專利名稱：：可溶性人程序性死亡蛋白-1-lgV及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及基因合成、蛋白表達(dá)純化、體外活性檢測(cè)、動(dòng)物體內(nèi)抑瘤檢測(cè)等技術(shù)，特別涉及一種可溶性人程序性死亡蛋白-1-IgV(hPD-l-IgV)及其制備方法。
背景技術(shù)：
：機(jī)體免疫系統(tǒng)可以識(shí)別"自我/非我"，對(duì)"非我"進(jìn)行免疫監(jiān)視、識(shí)別和應(yīng)答，以至將其消除。然而，這種機(jī)體強(qiáng)大的免疫保護(hù)系統(tǒng)，在腫瘤面前卻顯得束手無(wú)策。腫瘤在人體強(qiáng)大的免疫功能作用下仍能發(fā)展、轉(zhuǎn)移，表明腫瘤具有自己的保護(hù)機(jī)制。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)對(duì)自身表面抗原的修飾及改變腫瘤組織周圍的微環(huán)境來(lái)逃避機(jī)體的免疫識(shí)別與攻擊，這就是腫瘤的免疫逃逸。腫瘤存在著許多逃逸免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊的機(jī)制，包括HLA-I類抗原和免疫共刺激分子的表達(dá)下調(diào)或丟失；腫瘤抗原的表達(dá)下調(diào)、丟失或突變；腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制性可溶性因子；腫瘤細(xì)胞膜上表達(dá)免疫抑制性分子；誘導(dǎo)具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞等。其中，腫瘤來(lái)源的可溶性免疫抑制因子，以影響樹.突狀細(xì)胞(DC)以及淋巴T細(xì)胞的功能為主。這些因子致使髓樣細(xì)胞的不正常分化，導(dǎo)致全身性成熟DC數(shù)量下降、不成熟DC(iDC)數(shù)量增加及不成熟髓樣細(xì)胞(iMCs)的增加。主要有白細(xì)胞介素-10(IL-10)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子一P(TGF-P)，前列腺素E2PGE2)和趨化因子(如CCL2/MCP-1)等。在抗腫瘤免疫效應(yīng)中，CD8+T細(xì)胞起主要作用，通過(guò)對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別，可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，但腫瘤局部的微環(huán)境包含大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可單獨(dú)地或協(xié)同地影響CTL活化或腫瘤細(xì)胞對(duì)CTL殺傷的敏感性，共刺激免疫抑制性分子在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，它們要么使CD8+T細(xì)胞不能被活化，要么使活化的CD8+T細(xì)胞功能喪失或則使CD8+T細(xì)胞凋亡，這些共刺激免疫抑制性分子主要有CTLA4/B7、PD-1/PD-L1、ICOS/B7-H2、BTLA/B7-H4、TIM3等。PD-1分子2004年12月在第八屆國(guó)際人類白細(xì)胞分化抗原會(huì)議上被命名為CD279。最早是通過(guò)削減雜交技術(shù)從小鼠處于凋亡狀態(tài)的雜交瘤及造血祖細(xì)胞系克隆，被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡相關(guān)而命名為程序性死亡-1(programmeddeath-l)。它是免疫球蛋白超家族的激活誘導(dǎo)的抑制性受體，通過(guò)其胞漿區(qū)的兩個(gè)酪氨酸殘基與下游的信號(hào)分子作用而發(fā)揮對(duì)免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控功能。PD-1分子可在淋巴樣組織和實(shí)質(zhì)器官組織部位雙重抑制淋巴細(xì)胞的活化，在維持機(jī)體的外周耐受方面發(fā)揮重要的作用。研究表明，PD-1與其配體PD-L1(B7-H1)相互作用，組成PD-1/PD-L1通路，并且，PD-1/PD-L1通路可能參與了腫瘤免疫逃避、炎癥、自身免疫性疾病、移植耐受和病毒感染等的發(fā)生過(guò)程。申請(qǐng)人在分析CCR5結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上以PD-1IgV為研究目標(biāo)，利用基因工程手段和蛋白質(zhì)純化技術(shù)，獲得純化的重組蛋白樣品。外檢測(cè)該融合蛋白體內(nèi)能夠與PD-L1結(jié)合，以融合蛋白對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行抑瘤實(shí)驗(yàn)的觀察。我們的發(fā)明進(jìn)行了PD-1IgV融合蛋白的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究，為進(jìn)一步的腫瘤治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和奠定了基礎(chǔ)。1Programmeddeath-l(PD-1)分子研究進(jìn)展1.1PD-1的發(fā)現(xiàn)PD-1分子2004年12月在第八屆國(guó)際人類白細(xì)胞分化抗原會(huì)議上被命名為CD279。最早是通過(guò)削減雜交技術(shù)從小鼠處于凋亡狀態(tài)的雜交瘤及造血祖細(xì)胞系克隆，被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡相關(guān)而命名為程序性死亡-1(programmeddeath-l)。它是免疫球蛋白超家族的激活誘導(dǎo)的抑制性受體，通過(guò)其胞漿區(qū)的兩個(gè)酪氨酸殘基與下游的信號(hào)分子作用而發(fā)揮對(duì)免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控功能。PD-1分子可在淋巴樣組織和實(shí)質(zhì)器官組織部位雙重抑制淋巴細(xì)胞的活化，在維持機(jī)體的外周耐受方面發(fā)揮重要的作用。研究表明，PD-1與其配體PD-L1(B7-HO相互作用，組成PD-1/PD-L1通路，并且，PD-1/PD-L1通路可能參與了腫瘤免疫逃避、炎癥、自身免疫性疾病、移植耐受和病毒感染等的發(fā)生過(guò)程。1.2PD-1的結(jié)構(gòu)PD-1分子相對(duì)分子質(zhì)量是55，OOO免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，共有288個(gè)氨基酸組成(氨基酸組成如下所示)。001MQIPQAPWPVVWAVL(^LGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFFPALLVVTEGDNATFTCSFSNTS061ESFVL酵YRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDF腿SVVRARRNDSGT121YLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGS181LVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVP241CVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPLPD-l分子胞外區(qū)包含一個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域，有4個(gè)重要的N連接糖基化位點(diǎn)，并被重度糖基化。PD-1分子最顯著的特征是胞漿區(qū)的尾部含有兩個(gè)酪氨酸殘基，其中N末端的酪氨酸殘基與其他的氨基酸殘基共同組成了一個(gè)ITIM(免疫受體酪氨酸抑制基序)。ITIM存在于許多抑制性受體中，其共同特征是含有一個(gè)6個(gè)氨基酸殘基(Ile/Val/Leu/Ser)-X-Tyr-X-X-(Leu/Val)的共同序列，在免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。最近的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其C末端的酪氨酸殘基也可與下游的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子作用而抑制淋巴細(xì)胞的活化。1.3pd-1的分布PD-1分子在T、B細(xì)胞抗原受體激發(fā)后誘導(dǎo)性表達(dá)，未成熟的T、B細(xì)胞在胸腺和骨髓內(nèi)發(fā)育的特定階段也有表達(dá)。一些腫瘤細(xì)胞系已被證實(shí)有PD-1蛋白的表達(dá)，如Jurkat淋巴瘤，應(yīng)用佛波酯可明顯誘導(dǎo)其上調(diào)表達(dá)。部分腫瘤細(xì)胞系有PD-lmRNA的表達(dá)，如Daudi(Burkitt淋巴瘤)，HL260(急性前髓系白血病)等。1.4pd-1的配體PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)是PD-1的兩個(gè)配體，其全長(zhǎng)的cDNA是通過(guò)同源性篩選從胎盤的cDNA文庫(kù)中獲得。這兩個(gè)分子均定位于人染色體9p24.2,起始于同一方向，間隔42kb。它們同屬B7家族，因而同此家族的其他成員一樣，成熟的PD-L分子包含有IgV樣區(qū)、IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)及一個(gè)短的胞漿區(qū)尾部。在胞外區(qū)有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，參與Ig樣結(jié)構(gòu)中二硫鍵的形成。與PD-L2相比，PD-L1的胞漿區(qū)在人鼠之間更為保守。PD-Ll和PD-L2mRNA不僅可以表達(dá)在實(shí)質(zhì)器k組織部位，如心臟、肺和胎盤等，而且在抗原遞呈細(xì)胞上也有表達(dá)，如激活的B細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，在胸腺上皮細(xì)胞有PD-LlmRNA的表達(dá)。PD-L1在蛋白水平上的表達(dá)已在激活的T、B及單核細(xì)胞上得到證實(shí)。1.5pd-1/pd-l通路的作用1.5.1pd-1與pd-l的作用對(duì)體外t細(xì)胞功能的影響PD-1與PD-L1相互作用可抑制T細(xì)胞的增殖，同時(shí)抑制其對(duì)細(xì)胞因子IL-2、IFN-y和IL-10的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)PD-L1與PD-1對(duì)T細(xì)胞功能的影響與TCR與CD28信號(hào)的強(qiáng)度有關(guān)。在亞適量TCR信號(hào)強(qiáng)度下，PD-L1對(duì)T細(xì)胞的增殖抑制作用明顯；而在最適量的TCR信號(hào)時(shí)，僅在沒(méi)有CD28共刺激的情況下，才對(duì)T細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用。PD-L2與PD-1相互作用也可抑制TCR所介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生IL-4、IL-10和IFN-y。在較低抗原濃度下，PD-L2與PD-1作用可抑制TCR及B7-2介導(dǎo)的預(yù)激活的CD4+T細(xì)胞的增殖，并減少Thl和Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。但隨著抗原濃度的升高，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制下降，但仍能抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生。進(jìn)一步的研究證明，低濃度抗原可刺激PD-1高水平表達(dá)，隨著抗原濃度的升高，其表達(dá)下降。因此，PD-L/PD-1的相互作用對(duì)弱的抗原刺激反應(yīng)更敏感，這類抗原主要產(chǎn)生于自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生過(guò)程中。但另外的研究認(rèn)為，在亞適量的TCR信號(hào)下，PD-L2(B72DC)可有力地刺激體外T細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子(主要是IFN-y)的產(chǎn)生。有人發(fā)現(xiàn)，在體外應(yīng)用抗ctla-4抗體Fab片段阻斷其效應(yīng)時(shí)，可對(duì)同一抗原特異性的不同的t細(xì)胞亞群產(chǎn)生刺激或抑制效應(yīng)，這種不同的效應(yīng)取決于t細(xì)胞的激活狀態(tài)和TCR的信號(hào)強(qiáng)度。1.5.2PD-1與PD-L之間的負(fù)調(diào)控作用PD-1的胞內(nèi)區(qū)含有酪氨酸抑制性基序，通過(guò)募集含有酪氨酸磷酸酶活性及SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白因子傳遞負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)。2000年，F(xiàn)reeman等報(bào)道，B7-H1與PD-1結(jié)合可減少T細(xì)胞增殖；2002年，Iwai等研究發(fā)現(xiàn)B7-Hl與PD-l結(jié)合可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。雖然，通過(guò)接種或過(guò)繼轉(zhuǎn)移的方法均可以增加循環(huán)血液中腫瘤抗原特異性CD8+t細(xì)胞的數(shù)量，但隨著腫瘤的不斷進(jìn)展，腫瘤組織常常會(huì)出現(xiàn)對(duì)CD8+t細(xì)胞效應(yīng)功能的破壞或損傷。PD-1與B7-H1相互作用后，可能通過(guò)抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展來(lái)介導(dǎo)T細(xì)胞活化反應(yīng)的抑制效應(yīng)。2004年，ShengdianWang等人通過(guò)突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B7-Hl通過(guò)其IgV樣區(qū)與PD-l的IgV樣區(qū)相互結(jié)合而發(fā)揮作用(圖2，3)。同時(shí)，ChristianBlank等發(fā)現(xiàn)干預(yù)B7-Hl與PD-l間的相互作用，可以增強(qiáng)腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的功能。同時(shí)，有很多文獻(xiàn)資料表明，阻斷B7-H1，可以誘導(dǎo)腫瘤組織的退行性發(fā)展，但并不僅僅依賴PD-1途徑。1.53PD-1與PD-L參與T、B細(xì)胞負(fù)調(diào)控作用機(jī)制對(duì)體外轉(zhuǎn)染PD-l或FcYRII-PD-l融合蛋白基因的B淋巴瘤細(xì)胞系的研究表明，PD-1可抑制B細(xì)胞受體的刺激性信號(hào)。BCR與PD-l的交聯(lián)可抑制Ca^內(nèi)流以及下游信號(hào)激活分子如Syk、磷脂酰肌醇-3激酶、磷脂酶-3和Vav的酪氨酸殘基的磷酸化。但是，這種抑制效應(yīng)不需要PD-1胞漿區(qū)ITIM基序內(nèi)的酪氨酸殘基參與，而是通過(guò)C端的酪氨酸殘基與SHP-2酪氨酸磷酸酶結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。此外，PD-1也可通過(guò)抑制絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的酪氨酸殘基磷酸化而抑制B淋巴瘤細(xì)胞系的增殖。另外，對(duì)Jurkat細(xì)胞系的研究也表明TCR與PD-1的交聯(lián)可引起SHP-2的磷酸化并向PD-1的胞漿區(qū)募集。體外應(yīng)用預(yù)激活的T細(xì)胞表明PD-L/PD-1途徑并不引起T細(xì)胞的凋亡，而僅使細(xì)胞周期停滯于GO/Gl期。以改良的酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，PD-1的胞漿區(qū)的ITIM酪氨酸殘基磷酸化后可與酪氨酸磷酸酶SHP-1的羧基端的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合。因此，PD-1胞漿區(qū)兩個(gè)酪氨酸殘基磷酸化后可分別與SHP-l和SHP-2結(jié)合發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)控功能。2PD-1與疾病2.1PD-1與腫瘤用可溶性PD-1阻斷B7-H1可改善小鼠體內(nèi)抗肝癌細(xì)胞(H22腫瘤細(xì)胞)免疫反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用可溶性PD-1阻斷B7-H1可改善部分淋巴細(xì)胞的早期活化。PD-L1在多種組織的腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)，它與PD-1的相互作用顯示了腫瘤免疫逃避的潛在的機(jī)理。B7-H1與PD-1之間的作用，抑制了激活的T細(xì)胞的作用，可能是通過(guò)抑制細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的，腫瘤相關(guān)的B7-m提高了抗原特異性T細(xì)胞的凋亡，致使腫瘤逃避免疫監(jiān)視。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，在鼠P815腫瘤上表達(dá)的B7-H1促進(jìn)了激活的腫瘤反應(yīng)T細(xì)胞的凋亡，并促使體內(nèi)與免疫生成B7-H1(+)腫瘤的生長(zhǎng)。PD-1與PD-L1相互作用降低了TCR介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。PD-1表達(dá)在多種人與鼠的腫瘤細(xì)胞上，并且被IFN-Y刺激上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，以可溶性PD-1阻斷PD-1/PD-L1通路，增強(qiáng)了腫瘤特異性CTL的殺傷活性。而且，以單克隆抗體阻斷PD-1/PD-L1相互作用，逆轉(zhuǎn)了由腫瘤抗原特異性€08+T細(xì)胞功能表失引起的腫瘤耐受，加強(qiáng)了抗腫瘤免疫反應(yīng)。2.2PD-1與腫瘤侵潤(rùn)的免疫細(xì)胞Thompson等對(duì)RCC(renalcellcarcinoma)腫瘤樣本以抗PD-1單抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單核免疫細(xì)胞侵潤(rùn)占病人總數(shù)的50.9%。PD-1免疫細(xì)胞占總病人數(shù)的56.6%。而且RCC腫瘤細(xì)胞不表達(dá)PD-1。PD-1免疫細(xì)胞對(duì)于B7-H1相關(guān)的腫瘤細(xì)胞有保護(hù)作用。因此，PD-1(+)免疫細(xì)胞增強(qiáng)了腫瘤的轉(zhuǎn)移，與腫瘤惡性程度的分級(jí)有關(guān)。免疫細(xì)胞上表達(dá)PD-1的水平在高風(fēng)險(xiǎn)RCC腫瘤病人身上是提高的，PD-1/PD-L1促進(jìn)了RCC腫瘤的發(fā)生。B7-H1與B7DC在非小細(xì)胞腫癌中表達(dá)，并且B7-H1陽(yáng)性的腫瘤區(qū)域內(nèi)的腫瘤侵潤(rùn)的淋巴細(xì)胞(TIL)的數(shù)量明顯少于B7-H1陰性的腫瘤區(qū)，B7H1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞區(qū)域表達(dá)PD-1的TIL的比例明顯低于B7H1陰性腫瘤細(xì)胞區(qū)域。這或許是由于PD-1/PD-L1通路致使TIL凋亡所致。2.3PD-1與自身免疫性疾病PD-1分子在維持外周耐受發(fā)揮了重要的作用，因而PD-1分子可作為一個(gè)免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)控分子參與自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程。這一點(diǎn)已在不同遺傳背景的PD-1基因敲除小鼠中得到證實(shí)。C57BL/6-PD-卜鼠發(fā)生輕微但漸進(jìn)性的脾腫大，脾臟的B細(xì)胞及髓樣細(xì)胞增多，血清的IgA和IgG2b增加，IgG3增加尤為顯著，機(jī)體對(duì)TI-2抗原的抗IgG3抗體反應(yīng)顯著增強(qiáng)。脾臟的B細(xì)胞對(duì)抗IgM抗體誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)也增強(qiáng)。C57BL/6-PD-rA鼠可隨年齡的增長(zhǎng)而自發(fā)地發(fā)生狼瘡樣增殖性腎小球腎炎和關(guān)節(jié)炎，腎小球有過(guò)度的補(bǔ)體C3和IgG3的沉積，踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)顆粒性結(jié)節(jié)及骨損傷，而同齡同窩對(duì)照鼠則表現(xiàn)正常。當(dāng)同時(shí)導(dǎo)入Fas基因無(wú)義突變時(shí)，小鼠提早發(fā)生增殖性狼瘡樣自身免疫性疾病，疾病的嚴(yán)重程度也大大增加。這一結(jié)果表明PD-l和Fas在狼瘡樣自身免疫性疾病的發(fā)生過(guò)程中具有協(xié)同作用。自身反應(yīng)性TCR(2C-TCR)轉(zhuǎn)基因鼠在剔除PD-1基因后可自發(fā)發(fā)生移植物抗宿主樣疾病，部分小鼠10周前死亡。其余則表現(xiàn)為體重減輕，脾腫大，不同程度的皮膚損害炎癥、出血和壞死。病變鼠的心臟、肺及腎臟可發(fā)生系統(tǒng)性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。2(:-丁01+T細(xì)胞浸潤(rùn)至表皮的基底層。由于2C-TCR-PD-r7—鼠的T細(xì)胞在胸腺的陰性選擇過(guò)程中未受影響，而外周擴(kuò)增的2C-TCR+T細(xì)胞呈現(xiàn)記憶細(xì)胞表型(CDRBlowCD62LlowCD69+)，因而作者認(rèn)為PD-1可能參與維持外周耐受。2C-TCR-PD-1+/+鼠表現(xiàn)正常，可見PD-1基因缺陷是發(fā)生移植物抗宿主樣疾病的重要原因。大部分的BALB/c-PD-l一鼠在10周齡時(shí)因患充血性心力衰竭而死亡，但207^^0-1+'+和8八1^/(^0-1-/--1^0-2鼠則生長(zhǎng)良好。胸腔超聲檢査顯示，死亡小鼠的心室腔明顯擴(kuò)張，心室的收縮功能下降。組織學(xué)檢查顯示整個(gè)擴(kuò)張的心室的心肌細(xì)胞間遍布IgG及補(bǔ)體C3的沉積，但卻沒(méi)有淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。進(jìn)一步的研究表明，自身抗體主要是針對(duì)一種表達(dá)于正常心肌細(xì)胞表面的相對(duì)分子質(zhì)量為33000的蛋白，與同遺傳背景的PD-l"+對(duì)照鼠相比，BALB/c-PD-rA鼠的血清中也可檢測(cè)到這種蛋白。這些結(jié)果表明，PD-l在防止BALB/c鼠發(fā)生自身免疫性擴(kuò)張性心肌病方面發(fā)揮了重要作用。對(duì)不同基因背景的PD-1基因缺陷鼠的研究證實(shí)PD-1在體內(nèi)發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用。C57BLP6-PD-1基因缺陷鼠發(fā)生輕度持續(xù)性脾腫大，B細(xì)胞及髓系細(xì)胞增多，血lgG3升高及針對(duì)T細(xì)胞非依賴性抗原的IgG3反應(yīng)增強(qiáng)，抗IgM誘導(dǎo)的脾B細(xì)胞增生反應(yīng)增強(qiáng)。C57BLP6-PD-1基因缺陷鼠發(fā)生進(jìn)行性腎小球腎炎及狼瘡樣關(guān)節(jié)炎，在腎小球中可檢出PAS陽(yáng)性物質(zhì)及IgG3沉積。BALBPC-PD-1基因缺陷鼠發(fā)生擴(kuò)張性心肌病，心動(dòng)超聲顯示這些鼠心臟明顯擴(kuò)大，收縮功能嚴(yán)重受損，并發(fā)現(xiàn)IgG廣泛沉積于心肌細(xì)胞間，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞表面有IgG沉積。此外，血液中出現(xiàn)針對(duì)正常心肌表面33000的蛋白的抗體，提示某些不明原因的人擴(kuò)張性心肌病可能與自身免疫反應(yīng)有關(guān)。阻斷NOD鼠的PD-l或PD-L1會(huì)加速處于糖尿病前期的各年齡段雌性鼠糖尿病的發(fā)生，在大齡鼠中更為明顯。而阻斷CTLA-4僅誘使幼齡鼠發(fā)病，提示CTLA-4僅在自身免疫反應(yīng)發(fā)生的早期發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而PD-1在自身免疫發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段均有作用。與對(duì)照組相比，阻斷PD1/PD-L1后，胰島炎癥評(píng)分明顯增高，產(chǎn)生IFN-Y的GAD反應(yīng)性脾細(xì)胞增多，但抗胰島素抗體并不增高。N0D鼠的胰島細(xì)胞上表達(dá)PD-L1，不表達(dá)PD-L2，提示胰島細(xì)胞自身表達(dá)的PD-L1是調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T細(xì)胞活性的重要因素。在由MOG誘導(dǎo)的EAE(實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎)C57BLP6模型研究中，阻斷PD-1會(huì)使疾病加重，伴隨腦組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多，同時(shí)，針對(duì)MOG的自身免疫反應(yīng)加強(qiáng)，產(chǎn)生IFN-Y的T細(xì)胞增多，發(fā)型超敏反應(yīng)增強(qiáng)，血中抗MOG抗體水平升高。與NOD鼠不同的是，阻斷PD-L2而非PD-L1可導(dǎo)致疾病加重。PD-L1在EAE發(fā)病早期即開始表達(dá)，而PD-L2表達(dá)較晚且表達(dá)量很少。實(shí)驗(yàn)性哮喘模型的研究支持這一結(jié)果，在肺組織中PD-L1表達(dá)遠(yuǎn)比PD-L2豐富，而PD-L2阻斷可使疾病加重。那么，PD-L1在這些組織中的高表達(dá)有何意義仍待進(jìn)一步研究。Hitachi等在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)積液中發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞PD-1表達(dá)明顯高于CD8+T細(xì)胞，CD4+PD-1+T細(xì)胞大多數(shù)同時(shí)表達(dá)CTLA-4，而不表達(dá)CD26。CD4+PD-1+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-IO，與CD4+PD-1T細(xì)胞相比，其產(chǎn)生的IL-2明顯減少。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)積液含有豐富的PD-1+T細(xì)胞，這一亞群的T細(xì)胞是無(wú)反應(yīng)性的。2.3PD-1與病毒感染用微陣分析和流式細(xì)胞術(shù)，Barber等發(fā)現(xiàn)PD-l在LCMV慢性感染鼠的功能耗竭性CD8+T細(xì)胞(exhaustedCD8Tcell)上高表達(dá)，而急性感染的功能記憶性CD8+T細(xì)胞上不表達(dá)。PD-L1在多種感染的細(xì)胞上高表達(dá)，在慢性LCMV感染的小鼠上以阻斷性單抗阻斷PD-1/PD-L1通路，加強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞功能，激活了CTL活性，導(dǎo)致IFN和TNF的產(chǎn)生。Day等檢測(cè)了HIV感染的特異性CD8+T細(xì)胞的PD-l的表達(dá)，他們選擇的人群是沒(méi)有抗HIV治療的HIV患者。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HIV特異的CD8T細(xì)胞上PD-1明顯高表達(dá)，且這種表達(dá)與對(duì)HIV特異性CD8+T細(xì)胞功能破壞程度正相關(guān)，并與疾病發(fā)生過(guò)程相關(guān)。阻斷PD-1/PD-L1通路增強(qiáng)HIV特異性CD4+、CD8+T細(xì)胞功能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，構(gòu)建人程序性死亡蛋白-1-IgV(hPD-l-IgV)融合蛋白，使其在體內(nèi)外能夠與其相應(yīng)的配體PD-L1相互結(jié)合，從而阻斷體內(nèi)PD-1/PD-L1通路，打破腫瘤免疫逃避，并恢復(fù)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的殺傷功能，為研制抗腫瘤藥物提供新的思路和途徑。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明所釆用的技術(shù)方案是一種可溶性人程序性死亡蛋白-1-IgV，其特征在于，其蛋白序列如下PPTFFPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVL麗YRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSWRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSP。上述可溶性人禾，性死亡蛋白-1-IgV的制備方法，其特征在于，根據(jù)人PD-1的結(jié)構(gòu)，應(yīng)用人工合成的方法獲得了hPD-l-IgV的基因，目的基因克隆入pQE-30原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在大腸桿菌中高效表達(dá)，裂菌顯示目的蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)包涵體洗滌、親和層析、凝膠柱層析和透析復(fù)性，即可獲得純化的可溶性人程序性死亡蛋白-l墨I(xiàn)gV。以經(jīng)純化后得到的可溶性的目的蛋白hPD-l-IgV分別以酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)shPD-lIgV與PD-L1的結(jié)合，以及檢測(cè)shPD-lIgV與抗PD-L1單抗競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PD-L1。MTT法檢測(cè)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。以shPD-lIgV治療荷瘤小鼠，測(cè)量腫瘤體積，觀察其抑瘤效果。以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)荷瘤小鼠各組中外周血中CD4+CD25+T(Treg)細(xì)胞占總CD4十T細(xì)胞的比例。'結(jié)果顯示shPD-lIgV可分別與商品化的mPD-Ll/Fc和hPD-Ll/Fc結(jié)合，并且shPD-lIgV可與腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的PD-L1結(jié)合，shPD-lIgV可與抗PD-L1單抗競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合mPD-Ll/Fc。以shPD-lIgV治療的荷瘤小鼠分離的CTL與對(duì)照組比較有明顯的殺傷腫瘤細(xì)胞作用。shPD-lIgV治療的荷瘤小鼠與對(duì)照組比較表現(xiàn)了明顯的抑瘤效果，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，而且對(duì)照組的荷瘤小鼠外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞的比例明顯高于shPD-lIgV治療組，為進(jìn)一步的腫瘤治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和奠定了基礎(chǔ)。具體內(nèi)容是1、合成hPD-l-IgV基因序列分析Swiss-Pro蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)PD-1的結(jié)構(gòu)，結(jié)合文獻(xiàn)，截取PD-1胞外斷IgV結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，獲得PD-l胞外斷IgV的氨基酸序列(命名為hPD-l-IgV):PPTFFPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSG丁YLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSP按照Gene-bank公布的人PD-l-IgV的基因序列，5端插入5awHI酶切位點(diǎn)，3端引進(jìn)中止密碼子TGA并插入^/I酶切位點(diǎn)，依據(jù)大腸桿菌偏愛的密碼子，合成目的基因。pQE-30原核表達(dá)載體來(lái)自JieruMeng，NanMa等(參考文獻(xiàn)JieruMeng，NanMaetal.NGREnhancedtheAnti-AngiogenicActivityoftum-5.[J]J.Biochem.140，(2006))。通過(guò)BamHI和Sail雙酶切將hPD-l-IgV基因克隆入表達(dá)載體并克隆入載體pGEX-4T-l中。2.構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE-30/hPD-l-IgV將pGEX-4T-l/hPD-l-IgV載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒DNA后，將其與質(zhì)粒pQE-30分別用5awHI和Sfl/I進(jìn)行雙酶切。取上述pGEX-4T-l/hPD-l-IgV獲得的小片段(hPD-l-IgV)與從pQE-30中酶切的大片段相連接。酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，分別回收pGEX-4T-l獲得的小片段和pQE-30中的大片段。將回收后的小片段和大片段用T4連接酶在16'C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，鋪板、培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和DNA測(cè)序，獲得含有hPD-l-IgV融合基因原核克隆載體，命名pQE-30/hPD-l-IgV。3.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定3.1pQE-30/hPD-l-IgV工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將含有pQE-30-hPD-lIgV重組質(zhì)粒的菌株，接種于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37'C培養(yǎng)過(guò)夜，次日按in/。的比例轉(zhuǎn)接于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37'C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C46QQnm=0.4-0.6)時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，于37。C振蕩培養(yǎng)3-5h。離心收集菌體，SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。3.2目的蛋白包涵體的分離和純化取10g誘導(dǎo)的菌體，按lg濕重對(duì)7ml的比例，用裂解緩沖液STE(50mmol/LTris.ClpH8.0，50mmol/LNaCl，lmmol/LEDTA)重懸，-20°〇冷凍過(guò)夜。次日于室溫水浴中融化，參照分子克隆第三版溶菌酶法裂菌，接著再采用300W超聲破菌，其中超聲5s，間隔10s，共進(jìn)行100次。超聲完成后，12000rpm/min，4。C離心20min，棄除上清，沉淀用包涵體洗滌液A(l%TritonX-100，lmmol/LEDTA，1%D0C，50mmol/LTris.ClpH8.5，100mmol/LNaCl)重懸，12000r/min4。C離心20min，棄上清。用Ni-NTA柱親和層析純化所溶解的沉淀(包涵體)。按lg菌體加10ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲裂菌。12000rpm,離心15min，棄上清，lg沉淀加10ml6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.Olmol/LTris(pH7.5)。4。C攪拌過(guò)夜，12000rpm，離心15min,共離心2次，收集上清待用。經(jīng)洗滌的包涵體以lg濕重對(duì)10ml的比例，溶于6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.Olmol/LTrispH7.5的緩沖液中，4'C攪袢過(guò)夜，12000r/min離心30min，收集上清，即為目的蛋白粗提液。SephacrylS-300(1.6cmX80cm)凝膠層析，以工作液(6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.Olmol/LtrispH7.5)充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脫，流速lml/min，收集含有目的蛋白的峰，然后進(jìn)行親和層析純化。用6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4,O.Olmol/LTris(pH7.5)充分平衡M柱，先用含10mmol咪唑的6M尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.Olmol/LTris(pH7.5)洗脫雜蛋白，再用含250腿ol咪唑的6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.Olmol/LTris(pH7.5)洗脫目的蛋白。收集洗脫峰，純化產(chǎn)物透析至2M尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.Olmol/LTris(pH7.5)復(fù)性，終濃度lmg/ml。最后透析入0,02mol/LPBS(pH7.2)中，用Lowery法測(cè)定蛋白濃度。3.3目的蛋白的復(fù)性應(yīng)用包涵體溶解液稀釋親和層析后的樣品，使蛋白濃度約為0.1mg/ml，梯度透析，透析外液加入CuS04和p—巰基乙醇作為氧化還原系統(tǒng)，4。C透析，每6小時(shí)換液一次，梯度為，4M尿素，2M尿素，1M尿素，最后透析到雙蒸水，離心留上清，凍干。HPLC檢測(cè)蛋白純度。圖1是重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。其中，圖(A)是重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-30-rhPD-lIgV的酶切鑒定，圖中的標(biāo)記1:DNAmarker(DL2000)，2:pQE-30-rhPD-lIgVdigestedby5flwHI和Sa/I;圖(B)是rhPD-lIgV區(qū)的克隆策略；酶切載體pGEX-4T-l-rhPD-lIgV和pQE-30，經(jīng)連接獲得重組融合表達(dá)載體pQE-30-rhPD-lIgV，以載體pQE-30-rhPD-lIgV轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，用^^HI和Sa/I進(jìn)行雙酶切鑒定圖(A)，獲得與預(yù)期結(jié)果一致大小的插入片段。經(jīng)華諾生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序證實(shí)，該插入片段的基因序列圖(B)與預(yù)期完全一致。圖2是蛋白質(zhì)的表達(dá)純化與鑒定。其中，圖(A)中的標(biāo)記為1:分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，2:pQE-30空質(zhì)粒，3:誘導(dǎo)后的rhPD-lIgV，4:裂菌上清，5:裂菌沉淀。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，穩(wěn)定篩選，構(gòu)建工程菌。經(jīng)發(fā)酵后，收集大量菌體，裂菌顯示目的蛋白以包涵體形式存在(圖A)，經(jīng)對(duì)包涵體洗滌，SephacrylS-300凝膠柱層析(圖B)親和層析(圖C)，SDS-PAGE顯示蛋白單一條帶(圖D)，Western-blot鑒定顯示能與抗His單克隆抗體特異性結(jié)合(圖E)。HPLC分析表明其純度大于95。/。。圖3是融合蛋白hPD-lIgV體外分子水平與鼠或人B7-Hl/Fc(mB7-Hl/Fc或hB7-Hl/Fc)結(jié)合檢測(cè)。結(jié)合ELISA表明shPD-lIgV能夠分別與hB7-Hl/Fc和mB7-Hl/Fc結(jié)合(圖A，B)。shPD-lIgV能夠與包被每孔100nghB7-Hl/Fc和mB7-Hl/Fc有效的結(jié)合，結(jié)合呈現(xiàn)劑量依賴性，表明明shPD-lIgV能夠與hB7-Hl/Fc和mB7-Hl/Fc結(jié)合，而且，在1000ngshPD-lIgV的劑量下，shPD-lIgV與hB7-Hl/Fc或mB7-Hl/Fc結(jié)合呈現(xiàn)飽和。競(jìng)爭(zhēng)EUSA結(jié)果顯示shPD-lIgV可以阻斷hB7-Hl/Fc與抗hB7-Hl單抗的結(jié)合(圖C)。100ng抗hB7-Hl單抗與100nghB7-Hl/Fc共同孵育后，增力卩shPD-lIgV的劑量可以減少抗hB7-Hl單抗與hB7-Hl/Fc的結(jié)合。其中，shPD-lIgV增加到800ng后，阻斷作用趨于平緩。圖4是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)融合蛋白hPD-lIgV細(xì)胞水平上與B7-Hl的結(jié)合。其中(A)陰性對(duì)照，(B)SP2/0細(xì)胞，(C)HT-29細(xì)胞；shPD-lIgV能夠與細(xì)胞表面上的B7-Hl結(jié)合(圖4)。與對(duì)照比較，shPD-lIgV能夠與SP2/0細(xì)胞(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)表達(dá)的B7-H1結(jié)合，結(jié)合率為12%，而且shPD-lIgV能夠與IFN-Y刺激的HT-29細(xì)胞表達(dá)的B7-Hl結(jié)合，結(jié)合率為15.6%。圖5是MTT法檢測(cè)融合蛋白hPD-lIgV激起的CTL殺傷活性。與對(duì)生理鹽水照組比較，治療組(劑量I組，劑量II組，劑量III組)具有明顯的CTL殺傷活性，分別是52.3%，55.4%和56.1%。CTX組的CTL殺傷活性明顯高于對(duì)照組，但是明顯低于治療組。表1是各組CTL殺傷活性比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>圖6是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)荷瘤小鼠外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。其中，圖(A)是生理鹽水對(duì)照組，圖(B)是劑量I組，圖(C)是劑量II組，圖(D)是劑量劑量III組，圖(E)是對(duì)照直方圖；與生理鹽水對(duì)照組比較，治療組外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例明顯減少(圖A,B，C，D，E，)，表2是CD4CD25Treg百分比。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>各治療組中外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例分別是24.8%、19.7%、18.2%，明顯低于對(duì)照組的28.3%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，治療組各組與對(duì)照組比較有明顯差異，po.05。同時(shí)，與治療n組和治療m組比較，治療i組有明顯差異，p<o.05。但是，治療治療ii組和治療m組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p>o.05。圖7是hPD-lIgV融合蛋白對(duì)SP2/0荷瘤的小鼠的抑瘤作用。圖中，aP<0.05，與生理鹽水組比較；eP<0.05，與CTX組比較；應(yīng)用shPD-lIgV對(duì)BALB/c荷瘤鼠治療10天，結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，治療組有顯著性差異(P<0.05)，但是，5mg/Kg治療組與10mg/Kg治療組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與15mg/Kg治療組都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí)，治療組與環(huán)磷酰胺(CTX)組比較也有顯著性差異(P<0.05)。以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩的詳細(xì)描述。具體實(shí)施方式4.融合蛋白PD-1-IgV的構(gòu)建、表達(dá)及純化4.1PD-1-IgV基因的設(shè)計(jì)分析Swiss-Pro蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)PD-1的結(jié)構(gòu)，結(jié)合文獻(xiàn)，截取PD-1胞外斷IgV結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，獲得PD-1胞外斷IgV的氨基酸序列(命名為hPD-l-IgV)。按照Gene-bank公布的人PD-l-IgV的基因序列，5端插入5awHI酶切位點(diǎn)，3端引進(jìn)中止密碼子TGA并插入^/I酶切位點(diǎn)，依據(jù)大腸桿菌偏愛的密碼子，合成目的基因。合成的基因序列，GAAGACCTGAAGGTTCAGCATAGTAGCTACAGACAGCGTGCCCGGCTGGACTACAAGCGAATTACTGTGAAAGTCAATTGAGTCGAC其蛋白序列為PTAHPSP。目的基因被克隆入pGEX-4T-l載體(上海生工生物技術(shù)公司合成并提供)。4.1.1感受態(tài)細(xì)胞的制備取DH5a甘油菌種按1:100的比例接種入的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)接一次，繼續(xù)培養(yǎng)至OD柳約0.4左右。(無(wú)菌操作)將菌液冰浴10min，離心(3000卬mX5min，4°C)后棄去上清，加入1/2體積預(yù)冷的100mmol/LCaCl2，輕輕吹起沉淀，冰浴40min，離心(3000rpmX5min，4'C)，棄上清后加入1/25體積的含25%甘油的100mmol/LCaCl2，吹起沉淀，分裝入Eppendorf管中，-7(TC保存?zhèn)溆谩?.1.2感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)將大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞從-7(TC中取出，冰浴融解5-10分鐘，加入含有目的基因的pUC57，輕微混勻，繼續(xù)冰浴30分鐘，然后鋪板，37。C培養(yǎng)過(guò)夜。4.1.3質(zhì)粒的提取與鑒定在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后37'C過(guò)夜培養(yǎng)的培養(yǎng)皿上挑取邊緣整齊，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的克隆，接種到10ml含Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)8小時(shí)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用BawHI和雙酶切后，行瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有插入片斷以及插入的片斷是否與預(yù)期的長(zhǎng)度一致，將酶切鑒定陽(yáng)性的克隆送上海博亞公司進(jìn)行DNA測(cè)序。4.2重組質(zhì)粒pQE-30/hPD-1-IgV的構(gòu)建、表達(dá)、純化和復(fù)性4.2.1重組質(zhì)粒pQE-30/hPD-1-IgV的構(gòu)建將pGEX-4T-l/hPD-l-IgV載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒DNA后，將其與質(zhì)粒pQE-30分別用^^HI和Sa/I進(jìn)行雙酶切。取3.1中所述pGEX-4T-l獲得的小片段與從pQE-30中的大片段相連接。酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，分別回收pGEX-4T-l獲得的小片段和pQE-30中的大片段。將回收后的小片段和大片段用T4連接酶在16"C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，鋪板、培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和DNA測(cè)序，獲得含有hPD-l-IgV融合基因原核克隆載體，命名pQE-30/hPD-l-IgV。4.2.2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定4.2.2.1pQE-30/hPD-l-IgV工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將含有pQE-30-hPD-lIgV重組質(zhì)粒的菌株，接種于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37'C培養(yǎng)過(guò)夜，次日按l。/。的比例轉(zhuǎn)接于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37'C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期"6(K)nm=0.40.6)時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，于37'C振蕩培養(yǎng)3-5h。離心收集菌體，SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。4.2.2.2目的蛋白包涵體的分離和純化取10g誘導(dǎo)的菌體，按lg濕重對(duì)7ml的比例，用裂解緩沖液STE(50mmol/LTris.ClpH8.0，50mmol/LNaCl，lmmol/LEDTA)重懸，-20。C冷凍過(guò)夜。次日于室溫水浴中融化，參照分子克隆第三版溶菌酶法裂菌，接著再釆用300W超聲破菌，其中超聲5s，間隔10s，共進(jìn)行100次。超聲完成后，12000rpm/min，4'C，離心20min，棄除上清，沉淀用包涵體洗滌液A(l%TritonX-100，lmmol/LEDTA，1%D0C，50腿ol/LTris.ClpH8.5，10Ommol/LNaCl)重懸，12000r/min4r離心20min，棄上清。用Ni-NTA柱親和層析純化所溶解的沉淀(包涵體)。按lg菌體加10ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲裂菌。12000rpm，離心15min，棄上清，lg沉淀加10ml6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.Olmol/LTris(pH7.5)。4"C攪拌過(guò)夜，12000rpm，離心15min，共離心2次，收集上清待用。經(jīng)洗滌的包涵體以lg濕重對(duì)10ml的比例，溶于6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.Olmol/LTrispH7.5的緩沖液中，4。C攪拌過(guò)夜，12000r/min離心30min，收集上清，即為目的蛋白粗提液。S印hacrylS-300(1.6cmX80cm)凝膠層析，以工作液(6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.Olmol/LTrispH7.5)充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脫，流速lml/min，收集含有目的蛋白的峰，然后進(jìn)行親和層析純化。用6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01moI/LTris(pH7.5)充分平衡Ni柱，先用含10mmol咪唑的6M尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris(pH7.5)洗脫雜蛋白，再用含250mmol咪唑的6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris(pH7.5)洗脫目的蛋白。收集洗脫峰，純化產(chǎn)物透析至2M尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris(pH7.5)復(fù)性，終濃度lmg/ml。最后透析入0.02mol/LPBS(pH7.2)中，用Lowery法測(cè)定蛋白濃度。4.2.3目的蛋白的復(fù)性應(yīng)用包涵體溶解液稀釋親和層析后的樣品，使蛋白濃度約為0.1mg/ml，梯度透析，透析外液加入CuS04和P—巰基乙醇作為氧化還原系統(tǒng)，4'C透析，每6小時(shí)換液一次，梯度為，4M尿素，2M尿素，1M尿素，最后透析到雙蒸水，離心留上清，凍干。HPLC檢測(cè)蛋白純度。5.融合蛋白hPD-l-IgV體外活性檢測(cè)5.1融合蛋白hPD-l-IgV體外分子水平上的檢測(cè)5.1.1ELISA檢測(cè)shPD-1IgV與hB7Hl/Fc結(jié)合活性取復(fù)性后的shPD-lIgV倍比稀釋后包被96孔板，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，4'C包被過(guò)夜，封閉2h，洗滌6次*2分鐘/次，每孔加入100nghB7-Hl/Fc，室溫lh，洗漆6次*2分鐘/次，加入抗hB7-Hl單抗，室溫lh，洗滌6次，每次2分鐘，加抗鼠二抗，室溫30min，洗滌6次，每次2分鐘/次，OPD顯色后檢測(cè)^49o皿值，實(shí)驗(yàn)中以無(wú)關(guān)his融合蛋白為對(duì)照。方法歩驟如下包被取96孔ELISA板，將倍比稀釋后的shPD-lIgV融合蛋白溶解于包被緩沖液中，4'C包被過(guò)夜；倒掉包被液，加入封閉液，室溫封閉2h;棄去封閉液，用洗滌液洗6次，每次2min;分別小鼠抗人B7-H1單抗(500嗎/mL)100pL/孔，室溫孵育lh;棄去單抗，用洗滌液洗6次，每次3min;加入HRP標(biāo)記的抗小鼠二抗，100pL/孔，室溫孵育lh;棄去二抗，用洗滌液洗6次，每次3min;加入底物顯色液，100nL/孔，室溫，顯色10-20min;加入終止液，50pL/孔，終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀讀數(shù)，測(cè)定每孔在490nm的吸光值。5.1.2ELISA檢測(cè)shPD-1IgV與mB7Hl/Fc結(jié)合活性96孔板包被不同濃度的mB7-Hl/Fc，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，4。C包被過(guò)夜，封閉2h,洗滌6次*2分鐘/次，每孔加入500ugshPD-lIgV，室溫lh，洗滌6次*2分鐘/次，加入抗his單抗，室溫lh，洗滌6次*2分鐘/次，加抗鼠二抗，室溫30min，洗滌6次*2分鐘欣，OPD顯色后檢測(cè)爿490nm值，實(shí)驗(yàn)中以無(wú)關(guān)his融合蛋白為對(duì)照。5.1.3ELISA檢測(cè)shPD-lIgV對(duì)hB7-Hl/Fc與抗hB7Hl單抗的競(jìng)爭(zhēng)活性96孔板包被100nghB7-Hl/Fc，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，4'C包被過(guò)夜，封閉2h，洗滌6次*2分鐘/次，每孔加入倍比稀釋的shPD-lIgV和100ng抗hB7-Hl單抗，室溫lh，洗滌6次*2分鐘/次，加抗鼠二抗，室溫30min,洗滌6次*2分鐘/次，OPD顯色后檢測(cè)A^nm值，實(shí)驗(yàn)中以無(wú)關(guān)his融合蛋白為對(duì)照。5.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞水平上檢測(cè)融合蛋白hPD-lIgV與B7Hl結(jié)合活性人HT-29細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為20ng/mL的IFN-Y，刺激2天后HT-29細(xì)胞高表達(dá)B7-H1分子；小鼠SP2/0細(xì)胞(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)低表達(dá)B7-H1蛋白。以shPD-lIgV融合蛋白流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與HT-29細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞表達(dá)的B7-H1結(jié)合。方法步驟如下分別制備HT-29細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞懸液，用10%FCSRPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5xl06-lxl07/ml。取4(^1細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性抗HismAb(5-50W)的小玻璃管或塑料離心管，再加50pll:20(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清，4'C30min。用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右(1000rpmx5min)。棄上清，加入50pl工作濃度的羊抗鼠熒光標(biāo)記物，充分振搖，4'C30min。用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右(1000rpm*5min)。加500nl固定液。試劑配制如下DPBS(IOX，ie存液):NaCl:80g，KC1:2g，Na2HP04:U.5g，KH2P04:2g，蒸餾水加至1000mL，臨用前稀釋。洗滌液DPBSX1:900mL，F(xiàn)CS:50mL，4%NaN3:50mL。固定液DPBSX1:1000mL，Glucose:20g,Formaldehyde:10mL，NaN3:0.2g。6.融合蛋白hPD-1-IgV體內(nèi)活性觀察6.1接種腫瘤細(xì)胞BALB/c小鼠，共40只，體重18-22g，雄性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)的SP2/0腫瘤細(xì)胞，按照1><107個(gè)細(xì)胞/只接種至小鼠背部皮下。每天觀察小鼠體內(nèi)腫瘤體積變化，待觀察到形成腫瘤后進(jìn)行分組。6.2荷瘤小鼠分組選取腫瘤體積大小均一的荷瘤小鼠，剔除腫瘤體積太大或太小的荷瘤小鼠。將其隨機(jī)分5組，每組6只。生理鹽水組對(duì)照組；劑量I組每kg鼠重5mgshPD-lIgV融合蛋白；劑量II組每kg鼠重10mgshPD-lIgV融合蛋白；劑量m組每kg鼠重15mgshPD-lIgV融合蛋白；設(shè)環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組。6.3給藥方式和劑量腹腔注射，生理鹽水組每i2小時(shí)給生理鹽水一次，治療組(劑量i組，劑量n組，劑量m組)按照劑量每12小時(shí)給藥一次，環(huán)磷酰胺(CTX)組每24小時(shí)給藥一次。連續(xù)IO天，每天測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，按下列公式計(jì)算腫瘤體積TV(mm3)=axb、兀/6，其中，a為腫瘤長(zhǎng)徑，b為與a垂直的短徑。6.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4，細(xì)胞的比例各組荷瘤小鼠，眼球取血，每毫升血中加1.5-2.4mgEDTA防止凝血。取100pl抗凝血，分別加抗CD4和CD25的直標(biāo)抗體，室溫避光20-30min。加2ml紅細(xì)胞裂解液(82.9g/LNH4Cl，10g/LKHCO3，370mg/LEDTA)，輕輕混勻，室溫放置10min。4°C，1000r/min離心5min，棄上清。力口2ml洗滌液(8g/LNaCl，0.2g/LKCl，U5g/LNa2HP04，0.2g/LKH2PO4，5%FCS，4%NaN3)，輕輕混勻，4°C，1000r/min離心5min，棄上清。重復(fù)一次。力口500nl固定液(8g/LNaCl，0.2g/LKCl'1.15g/LNa2HP04，0.2g/LKH2PO4，2%葡萄糖，1%甲醛，0.02%NaN3)。FCM檢測(cè)外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。6.5MTT法檢測(cè)CTL殺傷活性a.脾細(xì)胞的分離最后一次測(cè)量腫瘤體積后，斷頸法處死小鼠，無(wú)菌條件下打開腹腔取脾。將脾浸入生理鹽水中，在80目鋼網(wǎng)上輕輕研磨，收集脾細(xì)胞。1500r/min離心15min，棄上清。加入紅細(xì)胞裂解液(Tris-NH4C1，0.16mol/L的NH4Cl和0.17mol/L的Tris按9:1的比例混合，調(diào)？11=7.2)，作用lmin，迅速加入生理鹽水，洗2遍。用含100U/ml青霉素，100ng/ml鏈霉素，10%FBS，50U/mlIL-2的RPMI1640重懸，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)后待用。b.CTL的活化腫瘤細(xì)胞經(jīng)50tig/ml絲裂霉素C預(yù)處理，與脾細(xì)胞共培養(yǎng)，10%FCS，RPMI培養(yǎng)基，100U/ml青霉素，100pg/ml鏈霉素。在第0，2，4天加入IL-2(2units/ml)。5天后，收集非貼壁細(xì)胞，用來(lái)測(cè)定殺傷活性。c.MTT檢測(cè)殺傷活性將腫瘤細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞的濃度加入到96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，將制備的脾細(xì)胞按12.5:1和25:l以及50:l的比例加入到上述96孔板中。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37°C，5%(:02孵箱培養(yǎng)7211。棄去培養(yǎng)基，每孔加入50plMTT反應(yīng)液(0.5mg/ml無(wú)血清I640培基)。37°C，5。/。CC)2孵箱培養(yǎng)4h。棄去MTT反應(yīng)液，每孔加入lOOnlDMSO,室溫振蕩10min。酶標(biāo)儀測(cè)490nm處的吸光值(A值)。計(jì)算殺傷率。6.6SPSS統(tǒng)計(jì)分析對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，方差分析?？扇苄訟^m性死亡蛋白-i-igV的蛋白序列PTAHPSP。權(quán)利要求1.一種可溶性人程序性死亡蛋白-1-IgV，其特征在于，其蛋白序列如下PPTFFPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSP。2.權(quán)利要求1所述的可溶性人程序性死亡蛋白-1-IgV的制備方法，其特征在于，根據(jù)人PD-1的結(jié)構(gòu)，應(yīng)用人工合成的方法獲得了hPD-l-IgV的基因，目的基因克隆入pQE-30原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在大腸桿菌中高效表達(dá)，裂菌顯示目的蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)包涵體洗滌、親和層析、凝膠柱層析和透析復(fù)性，即可獲得純化的可溶性人程序性死亡蛋白-l-IgV。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)及純化的步驟如下1)pQE-30/hPD-l-IgV工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將含有pQE-30-hPD-lIgV重組質(zhì)粒的菌株，接種于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37'C培養(yǎng)過(guò)夜，次日按l。/。的比例轉(zhuǎn)接于10ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37。C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)460tomK).4-0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為lmmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，于37t:振蕩培養(yǎng)3-5h，離心收集菌體，SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定；2)目的蛋白包涵體的分離和純化取10g誘導(dǎo)的菌體，按lg濕重對(duì)7ml的比例，用裂解緩沖液STE重懸，裂解緩沖液為50mmol/LTris.Cl，50mmol/LNaCl，lmmol/LEDTA，裂解緩沖液STE重懸后于-20。C凍過(guò)夜，次日于室溫水浴中融化，以溶菌酶法裂菌，接著再采用300W超聲破菌，其中超聲5s，間隔10s，共進(jìn)行100次；超聲完成后，12000rpm/min、4'C離心20min，棄除上清，沉淀用包涵體洗滌液A重懸，包涵體洗滌液A為l%TritonX-100，lmmol/LEDTA，1%D0C,50mmol/LTris.ClpH8.5，10Ommoi/LNaCl,12000r/min、4。C離心20min，棄上清；用Ni-NTA柱親和層析純化所溶解的沉淀，按lg菌體加10ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲裂菌，12000rpm，離心15min，棄上清，lg沉淀加10ml6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris，4'C攪拌過(guò)夜，12000rpm，離心15min，共離心2次，收集上清待用；經(jīng)洗滌的包涵體以lg濕重對(duì)10ml的比例，溶于6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.01mol/LTris的緩沖液中，4。C攪拌過(guò)夜，12000r/min、離心30min，收集上清，即為目的蛋白粗提液；以S印hacrylS-300凝膠層析，以工作液充分平衡后，所述的工作液為6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，O.Olmol/LTris;目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脫，流速lml/min，收集含有目的蛋白的峰，然后進(jìn)行親和層析純化；用6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris充分平衡Ni柱，先用含10mmol咪唑的6M尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris洗脫雜蛋白，再用含250mmol咪唑的6mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris洗脫目的蛋白，收集洗脫峰，純化產(chǎn)物透析至2M尿素，以0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/LTris復(fù)性，終濃度lmg/ml，最后透析入0.02mol/LPBS中，用Lowery法測(cè)定蛋白濃度；3)目的蛋白的復(fù)性應(yīng)用包涵體溶解液稀釋親和層析后的樣品，使蛋白濃度約為0.1mg/ml，梯度透析，透析外液加入CuS04禾叩一巰基乙醇作為氧化還原系統(tǒng)，4'C透析，每6小時(shí)換液一次，梯度為，4M尿素，2M尿素，1M尿素，最后透析到雙蒸水，離心留上清，凍干，HPLC檢測(cè)蛋白純度。全文摘要本發(fā)明公開了可溶性人程序性死亡蛋白-1-IgV及其制備方法，可溶性人程序性死亡蛋白-1-IgV的蛋白序列如下PPTFFPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDSRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSP。本發(fā)明根據(jù)人PD-1的結(jié)構(gòu)，應(yīng)用人工合成的方法獲得了hPD-1-IgV的基因，目的基因克隆入pQE-30原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在大腸桿菌中高效表達(dá)，裂菌顯示目的蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)包涵體洗滌、親和層析、凝膠柱層析和透析復(fù)性，即可獲得純化的可溶性人程序性死亡蛋白-1-IgV。該可溶性人程序性死亡蛋白-1-IgV在體外shPD-1IgV在細(xì)胞水平和分子水平上可分別與mPD-L1/Fc和hPD-L1/Fc結(jié)合。在體內(nèi)shPD-1IgV具有一定的抑瘤效果。因此，shPD-1IgV具有良好的體內(nèi)外生物學(xué)活性，為治療腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有潛在的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C07K14/435GK101215329SQ20081001723公開日2008年7月9日申請(qǐng)日期2008年1月4日優(yōu)先權(quán)日2008年1月4日發(fā)明者包春杰,吳守振,張英起,萌李,王偉華,鑫秦,薛曉暢,葦韓申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)