含球霰石型很多；#8833152含球霰石很少且含方解石 很多。球霰石給出在750cm-l的弱IR信號(hào)，且在713-715cm_l沒(méi)有給出信號(hào);而方解石表現(xiàn)出 在713-715cm-l的IR信號(hào)，且在750cm-l沒(méi)有表現(xiàn)出IR信號(hào)（M. Sato和S. Matsuda; Zeitschrift fiir Kristallographie, 1969第 129卷第405-410頁(yè)）； -類似的E.C.P. H20/KCL值(除了較低的8833157以外）； -在較低碳酸鹽含量，E.C.P. H20/KN03值的下降。
[0159] 在碳酸氫鹽域中的Ca/F/C03: 碳酸氫鈉溶液:將碳酸氫鈉(8.4098g)溶解在500ml水中（在該階段，pH為8.14)并通過(guò) 過(guò)濾滅菌。氟化鈉溶液:將氟化鈉(8.4158g)溶解在500ml水中，并將pH調(diào)至7.25。將溶液通 過(guò)過(guò)濾滅菌。氯化鈣溶液:將氯化鈣（13.3555g)溶解在600ml水中，并將pH調(diào)至8.07。將溶液 通過(guò)過(guò)濾滅菌。
[0160] 在碳酸氫鹽域中的Ca/F/C03 :批號(hào)8833172A 將10 ml碳酸氫鈉溶液放在無(wú)菌的250 ml Duran-Schott燒瓶中并加入90 ml氟化鈉溶 液，在該階段，pH為8.53。
[0161] 將氯化鈣溶液（100ml)加入NaHC03和NaF溶液中。根據(jù)方案4進(jìn)行水洗滌。在表8中 給出了上清液pH。
[0162] 在碳酸氫鹽域中的Ca/F/C03 :批號(hào)8833172B 將5 ml碳酸氫鈉溶液放在無(wú)菌的250 ml Duran-Schott燒瓶中并加入95 ml氟化鈉溶 液，在該階段，pH為8.44。
[0163] 將氯化鈣溶液（100ml)加入NaHC03和NaF溶液中。根據(jù)方案4進(jìn)行水洗滌。在表8中 給出了上清液pH。
[0164] 在碳酸氫鹽域中的Ca/F/C03 :批號(hào)8833172C 將1 ml碳酸氫鈉溶液放在無(wú)菌的250 ml Duran-Schott燒瓶中并加入99 ml氟化鈉溶 液，在該階段，pH為8.21。
[0165] 將氯化鈣溶液（100ml)加入NaHC03和NaF溶液中。根據(jù)方案4進(jìn)行水洗滌。在表8中 給出了上清液pH。
[0166] 對(duì)批次8833172A、8833172B、8833172C 和8833172D 進(jìn)行 HC1 滴定。
[0167] 通過(guò)HC1滴定，可以監(jiān)控碳酸鹽的存在。通過(guò)交付類似量的納米顆粒進(jìn)行對(duì)比，例 如：3.〇1111 8833172八（在8.2811^/1111)、2.71111 88331728(在9.3711^/1111)、1.361111 8833172〇 (在18 ? 52mg/ml)和lml 8833172D (在25 ? 27mg/ml)，在必要時(shí)在水中稀釋至各自3ml的總體 積，并用0.3N HC1溶液滴定(表8)。
[0168] Ca/F/C03:批號(hào) 9440195 將碳酸氫鈉(8.4109g)溶解在500ml水中（在該階段，pH為8.17)并通過(guò)過(guò)濾滅菌。將氟 化鈉(8.4203g)溶解在500ml水中，并將pH調(diào)至7.29。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。在無(wú)菌條件下， 將50ml碳酸氫鹽溶液和450ml氟化鈉溶液放在無(wú)菌的1L Duran-Schott中。將氯化鈣 (11.1089g)溶解在500ml水中，并將pH調(diào)至7.96。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并加入Duran-Schott容器中。根據(jù)方案4進(jìn)行水洗滌。給出了上清液pH和HC1滴定的結(jié)果(表11)。
[0169] 0&/^/〇)3:批號(hào)9923123 將碳酸氫鈉(8.4122g)溶解在500ml水中（在該階段，pH為8.12)并通過(guò)過(guò)濾滅菌。將50 ml該溶液放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將氟化鈉(8.42488g)溶解在500ml水中，并 將pH調(diào)至7.25。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并將450ml加入已經(jīng)含有碳酸氫鹽溶液的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化鈣（11.1275g)溶解在500ml水中，并將pH調(diào)至7.72。將溶液通過(guò)過(guò)濾 滅菌，并加入NaHC0 3和NaF溶液中。根據(jù)方案4進(jìn)行水洗滌。上清液pH和HC1滴定的結(jié)果：參 見(jiàn)表11。
[0170] Ca/F/C03 # 9923124 將50 ml為批次9923123制備的碳酸氫鈉溶液放在1升無(wú)菌的Duran-Schott燒瓶中。將 氟化鈉(8.42253g)溶解在500ml水中，并將pH調(diào)至7.27。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并將450ml加 入已經(jīng)含有碳酸氫鹽溶液的1升Duran-Schott燒瓶中。
[0171] 將氯化鈣（11. llllg)溶解在500ml水中，并將pH調(diào)至7.70。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌， 并加入NaHC03和NaF溶液中。根據(jù)方案4進(jìn)行水洗滌。給出了上清液pH和HC1滴定的結(jié)果(表 11)〇
[0172] 在碳酸鹽域中的 Ca/F/C03:11000080-83 碳酸鈉溶液:將碳酸氫鈉（17.11 g)溶解在1000ml水中，并加入NaOH以達(dá)到pH 10.09。 將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。氟化鈉溶液:將氟化鈉（20.16g)溶解在1200ml水中，且pH為9.84。 將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。CaCl 2溶液:將44.4g溶解在2000ml水中（得到pH 10.17)并通過(guò)0.2ym 過(guò)濾滅菌。
[0173] Ca/F/C03 11000080： 使用1L無(wú)菌的Duran-Schott:將450ml碳酸鹽溶液加入50ml氟化鈉溶液中，產(chǎn)生pH 10.09。在層流下，加入500ml氯化鈣溶液。根據(jù)方案4進(jìn)行水洗滌。在表11中給出了上清液 pH。
[0174] Ca/F/C03 11000081： 使用1L無(wú)菌的Duran-Schott:將250ml碳酸鹽溶液加入250ml氟化鈉溶液中，產(chǎn)生pH 10.07。在層流下，加入500ml氯化鈣溶液。根據(jù)方案4進(jìn)行水洗滌。在表11中給出了上清液 pH。
[0175] Ca/F/C03 11000082： 使用1L無(wú)菌的Duran-Schott:將150ml碳酸鹽溶液加入350ml氟化鈉溶液中，產(chǎn)生pH 10.06。在層流下，加入500ml氯化鈣溶液。根據(jù)方案4進(jìn)行水洗滌。在表11中給出了上清液 pH。
[0176] Ca/F/C03 11000083： 使用1L無(wú)菌的Duran-Schott:將50ml碳酸鹽溶液加入450ml氟化鈉溶液中，產(chǎn)生pH 10.05。在層流下，加入500ml氯化鈣溶液。根據(jù)方案8進(jìn)行水洗滌。在表19中給出了上清液 pH。
[0177] Ca/F/抗壞血酸:批號(hào) 9440198 將抗壞血酸鈣（42.6001g)溶解在400ml水中（得到pH = 7.35)。加入17ml氫氧化鈉 (0.5M)以達(dá)到pH8.99。加入水(83ml)產(chǎn)生pH 9.08，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的 1升Duran-Schott燒瓶中。將氟化鈉(4 ? 2063g)溶解在500ml水中（得到pH 9 ? 49)并通過(guò)過(guò)濾 滅菌。將該溶液加入抗壞血酸鈣溶液中。次日，將混合物轉(zhuǎn)移進(jìn)2L無(wú)菌的Duran Schott燒瓶 中，并加入另外1升無(wú)菌水。應(yīng)用另外15天靜置期。根據(jù)方案7進(jìn)行水洗滌。在表12中給出了 上清液pH。
[0178] Ca/F/半胱氨酸:批號(hào)944055 將0.84108g氟化鈉和2.42216g半胱氨酸(Merck)溶解在84ml水中。加入0.5N氫氧化鈉 (16ml)以達(dá)到pH 8.18。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并放在250ml無(wú)菌的Duran-Schott燒瓶中。將 2.22197g氯化鈣溶解在100ml水中，產(chǎn)生pH 10.03溶液，將其通過(guò)過(guò)濾滅菌。在無(wú)菌條件下， 將該CaCl2溶液加入(NaF +半胱氨酸)溶液中。在表3中給出了水洗滌和上清液pH。
[0179] Ca/F/半胱氨酸:批號(hào)944056 將2g氯化鈣和2.42838g半胱氨酸(Merck)溶解在80ml水中。加入0.5N氫氧化鈉(21ml) 以達(dá)到pH 8.18。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌，并放在250ml無(wú)菌的Duran-Schott燒瓶中。將 0.84168g氟化鈉溶解在100ml水中，產(chǎn)生pH 8.78溶液，將其通過(guò)過(guò)濾滅菌。在無(wú)菌條件下， 將該NaF溶液加入(CaF2 +半胱氨酸)溶液。給出了水洗滌和上清液pH (表3)。
[0180] Ca/F/半胱氨酸:批號(hào)944057 將0.84196g氟化鈉溶解在100ml水中，產(chǎn)生pH 8.98溶液，將其通過(guò)過(guò)濾滅菌，并放在 250ml無(wú)菌的Duran-Schott燒瓶中。將2.2265g氯化|丐和2.42194g半胱氨酸(Merck)溶解在 80ml水中。加入0.5N氫氧化鈉(21ml)以達(dá)到pH 8.19。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。在無(wú)菌條件下， 將該(CaF2 +半胱氨酸)溶液加入NaF溶液中。給出了水洗滌和上清液pH (表3)。
[0181] Ca/F/半胱氨酸:批號(hào)944058 將氯化鈣2.2242g溶解在100ml水中，產(chǎn)生pH 10.04溶液，將其通過(guò)過(guò)濾滅菌，并放在 250ml無(wú)菌的Duran-Schott燒瓶中。將0.84254g氣化鈉和2.42793g半脫氨酸(Merck)溶解在 83.5ml水中。加入0.5N氫氧化鈉（16.5ml)以達(dá)到pH 8.19。將溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。在無(wú)菌條 件下，將該(NaF +半胱氨酸)溶液加入CaF2溶液中。水洗滌和上清液pH:參見(jiàn)表3。
[0182] Ca/F/半胱氨酸：批號(hào) 9440099 將氟化鈉(4.2287 g)溶解在500ml水中，pH在該階段為9.22，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú) 菌的1升Duran-Schott燒瓶中。加入氯化f丐（11 ? 1582g)和半胱氨酸（12.1086 g) (Merck)并 溶解于400ml水中（得到淺紫色，且pH = 5.58)。加入0.5N氫氧化鈉（117ml)以達(dá)到pH 8.22， 并將該淺紫色溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2_半胱氨酸溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行 水洗滌。給出了上清液pH和滲透壓(參見(jiàn)表12)。
[0183] Ca/F/半胱氨酸:批號(hào) 9440197 將氟化鈉(4.215 g)溶解在400ml水中（得到pH = 9.62)，通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的 1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化f丐（11.1037g)溶解在400ml水中（得到pH = 10.06)并加入 半胱氨酸（12.1060 g) (Merck)(得到淺紫色pH = 5.6)。加入0.5N氫氧化鈉（107ml)以達(dá) 到pH 8.21，并將該淺紫色溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2-半胱氨酸溶液加入NaF溶液中。根據(jù) 方案5進(jìn)行水洗滌。在表12中給出了上清液pH)。
[0184] Ca/F/N-乙酰半胱氨酸:批號(hào)9440110 將氟化鈉(4.2058g g)溶解在400ml水中（得到pH = 9.26)，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú) 菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化鈣（11.10976g)溶解在400ml水中并加入N-乙酰半胱 氨酸（16.37876 g)(得到pH = 1.67)。加入氫氧化鈉(0.550 g)并加入0.5N氫氧化鈉（196 ml)以達(dá)到pH 8.35,并將該淺紫色溶液(著色在pH 5以上出現(xiàn))通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2-N-乙酰半胱氨酸溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表12中給出了上清液pH。
[0185] Ca/F/N-乙酰半胱氨酸:批號(hào)9440196 將氟化鈉(4.2026g)溶解在400ml水中（得到pH = 9.66)，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌 的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化f丐（11.1139g)溶解在400ml水中（得到pH = 10.04)并加 入N-乙酰半胱氨酸（16.3025 g)(得到pH = 1.4)。加入氫氧化鈉（固體丸，Merck產(chǎn)品 1064981000批次B0467298) (0.848 g)，并加入0.5N氫氧化鈉（172 ml)以達(dá)到pH 8.35,并 將該淺紫色溶液(著色在pH 5以上出現(xiàn))通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2-N-乙酰半胱氨酸溶液加入 NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表12中給出了上清液pH)。
[0186] Ca/F/N-乙酰半胱氨酸:批號(hào)10616125 將氟化鈉(4.2026g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.01)，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌 的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化鈣（11.1362g)溶解在500ml水中（得到pH = 10.04)并加 入N-乙酰半胱氨酸（16.3313 g)(得到pH = 1.63)。加入氫氧化鈉（固體丸，Merck產(chǎn)品 1064981000批次B0467298008)直到pH 8.02,并加入0.5N氫氧化鈉（5 ml)以達(dá)到pH 8.30， 并將該淺紫色溶液(著色在pH 5以上出現(xiàn))通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2-N-乙酰半胱氨酸溶液加 入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。上清液pH:參見(jiàn)表12。
[0187] Ca/F/N-乙酰半胱氨酸:批號(hào)11000101 將氟化鈉(4.2101g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.35)，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌 的1升011抑11-3〇11〇?燒瓶中。將氯化鈣（11.17158)溶解在5001111水中（得到口11 = 9.97)并加 入N-乙酰半胱氨酸（16.3469 g)(得到pH = 1.79)。加入氫氧化鈉直到pH 7.69并加入0.5N 氫氧化鈉(5 ml)以達(dá)到pH 8.36,并將該淺紫色溶液(著色在pH 5以上出現(xiàn))通過(guò)過(guò)濾滅菌。 將CaCl2-N-乙酰半胱氨酸溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表12中給出了上 清液pH)。
[0188] Ca/F/谷胱甘肽：批號(hào) 10616185 將氟化鈉(4.2098g)溶解在500ml水中（得到pH = 8.9)，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的 1升011瓜11-3(*〇?燒瓶中。將氯化鈣（11.10258)溶解在5001111水中（得到口11=10.00)，并將 該溶液〇.22ym過(guò)濾和重新放在清潔的800ml Becker中。加入谷胱甘肽(得到pH = 2.67)。加 入氫氧化鈉以達(dá)到pH 8.57，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶 液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表13中給出了上清液pH。
[0189] Ca/F/谷胱甘肽:批號(hào) 11000030 將氟化鈉(4.2260g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.47)，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌 的1升〇11瓜11-5(*〇?燒瓶中。將氯化鈣（11.12(^)溶解在50〇1111水中（得到口11 = 9.92)并將該 溶液0.22ym過(guò)濾和重新放在清潔的800ml Becker中。加入谷胱甘肽(3.0726 g)(得到pH = 2.72)。加入氫氧化鈉和0.5M氫氧化鈉以達(dá)到pH 8.59,并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表13中給出了上清液pH。
[0190] Ca/F/谷胱甘肽:批號(hào) 11000033 將氟化鈉(4.2097g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.35)，加入0.3M HC1以達(dá)到pH 6.94 并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。
[0191] 將氯化鈣（11.117g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.91)并將該溶液0.22ym過(guò)濾和 重新放在清潔的800ml Becker中。加入谷胱甘肽(30.7 g)(得到pH = 2.64)。加入氫氧化 鈉和0.3M HC1以達(dá)到pH 7.04，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。將0&(：12-谷胱甘肽溶液加入似？ 溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表13中給出了上清液pH。
[0192] Ca/F/谷胱甘肽:批號(hào) 11000086 將氟化鈉(4.2235g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.34)，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并 放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化f丐（11.1431g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.92)并將該溶液0.22ym過(guò)濾和重新放在清潔的800ml Becker中。加入谷胱甘肽（3.0782 g)(得到pH = 2.84)。加入氫氧化鈉和0.5M氫氧化鈉以達(dá)到pH 8.59,并將該溶液通過(guò)過(guò)濾 滅菌。將CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表13中給出了上清 液pH。
[0193] Ca/F/谷胱甘肽:批號(hào) 11000099 將氟化鈉(4. llOlg)溶解在500ml水中（得到pH = 9.58)，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并 放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化鈣（1101228g)溶解在500ml水中并將該溶液 0.22ym過(guò)濾和重新放在清潔的800ml Becker中（得到pH = 10.05)。加入谷胱甘肽(3.0716 g)(得到pH = 2.79)。加入氫氧化鈉和0.5M氫氧化鈉以達(dá)到pH 8.57,并將該溶液通過(guò)過(guò)濾 滅菌。將CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表13中給出了上清 液pH。
[0194] Ca/F/谷胱甘肽:批號(hào) 11000194 將氟化鈉(4.2059g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.24)，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并 放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化f丐（11.1371g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.99)并將該溶液0.22ym過(guò)濾和重新放在清潔的800ml Becker中。加入谷胱甘肽（3.0912 g)(得到pH = 3.07)。加入氫氧化鈉和0.5M氫氧化鈉以達(dá)到pH 8.58,并將該溶液通過(guò)過(guò)濾 滅菌。將CaCl2-谷胱甘肽溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表13中給出了上清 液pH。
[0195] Ca/F/谷胱甘肽氧化物:批號(hào)10616198 將氟化鈉(〇.4220g)溶解在50ml水中（得到pH = 8.64)，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的 100ml Duran-Schott燒并瓦中。將氯化?丐（1.1112g)溶解在30ml水中（得至IjpH = 9.97)并加入 谷胱甘肽氧化物（6.56118)(得到？11 = 6.27)。加入0.5~和0.0511氫氧化鈉以達(dá)到口11 7.55，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2-谷胱甘肽氧化物溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5 進(jìn)行水洗滌。在表14中給出了上清液pH。
[0196] Ca/F/谷胱甘肽氧化物:批號(hào)11000139 將氟化鈉(4.20838g)溶解在50ml水中（得到pH = 9.82)，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌 的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化鈣（1.1528g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.97)并將該 溶液0.22ym過(guò)濾和重新放在清潔的800ml Becker中。加入谷胱甘肽氧化物(3.2255 g)(得 到pH = 6.84)。加入氫氧化鈉和0.5M氫氧化鈉以達(dá)到pH 8.21，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。 將CaCl2-谷胱甘肽氧化物溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表14中給出了上 清液pH。
[0197] Ca/F/谷胱甘肽氧化物:批號(hào)11000140 將氟化鈉(4.20027g)溶解在50ml水中（得到pH = 9.82)，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌 的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化鈣（1.1068g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.94)并將該 溶液0.22ym過(guò)濾和重新放在清潔的800ml Becker中。加入谷胱甘肽氧化物（6.56150 g) (得到pH = 6.55)。加入氫氧化鈉和0.5M氫氧化鈉以達(dá)到pH 8.12,并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅 菌。將CaCl2_谷胱甘肽氧化物溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表14中給出了 上清液pH。
[0198] Ca/F/硫羥乳酸鹽:批號(hào)11000031 將氟化鈉(4.2078g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.56)，并通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌 的1升Duran-Schott燒瓶中。將氯化鈣（11.1187g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.89)并將 該溶液〇.22ym過(guò)濾和重新放在清潔的800ml Becker中。加入硫輕乳酸(8.5ml)(得到pH = 1.96)。加入氫氧化鈉以達(dá)到pH 9.54,并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2-硫羥乳酸鹽溶液 加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗滌。在表15中給出了上清液pH。
[0199] Ca/F/硫羥乳酸鹽:批號(hào)11000059 將氟化鈉(4.2146g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.47)，并加入0.03N HC1以達(dá)到pH 7.16。 將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升〇11瓜11-5(*〇?燒瓶中。將氯化鈣（11.17808) 溶解在500ml水中（得到pH = 9.98)并將該溶液0.22ym過(guò)濾和重新放在清潔的800ml Becker中。加入硫羥乳酸(8.5ml)(得到pH = 2.05)。加入氫氧化鈉和0.03M NaOH以達(dá)到pH 7.16, 并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2-硫羥乳酸鹽溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行 水洗滌。在表15中給出了上清液pH。
[0200] Ca/F/硫羥乳酸鹽:批號(hào)11000060 將氟化鈉(4.2161g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.45)，并加入0.03N HC1以達(dá)到pH 7.93。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升〇11瓜11-5(*〇?燒瓶中。將氯化鈣（11.17868) 溶解在500ml水中（得到pH = 9.96)并將該溶液0.22ym過(guò)濾和重新放在清潔的800ml Becker中。加入硫羥乳酸(8.5ml)(得到pH = 1.96)。加入鈉和0.03M NaOH以達(dá)到pH 8.07， 并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌。將CaCl2-硫羥乳酸鹽溶液加入NaF溶液中。根據(jù)方案5進(jìn)行水洗 滌。在表15中給出了上清液pH。
[0201] Ca/F/己二酸：批號(hào) 11000129 將己二酸(7.3070g)溶解在500ml水中（得到pH = 2.81)。加入氫氧化鈉以達(dá)到pH5.39。 加入氟化鈉(4 ? 1967g);pH在該階段為5 ? 59。加入更多NaOH以達(dá)到pH 8 ? 02，并將該溶液通過(guò) 過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。
[0202] 將氯化鈣（11.1481g)溶解在500ml水中（得到pH =10.81)。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌 和倒入NaF/己二酸鹽無(wú)菌溶液中。根據(jù)方案6進(jìn)行水洗滌。在表15中給出了上清液pH。
[0203] Ca/F/己二酸：批號(hào) 11481026 將己二酸(7 ? 3174g)溶解在500ml水中（得到pH = 2 ? 99)。加入氫氧化鈉以達(dá)到pH5 ? 11。 加入氟化鈉(4.1979g);pH在該階段為5.48。加入更多NaOH以達(dá)到pH 5.94，并將該溶液通過(guò) 過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。
[0204] 將氯化鈣（11.1163g)溶解在500ml水中（得到pH =9.82)。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌 和倒入NaF/己二酸鹽無(wú)菌溶液中。根據(jù)方案6進(jìn)行水洗滌。在表15中給出了上清液pH。
[0205] Ca/F/己二酸:批號(hào) 11481027 將己二酸(7.3151 g)溶解在500ml水中（得到pH = 2.98)。加入鈉以達(dá)到pH5.36。加入氟 化鈉(4.1995g);pH在該階段為5.48。加入更多NaOH以達(dá)到pH 7.18，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅 菌并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。
[0206] 將氯化鈣（11.1209g)溶解在500ml水中（得到pH =9.82)。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌 和倒入NaF/己二酸鹽無(wú)菌溶液中。根據(jù)方案6進(jìn)行水洗滌。在表15中給出了上清液pH。
[0207] Ca/F/尿酸：批號(hào) 11000182 將氟化鈉(4.1650g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.52)。將尿酸(0.132238)分成幾小 份加入，給出時(shí)間（過(guò)夜）用于溶解，并在需要時(shí)加入NaOH (0.5M)以補(bǔ)償pH下降；pH在該階 段為8.60。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將六水合氯化?丐 (21.9929g)溶解在500ml水中（得到pH =6.24)。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌和倒入NaF/尿酸鹽 無(wú)菌溶液中。根據(jù)方案6進(jìn)行水洗滌。上清液pH:參見(jiàn)表14。
[0208] Ca/F/葉酸（維生素M):批號(hào) 11481018 將氟化鈉(4.2026g)溶解在500ml水中（得到pH = 9.33)。加入葉酸(0.4481g)，且pH下 降至5.74。加入0.5M NaOH以達(dá)到pH 6.98,并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升 Duran-Schott燒瓶中。將氯化鈣（11.1183g)溶解在500ml水中（得到pH =9.73)。將該溶液通 過(guò)過(guò)濾滅菌和倒入NaF/葉酸鹽無(wú)菌溶液中。根據(jù)方案6進(jìn)行水洗滌。上清液pH:參見(jiàn)表14。
[0209] Ca/F/次黃嘌呤批次 11481198 將氟化鈉（4.21g)溶解在500ml水中，加入1.36g次黃嘌呤，加入0.5M NaOH以達(dá)到pH 9.83,并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將二水合氯化?丐 (14.73g)溶解在500ml水中并加入lml的0.05M NaOH以達(dá)到pH 9.31，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾 滅菌和倒入NaF/次黃嘌呤無(wú)菌溶液中。根據(jù)方案6進(jìn)行水洗滌。上清液pH參見(jiàn)表15A。
[0210] Ca/F/黃嘌呤批次 11481199 將氟化鈉（4.22g)溶解在500ml水中，加入1.52g黃嘌呤，加入0.5M NaOH以達(dá)到pH 10.75，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將二水合氯化鈣 (14.71g)溶解在500ml水中并加入lml的0.05M NaOH以達(dá)到pH 9.39，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾 滅菌和倒入NaF/黃嘌呤無(wú)菌溶液中。根據(jù)方案6進(jìn)行水洗滌。上清液pH參見(jiàn)表15A。
[0211] Ca/F/鳥(niǎo)嘌呤批次 11481195 向在50ml水中的1.52g鳥(niǎo)嘌呤中加入NaOH (固體丸）（1.4g)。溶解以后，加入4.21 g氟 化鈉和450ml水。該溶液的pH為12.52。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將二水合氯化鈣（14.71g)溶解在500ml水中并加入0.5ml的0.05M NaOH以達(dá) 到pH 8.48，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌和倒入NaF/鳥(niǎo)嘌呤無(wú)菌溶液中。根據(jù)方案6進(jìn)行水洗 滌。上清液pH參見(jiàn)表15A。
[0212] Ca/F/胞嘧啶批次 11954009 將氟化鈉(4.22g)溶解在500ml水中，加入1.10g胞嘧啶(得到pH 9.03)，并將該溶液通 過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將二水合氯化|丐（14.73@)溶解在500ml 水中并加入lml的0.05M NaOH以達(dá)到pH 9.18,并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌和倒入NaF/胞嘧啶 無(wú)菌溶液中。根據(jù)方案6進(jìn)行水洗滌。上清液pH參見(jiàn)表15A。
[0213] Ca/F/胸腺嘧啶批次 11954064 將氟化鈉（4.22g)溶解在500ml水中，加入1.26g次黃嘌呤，加入0.5M NaOH以達(dá)到pH 9.11，并將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌并放在無(wú)菌的1升Duran-Schott燒瓶中。將二水合氯化?丐 (14.75g)溶解在500ml水中并加入0.5ml的0.05M NaOH以達(dá)到pH 8.31，并將該溶液通過(guò)過(guò) 濾滅菌和倒入NaF/胸腺嘧啶無(wú)菌溶液中。根據(jù)方案6進(jìn)行水洗滌。上清液pH參見(jiàn)表15A。
[0214] Ca 己二酸鹽批次 11954096 將碳酸鈣（5g)懸浮于500ml水中。加入己二酸（7.3g)。加入另外的水量直到體積達(dá)到 750ml，并將混合物在60°C加熱1小時(shí)。將該溶液通過(guò)過(guò)濾滅菌(0.22ym過(guò)濾器）。將得到的溶 液加熱并通過(guò)蒸發(fā)濃縮直到約280ml總體積。將晶體從上清液分離并在80 °C干燥5天。在熱 重量分析法測(cè)量過(guò)程中將該產(chǎn)物用作己二酸鈣參比物。
[0215] 通過(guò)熱重量分析法分析復(fù)合材料的有機(jī)物含量. 對(duì)干燥材料樣品進(jìn)行熱重量分析法。記錄到在N2下從室溫至600 °C和在02下從600 °C至 800°C的重量減輕，并用燃燒的有機(jī)材料的量的差異來(lái)表示。

[0216] 實(shí)施例3A. MPL的吸附 在無(wú)菌條件下進(jìn)行MPL (在水中的納米顆粒）在各種無(wú)機(jī)顆粒上的吸附，并使用 LumiSizer ?儀器通過(guò)STEP ?技術(shù)(空間和時(shí)間分辨的消光曲線）測(cè)量MPL吸附的百分比。表 16總結(jié)了那些吸附數(shù)據(jù)，并表明球霰石型的碳酸鹽在鈣-氟化物-碳酸鹽復(fù)合材料中的存在 允許100yg MPL在500yg無(wú)機(jī)復(fù)合材料(在lml水中）上的100%吸附。Ca/F/N-乙酰半胱氨酸 (批次10616125)給出了類似的結(jié)果。
[0217] 實(shí)施例3B.吸附的抗原的穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性 用F4T(-種相當(dāng)不穩(wěn)定的抗原)證實(shí)了吸附的抗原的穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的提高。表17 總結(jié)了抗原吸附條件和最終組合物。
[0218] 通過(guò)在離心（以拋棄抗原/無(wú)機(jī)物部分)后的上清液上進(jìn)行的HPLC定量，確定抗原 吸附。上清液中無(wú)抗原被解釋為等于100%的吸附的抗原。在t=0和在t=l個(gè)月4°C測(cè)量吸附的 穩(wěn)定性，而在1個(gè)月30°C以后確定熱穩(wěn)定性(表18)。
[0219] 通過(guò)在t=0的SDS-PAGE分析進(jìn)行F4T抗原穩(wěn)定性概況評(píng)價(jià)（圖4)，并在t=l個(gè)月4°C 進(jìn)行對(duì)比（圖5)，而在30°C1個(gè)月以后確定熱穩(wěn)定性（圖6)。通過(guò)靜電力吸附后，抗原被SDS-PAGE凝膠環(huán)境和應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)迀移條件釋放。在該穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性測(cè)量的所有情況下，吸 附的材料的抗原概況與未吸附的對(duì)照樣品相比存在給人深刻印象的保持。
[0220] 實(shí)施例4.對(duì)ClfAN123和HepB抗原的免疫應(yīng)答 復(fù)合材料-C1 fAN123吸附的抗原的免疫應(yīng)答 復(fù)合材料-ClfANi23的吸附呈現(xiàn)在表19中，且制劑組成呈現(xiàn)在表20中。
[0221] 如顯示的（圖7)，當(dāng)將抗原吸附在不同的載體上時(shí)，維持抗原的免疫原性。
[0222] HepB吸附的抗原的免疫應(yīng)答 呈現(xiàn)了制劑組成(表21)。
[0223] 表21動(dòng)物經(jīng)歷LIMS 20130115,除了在磷酸鹽緩沖液和150mM NaCl中配制的 Engerix以外，都在10mM TRIS pH 6.8和山梨糖醇4.7%中配制。根據(jù)方案1和表14，水洗滌得 自Brenntag的磷酸?丐。
[0224] 如顯示的，當(dāng)將抗原吸附在本文描述的CaF2家族的不同載體上時(shí)，維持抗原的應(yīng) 答的抗體測(cè)量(抗-HBs 14pII)(圖1)。
[0225] 實(shí)施例5:免疫應(yīng)答 HepB吸附的抗原的免疫應(yīng)答 對(duì)于該氟化鈣復(fù)合材料體內(nèi)研究，使用與在實(shí)施例4中所用相同的氟化鈣復(fù)合材料批 次，從實(shí)施例4選擇5種氟化鈣復(fù)合材料和A100H用于重復(fù);另外，選擇吸附在%最初氟化鈣復(fù) 合材料量上的HepB用于研究（1240mg相對(duì)于600mg氟化|丐復(fù)合材料）。此外，選擇以前未試過(guò) 的氟化鈣復(fù)合材料(含有Z，不同于以前試驗(yàn)過(guò)的批次)用于該研究。試驗(yàn)的復(fù)合材料如下： ? 1°A100H 1240yg ? 2°A100H 600yg ? 3〇CaF2/C031240yg ? 4〇CaF2/C03600yg ? 5°CaF2N-乙酰半胱氨酸1240yg ? 6°CaF2N-乙酰半胱氨酸600yg ? 7°CaF2/谷胱甘肽 1240yg ? 8°CaF2/谷胱甘肽氧化物1240yg ? 9°CaF2/己二酸鹽 1240yg ? 10°CaF2/尿酸1240yg (新氟化鈣復(fù)合材料） ? ll°CaF2/尿酸600yg (新氟化f丐復(fù)合材料） ? 12°CaF2/葉酸1240yg (新氟化鈣復(fù)合材料） ? 13°CaF2/葉酸600yg (新氟化鈣復(fù)合材料） ? 14°僅HepB (無(wú)載體） 初步結(jié)果(未經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理）以從上(#1 = "Engerix-樣"配方)至(# 14單獨(dú)的hepB)的 相同次序總結(jié)在圖9中。
[0226] 實(shí)施例6:用吸附在不同復(fù)合材料上的重組F蛋白對(duì)Balb/c小鼠的免疫接種誘導(dǎo)與 氫氧化鋁類似水平的RSV中和抗體和rF結(jié)合抗體. 用重組RSV F蛋白（rF)進(jìn)行復(fù)合材料的吸附測(cè)量:與氫氧化鋁-或磷酸鈣-吸附的rF相 比，選擇5種rF-復(fù)合材料制劑用于在Balb/C小鼠中的免疫原性試驗(yàn)(參見(jiàn)表22)。
[0227] 將Balb/c小鼠組(n=9/組）用表22的制劑以3-周間隔肌內(nèi)地免疫2次。與選擇的佐 劑的每一種一起以兩種不同劑量使用rF抗原。
[0228] 在第35天(第二次免疫接種以后14天)單獨(dú)地收集來(lái)自所有小鼠的血清，并使用空 斑數(shù)降低測(cè)定來(lái)試驗(yàn)RSV中和抗體的存在，和通過(guò)ELISA來(lái)試驗(yàn)抗-rF IgG濃度。
[0229] 對(duì)于中和測(cè)定，將每種血清的系列稀釋物與RSV A (Long毒株)一起在33°C預(yù)溫育 20 min。溫育以后，將病毒-血清混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)先接種了Vero細(xì)胞的平板。在每個(gè)平板上， 將在一列中的細(xì)胞與僅病毒（100%感染性)一起溫育，且2個(gè)孔不接受病毒或血清(細(xì)胞對(duì) 照）。將平板在33°C溫育2小時(shí)，除去培養(yǎng)基，并將含有0.5%CMC (低粘度羧甲纖維素）的RSV 培養(yǎng)基加入所有孔中。在免疫熒光染色之前將平板在33°C溫育3天。
[0230]對(duì)于ELISA，用來(lái)對(duì)比不同組的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為在loglO值上的方差分析(AN0VA 1或 AN0VA 2)〇
[0231] 在圖11中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示，在試驗(yàn)的抗原的兩種劑量，在復(fù)合材料和氫氧化鋁中 的任一種誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答之間沒(méi)有觀察到顯著差異。另外，在2yg抗原劑量，復(fù)合材料 己二酸鹽與復(fù)合材料N-乙酰半胱氨酸和復(fù)合材料尿酸相比誘導(dǎo)顯著更高的中和抗體滴度。 磷酸鈣是更低免疫原性的佐劑，這是因?yàn)樗c氫氧化鋁(O.lyg rF)、復(fù)合材料己二酸鹽(2y g rF)、復(fù)合材料半胱氨酸（2yg rF)和復(fù)合材料尿酸(O.lyg rF)相比誘導(dǎo)顯著更低的中和 抗體滴度。
[0232] 當(dāng)關(guān)于抗-rF IgG的濃度試驗(yàn)血清樣品時(shí)，得到非常類似的結(jié)果(圖12)。
[0233] 實(shí)施例7:用吸附在不同復(fù)合材料上的重組F蛋白對(duì)Balb/c小鼠的免疫接種能夠在 RSV攻擊以后顯著減小肺中的RSV病毒量. 基于在實(shí)施例6中描述的實(shí)驗(yàn)，選擇復(fù)合材料己二酸鹽、復(fù)合材料半胱氨酸和復(fù)合材料 尿酸用于小鼠效力研究，與氫氧化鋁進(jìn)行對(duì)比。在表23中描述了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
[0234] 將Balb/c小鼠組(n=8/組）用表23的制劑以3-周間隔肌內(nèi)地免疫2次。在第二次免 疫接種以后14天，用1.54 x 106 pfu的RSV鼻內(nèi)地攻擊動(dòng)物。為了測(cè)量這些示例性疫苗的效 力，在RSV攻擊后4天收獲肺，并個(gè)別地稱重和勻漿。將每種肺勻漿物的系列稀釋物(各8個(gè)副 本)與Vero細(xì)胞一起溫育，并在接種后6天通過(guò)免疫焚光鑒定含有空斑的孔。使用Spearman-KSrber方法確定病毒滴度用于TCID50計(jì)算，并按每克肺表示。用于對(duì)比不同組的統(tǒng)計(jì)學(xué)方 法是在loglO值上的AN0VA 1。
[0235] 在圖13中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示，用2yg rF +復(fù)合材料己二酸鹽的疫苗接種是能夠完 全消除小鼠肺中的RSV復(fù)制的唯一復(fù)合材料制劑，用2yg rF +氫氧化鋁的疫苗接種也是。 其它兩種試驗(yàn)的復(fù)合材料(復(fù)合材料/半胱氨酸和復(fù)合材料/尿酸)沒(méi)有完全阻止肺中病毒 的復(fù)制，但是顯著地(P〈〇.001)減少肺中病毒的復(fù)制。這些結(jié)果表明，盡管存在類似的抗體 應(yīng)答，但不同復(fù)合材料可以誘導(dǎo)不同質(zhì)的疫苗應(yīng)答，如通過(guò)RSV攻擊的Balb/c小鼠中病毒復(fù) 制的不同抑制程度所顯示的。
[0236] 實(shí)施例8:在Balb/c小鼠免疫原性模型中評(píng)價(jià)復(fù)合材料19F-DT制劑. 通過(guò)2個(gè)實(shí)驗(yàn)在Balb/c小鼠免疫原性模型中試驗(yàn)了 10種不同的19F-DT制劑。在第0、14 和28天以O(shè).lyg 19F-DT的劑量肌內(nèi)地施用復(fù)合材料制劑。在第28天(ELISA和0PA，除了在合 并的血清上做出的經(jīng)歷20140179以外）和第42天(ELISA和0PA)收集的各個(gè)血清中確定IgG 水平和0PA滴度。除了Ca/F/尿酸和Ca 3(P04)2 (用作對(duì)照）制劑以外的所有候選物相對(duì)于 A1P04達(dá)到非劣等標(biāo)準(zhǔn)。參見(jiàn)圖14-17。
[0237] 實(shí)施例9:復(fù)合材料PRN的動(dòng)物結(jié)果. 簡(jiǎn)而言之，將BALB/c小鼠組(n=16/組）以2-周間隔肌內(nèi)地免疫2次;在第一次免疫接種 以后14天和第二次免疫接種以后7天，單獨(dú)地收集得自所有小鼠的血清，并根據(jù)下述規(guī)程針 對(duì)抗-PRN IgG抗體的存在進(jìn)行試驗(yàn)。
[0238] 將96-孔平板用在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(50mM)中的PRN (6μg/ml)包被，并在4 °(：溫育過(guò)夜。用PBS-BSA 1%緩沖液的飽和步驟以后，將小鼠血清在PBS-BSA 0.2%吐溫0.05% 中以1/100稀釋，并在來(lái)自平板的孔中系列稀釋（12個(gè)稀度，步驟y2)。加入與過(guò)氧化物酶偶聯(lián) 的抗-小鼠IgG (1/5000稀度）。加入過(guò)氧化物酶底物(0PDA)以后觀察比色反應(yīng)，并在通過(guò)分 光光度法(波長(zhǎng)：490-620 nm)讀出之前用1M HCL停止。對(duì)于試驗(yàn)的每種血清和加在每個(gè)平 板上的標(biāo)準(zhǔn)品，將4-參數(shù)邏輯增長(zhǎng)曲線擬合至0D和稀度之間的關(guān)聯(lián)(Softmaxpro)。這允許 衍生出以STD滴度表達(dá)的每個(gè)樣品滴度。
[0239] 實(shí)施例10: Denge/復(fù)合材料 將在4.7%的山梨糖醇在TRIS緩沖液(pH 8.0)中的溶液中配制的Denge-4吸附在不同復(fù) 合材料上以達(dá)到4yg抗原/ml的終濃度。離心以后，通過(guò)ELI SA在上清液中測(cè)量抗原。將100% ELISA值賦予離心后測(cè)量的類似Denge-4制劑。因而，低ELISA值顯示抗原在復(fù)合材料上的高 吸附。表25顯示在每種制劑中涉及的復(fù)合材料量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 氟化鈣組合物，其包含氟化鈣復(fù)合材料，所述復(fù)合材料包含Ca、F和Z，其中Z是有機(jī)分 子。2. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中所述復(fù)合材料包含等百分比w/w的Ca和 F〇3. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中所述復(fù)合材料包含比F百分比w/w更大的 Ca百分比w/w。4. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中所述復(fù)合材料具有式(I): CaF(2-x)Z(x)/Z(y) (I) 且其中X是〇至2的非負(fù)數(shù)，包括0和2,且y是0至2的非負(fù)數(shù)，包括0和2。5. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中所述復(fù)合材料具有式(II): CaF(2-x)Z(x)/HZ(y) (II) 且其中X和y在一起的總和是等于或小于2的非負(fù)數(shù)，且X和y都不為0。6. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中所述復(fù)合材料具有式(III): CaF(2-x)Z(x)/AZ(y) (III) 且其中X和y在一起的總和是等于或小于2的非負(fù)數(shù)，X和y都不為0,且A是抗衡離子。7. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中Z (i)是陰離子有機(jī)分子和/或（ii) 包含在離子化時(shí)形成陰離子的官能團(tuán)。8. 權(quán)利要求7的氟化鈣組合物，其中Z是對(duì)鈣具有親合力并與鈣和氟化物形成水不溶性 復(fù)合材料的有機(jī)分子。9. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中Z包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的官能團(tuán)：羥 基、羥基化物、配位羥離子、氧代、N-羥基化物、氧肟酸鹽、N-氧化物、碳酸氫鹽、碳酸鹽、羧酸 鹽、脂肪酸、硫醇鹽、有機(jī)磷酸鹽、磷酸二氫鹽、磷酸氫鹽、磷酸的單酯、磷酸的二酯、磷脂的 酯、硫代磷酸酯、硫酸鹽、硫酸氫鹽、烯醇化物、抗壞血酸鹽、含磷抗壞血酸鹽、酚鹽和亞胺- 醇鹽。10. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中Z可以歸類為包含選自以下的化學(xué)種類 的成員:羥基、羥基化物、配位羥離子、氧代、N-羥基化物、氧肟酸鹽、N-氧化物、碳酸氫鹽、碳 酸鹽、羧酸鹽和二羧酸鹽、羧酸的鹽、QS21的鹽、皂皮樹(shù)樹(shù)皮的提取物、免疫活性皂苷的提取 物、飽和或不飽和脂肪酸的鹽、油酸的鹽、氨基酸的鹽、硫醇鹽、硫羥乳酸鹽、硫醇-化合物的 鹽、半胱氨酸的鹽、N-乙酰半胱氨酸的鹽、L-2-氧代-4-噻唑烷羧酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽、 磷酸氫鹽、磷酸的鹽、磷酸的單酯和它們的鹽、磷酸的二酯和它們的鹽、3-0-脫?；?4 單 磷酰基脂質(zhì)A的酯、3D-MLA的酯、MPL、磷脂的酯、D0PC、二油?；字苌铩?lái)自CPG基序的 磷酸鹽、來(lái)自CpG家族的硫代磷酸酯、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硫酸的鹽、烯醇化物、抗壞血酸鹽、 含磷抗壞血酸鹽、酚鹽、α-生育酚、亞胺-醇鹽、胞嘧啶、甲基-胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、巴 比妥酸、次黃嘌呤、肌苷、鳥(niǎo)嘌呤、鳥(niǎo)苷、8-氧代-腺嘌呤、黃嘌呤、尿酸、蝶酸、蝶酰谷氨酸、葉 酸、核黃素和光黃素。11. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中Ζ選自：Ν-乙酰半胱氨酸;硫羥乳酸鹽； 己二酸鹽;碳酸鹽;葉酸;谷胱甘肽;和尿酸。12. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中Z選自：N-乙酰半胱氨酸；己二酸鹽;碳 酸鹽;和葉酸。13. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物， 其中Z是N-乙酰半胱氨酸， 且其中所述復(fù)合材料包含51% Ca、48% F、不超過(guò)1% N-乙酰半胱氨酸(w/w)至37% Ca、 26% F和37% N-乙酰半胱氨酸(w/w)。14. 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的氟化鈣組合物， 其中Z是硫羥乳酸鹽， 且其中所述復(fù)合材料包含51% Ca、48% F、不超過(guò)1%硫羥乳酸鹽(w/w)至42% Ca、30% F、 28%硫輕乳酸鹽(w/w)。15. 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的氟化鈣組合物， 其中Z是己二酸鹽， 且其中所述復(fù)合材料包含51% Ca、48% F、不超過(guò)1%己二酸鹽(w/w)至38% Ca、27% F、 35%己二酸鹽(w/w)。16. 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的氟化鈣組合物， 其中Z是碳酸鹽， 且其中所述復(fù)合材料包含51% Ca、48% F、不超過(guò)1%碳酸鹽(w/w)至48% Ca、34% F、18% 碳酸鹽(w/w)。17. 權(quán)利要求1 -11任一項(xiàng)的氟化鈣組合物， 其中Z是葉酸， 且其中所述復(fù)合材料包含51% Ca、48% F、不超過(guò)1%葉酸(w/w)至22% Ca、16% F、62%葉 酸(w/w)〇18. 權(quán)利要求1 -11任一項(xiàng)的氟化鈣組合物， 其中Z是谷胱甘肽， 且其中所述復(fù)合材料包含51% Ca、48% F、不超過(guò)1%谷胱甘肽(w/w)至28% Ca、20% F、 52%谷胱甘肽(w/w)。19. 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的氟化鈣組合物， 其中Z是尿酸， 且其中所述復(fù)合材料包含51% Ca、48% F和不超過(guò)1%尿酸(w/w)至36% Ca、26% F和38% 尿酸(w/w)。20. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中所述組合物是藥物上可接受的。21. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其中所述氟化鈣復(fù)合材料為顆粒狀形式。22. 權(quán)利要求21的氟化鈣組合物，其中所述復(fù)合材料顆粒是在納米顆?；蛭⒚最w粒尺 寸范圍內(nèi)。23. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其包含一種或多種附加復(fù)合材料，其中一 種或多種附加復(fù)合材料各自包含如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的Ca、F和Z，且其中一種或多 種附加復(fù)合材料各自在Ca、F或Z的百分比w/w或Z的化學(xué)結(jié)構(gòu)方面彼此不同。24. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其包含抗原，其中所述抗原吸附至氟化鈣復(fù) 合材料。25. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其用于穩(wěn)定抗原。26. 根據(jù)權(quán)利要求25的用于穩(wěn)定抗原的氟化鈣組合物，其中所述抗原是熱穩(wěn)定的。27. 如權(quán)利要求25至26任一項(xiàng)中所述的用于穩(wěn)定抗原的氟化鈣組合物，其中所述抗原 吸附至氟化鈣復(fù)合材料。28. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其用于藥品。29. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其用于引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。30. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其用于引發(fā)人的免疫應(yīng)答。31. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其用于預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物免于由病 毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)造成的疾病。32. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的氟化鈣組合物，其用于預(yù)防和/或治療人免于由病毒、細(xì)菌 或寄生蟲(chóng)造成的疾病。33. 通過(guò)溶膠凝膠沉淀制備氟化鈣復(fù)合材料的方法，其包括在沉淀?xiàng)l件下組合CaCl2、 NaF和NaZ并收集水不溶性氟化鈣復(fù)合材料的步驟。34. 權(quán)利要求33的通過(guò)溶膠凝膠沉淀制備氟化鈣復(fù)合材料的方法，其包括洗滌所述氟 化鈣復(fù)合材料的步驟。35. 權(quán)利要求33的通過(guò)溶膠凝膠沉淀制備氟化鈣復(fù)合材料的方法，其包括根據(jù)下列方 案：CaCl2 + NaF + NaZ - CaF(2-x)Zx/Zy + NaCl，在沉淀?xiàng)l件下組合 CaCl2、NaF 和 NaZ 并收 集水不溶性氟化鈣復(fù)合材料的步驟。36. 通過(guò)權(quán)利要求33至35任一項(xiàng)的方法制備的產(chǎn)物。37. 佐劑組合物，其包含如前述權(quán)利要求1 - 32和36任一項(xiàng)中所述的氟化鈣組合物。38. 權(quán)利要求37的佐劑組合物，其進(jìn)一步包含免疫刺激劑。39. 權(quán)利要求38的佐劑組合物，其中所述免疫刺激劑吸附至氟化鈣復(fù)合材料。40. 權(quán)利要求39的佐劑組合物，其中吸附至氟化鈣復(fù)合材料的所述免疫刺激劑是MPL。41. 權(quán)利要求37 - 40任一項(xiàng)的佐劑組合物，與當(dāng)將所述抗原與磷酸鈣一起或單獨(dú)地 施用時(shí)針對(duì)所述抗原產(chǎn)生的免疫相比，所述佐劑組合物用于增加對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答。42. 用于制備根據(jù)權(quán)利要求37至41任一項(xiàng)的佐劑組合物的方法，其包括將免疫刺激劑 與如權(quán)利要求1至32任一項(xiàng)中所述的氟化鈣復(fù)合材料組合的步驟。43. 用于制備根據(jù)權(quán)利要求37至41任一項(xiàng)的佐劑組合物的方法，其包括將抗原吸附至 如權(quán)利要求1至32任一項(xiàng)中所述的氟化鈣復(fù)合材料的步驟。44. 免疫原性組合物，其包含抗原和如權(quán)利要求37至41任一項(xiàng)中所述的佐劑組合物。45. 權(quán)利要求44的免疫原性組合物，其肌內(nèi)地、皮下地、皮內(nèi)地、舌下地、向扁桃體或鼻 內(nèi)地遞送。46. 權(quán)利要求44至45任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物的pH為約pH5至pH9。47. 權(quán)利要求44至46任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其適合人施用。48. 權(quán)利要求44至47任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其包含一種或多種藥物上可接受的賦 形劑，尤其是緩沖劑、Tr is緩沖劑;或組氨酸緩沖劑。49. 權(quán)利要求44至48任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物在無(wú)菌條件下制備。50. 權(quán)利要求44至49任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物是無(wú)致熱原的。51. 權(quán)利要求44至50任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物是等滲的。52. 權(quán)利要求51的免疫原性組合物，其中所述組合物包含糖或多元醇。53. 權(quán)利要求44至52任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中至少一種抗原和至少一種免疫刺 激劑吸附至如通過(guò)百分比w/w Ca、F和Z以及Z的化學(xué)結(jié)構(gòu)所定義的單一類型的復(fù)合材料。54. 權(quán)利要求44至52任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中多于一種抗原和多于一種免疫刺 激劑吸附至如通過(guò)百分比w/w Ca、F和Z以及Z的化學(xué)結(jié)構(gòu)所定義的單一類型的復(fù)合材料。55. 權(quán)利要求44至52任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其包含至少如通過(guò)百分比w/w Ca、F和 Z以及Z的化學(xué)結(jié)構(gòu)所定義的第一和第二類型的復(fù)合材料，其中至少一種抗原、至少一種免 疫刺激劑或兩者吸附至所述第一類型的復(fù)合材料，且其中至少一種抗原、至少一種免疫刺 激劑或兩者吸附至所述第二類型的復(fù)合材料。56. 用于制備根據(jù)權(quán)利要求44至55任一項(xiàng)的免疫原性組合物的方法，其包括將權(quán)利要 求1至32任一項(xiàng)的氟化鈣組合物與權(quán)利要求37至41任一項(xiàng)的佐劑組合物組合的步驟。57. 權(quán)利要求33的方法，其中所述組合步驟進(jìn)一步包括在沉淀?xiàng)l件下將一種或多種抗 原與CaC 12、NaF和NaZ組合。58. 權(quán)利要求34的方法，其中所述洗滌步驟進(jìn)一步包括將一種或多種抗原與氟化鈣復(fù) 合材料組合。59. 權(quán)利要求35的方法，其進(jìn)一步包括將氟化鈣復(fù)合材料與一種或多種抗原混合的步 驟。60. 用于制備權(quán)利要求24的氟化鈣組合物的方法，其中在氟化鈣復(fù)合材料的形成過(guò)程 中將所述抗原吸附至氟化鈣復(fù)合材料。61. 用于制備權(quán)利要求24的氟化鈣組合物的方法，其中在形成氟化鈣復(fù)合材料后將所 述抗原吸附至氟化鈣復(fù)合材料。62. 用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中由病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)造成的感染或疾病的方法，所述 方法包括將治療有效量的權(quán)利要求1-24和36任一項(xiàng)的氟化鈣組合物、權(quán)利要求37-41任一 項(xiàng)的佐劑組合物或權(quán)利要求44-55任一項(xiàng)的免疫原性組合物給藥至所述哺乳動(dòng)物。63. 用于治療或預(yù)防人中由病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)造成的感染或疾病的方法，所述方法包 括將治療有效量的權(quán)利要求1-24和36任一項(xiàng)的氟化鈣組合物、權(quán)利要求37-41任一項(xiàng)的佐 劑組合物或權(quán)利要求44-55任一項(xiàng)的免疫原性組合物給藥至所述人。64. 用于在有此需要的哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答的方法，所述方法包括將有效量 的權(quán)利要求1-24和36任一項(xiàng)的氟化鈣組合物、權(quán)利要求37-41任一項(xiàng)的佐劑組合物或權(quán)利 要求44-55任一項(xiàng)的免疫原性組合物給藥至所述哺乳動(dòng)物。65. 用于在有此需要的人中誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答的方法，所述方法包括將有效量的權(quán)利 要求1-24和36任一項(xiàng)的氟化鈣組合物、權(quán)利要求37-41任一項(xiàng)的佐劑組合物或權(quán)利要求44-55任一項(xiàng)的免疫原性組合物給藥至所述人。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK105873605SQ201480070872
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年10月23日
【發(fā)明人】V.范德維爾德
【申請(qǐng)人】葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司