專利名稱：用于篩選蛋白可溶性表達(dá)的t載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于高通量篩選蛋白可溶性表達(dá)的T載 體及其構(gòu)建方法，還涉及該T載體在基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
PCR(Polymerase chain reaction)是分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域中的常規(guī) 實(shí)驗(yàn)技術(shù)，是目前基因克隆，基因或DNA片段研究的必經(jīng)之路。克隆PCR產(chǎn)物最直接、最方便 的方法是T/A克隆。所謂T/A克隆就是將;T端具有單個(gè)A尾巴的PCR產(chǎn)物克隆到;T端具 有單個(gè)T尾巴的T載體上。在PCR擴(kuò)增過程中，由于Taq酶具有不依賴于模板的末端轉(zhuǎn)移酶 活性而在PCR產(chǎn)物的3、端添加單個(gè)脫氧核苷酸，并且偏好添加四種脫氧核苷酸中的腺嘌呤 脫氧核苷酸(A)，從而便得50%以上的PCR產(chǎn)物的3、末端具有單個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸，即 3、端 A尾巴(Clark JM. Novel non-templated nucleotide additonreactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNApolymerases. Nucleic Acids Res. 1988，16(20) 9677-9686 ；Schutte BC, Ranade K，Pruessner J，Dracopoli N. Optimizedconditions for cloning PCR products into an XcmI T-vector. BioTechnique. 1997,22(1) :40_42 ; Ichihara YiKurosawa Y. Construction of new T vectors for direct cloning of PCR products. Gene. 1993，130 (1) : 153—154.)。因此，幵發(fā)出一種3、末端帶一突出“Τ”的特殊載體——T載體，用于克隆Taq酶 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，以克服傳統(tǒng)克隆技術(shù)載體容易自連，克隆效率低，篩選陽性克隆難度大， 實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高等缺點(diǎn)。根據(jù)構(gòu)建策略的不同，T載體制備方法有3種方法一是利用產(chǎn)生平 末端的內(nèi)切酶將環(huán)狀質(zhì)粒酶切成線狀質(zhì)粒，然后利用末端轉(zhuǎn)移酶將單個(gè)雙脫氧胸腺核苷 酸(ddTTP)添加到線狀載體的 3、末端(Holton TA，Graham MW. A simple and efficient method for direct cloning of PCR productsusing ddT—tailed vectors. Nucleic Acids Res. 1991,19(5) :1156.)。方法二是利用Taq酶的不依賴于模板的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在不 存在脫氧腺嘌呤核苷酸(dATP)的情況下有相對(duì)良好的;T末端加“T”的能力，將單個(gè)脫氧 胸腺核苷酸(dTTP)添加到線狀載體的端(Marchuk D，Drumm M，Saulino A，Collins FS.Construction ofT-vectors, a rapid and general system for direct cloning ofunmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991，19 (5) :1154·)。方法三是在質(zhì)粒 載體的多克隆位點(diǎn)引入特定的酶切位點(diǎn)，用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生;T具有單個(gè)T突出的 線性T載體。理論上，可以用來制備T載體的內(nèi)切酶包括Xcm I、Ahd I /Eami 105 I / EclHK I /AspE I NruG I /BspOVKBfi I /Bmr I、Hph I /AsuHP I、Mbo II /Ncu I、 Bfu I /Bci VI、HpyA V /Hin4 II等。其中Xcm I和Ahd I及其同裂酶在制備T載體中廣 泛應(yīng)用。其它內(nèi)切酶不是因?yàn)樘嘿F，就是因?yàn)樵谄胀寺≥d體上有太多的識(shí)別位點(diǎn)，因而 在制備T載體的應(yīng)用中受到限制。目前常用的T載體大多為商品化的載體，這些T載體基本上可以滿足PCR產(chǎn)物克 隆的要求，但要進(jìn)行蛋白表達(dá)、純化以及對(duì)蛋白突變體進(jìn)行篩選還需要尋找更有利的載體。
在大腸桿菌系統(tǒng)中，異源蛋白重組表達(dá)最大瓶頸之一是過量表達(dá)的目標(biāo)蛋白由 于低的水溶性或不正確的折疊，導(dǎo)致形成沒有任何生物學(xué)活性的包涵體。蛋白定向進(jìn)化 是克服這一難題使目標(biāo)蛋白以水溶態(tài)形式表達(dá)的有力而有效的工具(Wigley WC, et al, Proteinsolubility and folding monitored in vivo by structuralcomplementation of a genetic marker protein. Nat Biotechno1. 2001，19(2) : 131-136 ；Yang JK， Park MS，Waldo GS, Suh SW. Directedevolution approach to a structural genomics project :Rv2002from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2003， 100(2) 455-460 ；Pedelacq JD, Piltch E， Liong EC， BerendzenJ, Kim CY， Rho BS， Park MS，Terwilliger TC, Waldo GS. Engineering soluble proteins for structural genomics. NatBiotechnol. 2002, 20(9) :927_932 ；Esteban 0，Zhao H. Directedevolution of soluble single-chain human class IIMHC molecules. J Mol Biol. 2004，340 (1) 81-95.)。定向進(jìn)化技術(shù)早已應(yīng)用在改善酶的專一性、熱穩(wěn)定性和結(jié)合其它蛋白的親和 性。近年來，此技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物中的應(yīng)用日益受到重視。許多成功的例子表明該技術(shù)可 以用于改善蛋白的水溶性，效果顯著，其中一些蛋白的晶體結(jié)構(gòu)還得到解(Kaur J，et al, Directed evolution :an approach to engineerenzymes. Crit Rev Biotechnol. 2006， 26(3) 165-199 ；Hart DJ, Tarendeau F.Combinatorial library approaches for improvingsoluble protein expression in Escherichia coli.ActaCrystallogr D Biol Crystallogr.2006,62(1) 19-26 ；RoodveldtC，et al, Directed evolution of proteins for heterologousexpression and stability. Curr Opin Struct Biol.2005, 15(1) :50-56.)。蛋白定向進(jìn)化包括兩個(gè)關(guān)鍵性的步驟首先，突變體文庫的構(gòu)建，保證 有足夠的突變體以供篩選；其次，有高通量的、靈敏的篩選方法，即篩選方法方便，容易 實(shí)施，即使目標(biāo)蛋白溶解度微小的變化都能檢測(cè)到。C端融合α-肽是篩選突變體的一 種方法，已有一些成功的例子(Jiang SM, Li CH, Zhang WW, Cai YH, Yang YL, Yang S， Jiang WH. Directed evolution and structural analysisof N-carbamoyl-D-amino acid amidohydrolase provide insightsinto recombinant protein solubility in Escherichia coli. Biochem. J. 2007,402 (3) :429_437.)，但其對(duì)比度不高。已報(bào)道的報(bào) 告蛋白還有綠色熒光蛋白GFP、珊瑚綠色熒光蛋白ZsGreen、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和二氫葉 酸還原酶(Waldo GS. Improving proteinfolding efficiency by directed evolution using the GFP foldingreporter. Methods Mol Biol. 2003,230 343-359 ；Heddle C， etal， Development of a screening platform for directed evolutionusing the reef coral fluorescent protein ZsGreen as asolubility reporter.Protein Eng Des Sel.2007，20(7) 327-337 ；Maxwell KL et al, A simple in vivo assay for increased proteinsolubility.Protein Sci. 1999,8(9) 1908-1911 ；Liu JW, BoucherY, Stokes HW, Ollis DL. Improving protein solubility :the useof the Escherichia coli dihydrofolate reductase gene as afusion reporter. Protein Expr Purif. 2006, 47(1) :258-263.)。但是這些報(bào)告蛋白都存在一些不足首先，胞內(nèi)熒光顯示強(qiáng)度不高、熒 光對(duì)比度小、產(chǎn)生熒光遲滯，如GFP在48h后菌落才產(chǎn)生明顯的熒光；其次，胞外檢測(cè)試劑的 最佳濃度難以確定，其與上游靶蛋白分子量、水溶性及表達(dá)量有關(guān)。所以需要尋找一種可以 進(jìn)行高通量篩選的、對(duì)比度高的報(bào)告蛋白。
尿卟啉原甲基化酶(Uroporphyrinogen methyltransferase, UPMT)編碼基因 為cobA，是微生物合成西羅血紅素、血紅素dl、F430因子和維生素B12等卟吩烷類化合 物的重要調(diào)控酶，植物中尿卟啉原甲基化酶(UMPT)負(fù)責(zé)西羅血紅素生物合成的調(diào)控。 已證明UPMT存在于大部分細(xì)菌、真菌包括酵母和高等植物中(Blanche F, Debussche L, Thibaut D, Crouzet J and Cameron B. Purification andcharacterization of S-adenosyl-L-methionine :uroporphyrinogenlII methyltransferase from Pseudomonasdenitrificans. J. bacterial. 1989,171 (8) 4222-4231. ；Raux E,Mcveigh T, Peters SE,et al. The role of Saccharomycescerevisiae Metlp and Met8p in siroheme and cobalaminbiosynthesis. Biochem J，1999，338 :701_708.)。在高等植物中，它由核 基因編碼，翻譯后的蛋白前體運(yùn)輸?shù)饺~綠體或質(zhì)體中(LeustekT，Smith M，Murillo M，et al. Siroheme biosynthesis in higherplants. Analysis of an S-adenosyl-L-methioni ne-dependenturoporphyrinogen III methyltransferase from Arabidopsisthatiana.J Biol Chem, 1997,272(5) :2744_2752.)。大腸桿菌的CysGA、費(fèi)氏丙酸桿菌薛氏亞種UPMT， 擬南芥UPMT在大腸桿菌重組表達(dá)時(shí)，菌落在長紫外光下顯示強(qiáng)烈紅色熒光，體外檢測(cè)主要 成分是前咕啉-2 和三甲基咕啉(Warren MJ, Stolowich NJ, Santander PJ, Roessner CA, Sowa BA, Scott Al. Enzymatic synthesis ofdihydrosirohydrochlorin (precorrin-2) and of a novelpyrrocorphin by uroporphyrinogen III methylase. FEBSLett. 1990, 261 (1)76-80. ；Sattler I, Roessner CA. , StolowichNJ, Hardin SH, Harris-Haller Lff, Yokubaitis NT. Cloning, sequence and expression of the uroporphyrinogen 11Imethyltransferase cobA gene of Propionibacteriumfreudenreichii(shermanii). J. Bacteriol. 177(1995) 1564-1569)。大腸桿菌的cysGA、費(fèi)氏丙酸桿菌薛氏亞種cobA可作 為紅色焚光J艮告基因(Charles A. Roessner. Use of cobA and cysGA asRed Fluorescent Indicators. Methods in MolecularBiology. 2002. vol. 183)，用于重組質(zhì)粒的篩選 (Roessner CA andScott Al. Fluorescence-based method for selection ofrecombinant plasmids. Biotechniques. 1995，19(5) :760_764)，還可在大腸桿菌、酵母和動(dòng)物中作為 轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因(ffildt, S. andDeuschle, U. cobA, a red fluorescent transcriptional reporterfor Escherichia coli, yeast and mammalian cells. Nat. Biotech. 1999,17 1175-1178)。玉米UPMT的功能基因片段已經(jīng)確定，其功能基因片段在大腸桿菌重組表達(dá) 會(huì)在細(xì)胞中積累西羅葉綠三酸和過甲基化產(chǎn)物三甲基咕啉，它們?cè)谧贤夤庀庐a(chǎn)生強(qiáng)烈 紅色熒光，這種性質(zhì)可用于重組質(zhì)粒的篩選(Fan J，Wang DQ，Liang Z，et al. Maize uroporphyrinogen III methyltransferase :overexpression of the functional genefragments in Escherichia coli and one-step purification. Proteins Expr Purif. 2006,46(1) 40-46. ；Pan HY,Cheng Y，Zhu Sffand Fan J. Improved the solubility of Maize Uroporphyrinogen III methyltransferase as the red fluorescent indicator bysite-directed mutagenesis. Chinese Journal of Biotechnology,2007,23(2) 206-210.)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了在蛋白定向進(jìn)化領(lǐng)域中對(duì)水溶性/折疊強(qiáng) 的蛋白突變體進(jìn)行篩選的一種高通量、靈敏度高、方便篩選的T載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的第一目的是提供一種用于篩選蛋白可溶性表達(dá)的T載體，在出發(fā)載體 pMAL-c2x中引入6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽、多克隆位點(diǎn)序列(MCS)和編碼紅色熒光蛋白UPMT 的cobA基因序列，其中多克隆位點(diǎn)序列與cobA基因融合，所述多克隆位點(diǎn)序列中含有兩個(gè) 隱藏有3、突出T末端的Eamll05 I酶切位點(diǎn)，用Eamll05 I酶切，切膠純化可以方便的得 到成熟的T載體。所述多克隆位點(diǎn)序列(MCS)位于cobA基因端的上游與cobA基因融合。所述多克隆位點(diǎn)序列(MCS)含有兩個(gè)Eamll05 I酶切位點(diǎn)，兩個(gè)Eamll05 I酶切 位點(diǎn)之間有間隔序列。所述6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽序列為CATCACCATCACCATCAT。所述6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽和多克隆位點(diǎn)序列(MCS)為
_5] Oim 纖 tfeilllll:^IMgiGACGGTACGTClmm^ciGACGGAGCGTC|
g jGGTACC[ ggatcc |tCTAGA| gtcgac jCTGCAG本發(fā)明的第二目的是提供一種構(gòu)建用于篩選蛋白可溶性表達(dá)的T載體的方法，包 括如下步驟(1)同義突變出發(fā)載體pMAL-c2x上Amp抗性基因中的Eamll05 I酶切位點(diǎn)。方法 為用突變引物1(加框的序列為Eamll05 I突變前的識(shí)別區(qū)域，陰影部分為引入的突變的 堿基)-CTACAC0ACGGGGAG面 AGGCAACTATGGATG-3~ ；突變引物 2 -CATCCATAGTTGCCTGGCTCCCCGTCGTGTAG"3~，以 pMAL_c2x 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增， Dpnl消化過夜，純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，搖菌提質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證獲得序列無誤的突 變體質(zhì)粒，命名為pMuAmp-c2x。(2)用限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切含有編碼紅色熒光蛋白UPMT的基因 cobA的質(zhì)粒pMF+cobA，切膠回收800左右的小片段。(3)將回收的cobA基因裝入用限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切的 pMuAmp-c2x，重組質(zhì)粒命名為pUPMT。(4)用定點(diǎn)突變的方法在cobA基因上游插入組氨酸(His)標(biāo)簽和多克隆位點(diǎn)序 列(MCS)，制備前表達(dá)T載體。方法為用突變引物3 (陰影部分表示組氨酸(His)標(biāo)簽，下
劃線和方框表示不同的酶位點(diǎn)):5'-c|GACGGAGCGTC|gggtacc jGGATCC[ tctaga[GTCGAC
突變引物 4 :5' -cicgag |GACGTACCGTC| GCIAGC《舊麵i纖纏-3'，以 pUPMT 質(zhì)
粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化6000bp左右的PCR產(chǎn)物，對(duì)其5、端磷酸化后連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5 a，涂平板過夜培養(yǎng)，紫外燈下挑選最紅的菌斑，搖菌提質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序(上海英駿生 物公司)檢測(cè)獲得序列無誤的突變體質(zhì)粒，命名為pUPMT-EamTA。
(5)用Eamll05 I酶切前表達(dá)T載體，制得成熟的表達(dá)T載體，命名為 pUPMT-Eam-T。其中，多克隆位點(diǎn)序列與cobA基因融合，且多克隆位點(diǎn)序列中含有兩個(gè)隱藏有3、 突出T末端的Eamll05 I酶切位點(diǎn)，用Eamll05 I酶切，切膠純化可以方便的得到成熟的T 載體。本發(fā)明的第三個(gè)目的是用于篩選蛋白可溶性表達(dá)的T載體在篩選水溶性/折疊強(qiáng) 的蛋白突變體中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明所構(gòu)建的用于篩選蛋白可溶性表達(dá)的T載體，帶有 強(qiáng)的Ptac啟動(dòng)子，可以對(duì)PCR產(chǎn)物直接用于克隆、表達(dá)、純化；特別地，可以對(duì)水溶性強(qiáng)/超 折疊的蛋白突變體進(jìn)行方便地篩選。


圖 1 為 pUPMT-Eam-T 構(gòu)建圖；圖2為菌落顏色與融合蛋白(MBP及其突變體/ a肽)水溶性的相關(guān)性驗(yàn)證；圖3為菌落顏色與融合蛋白(MBP及其突變體/UPMT)水溶性的相關(guān)性驗(yàn)證；圖4為體外測(cè)定帶a片段的融合蛋白的0 -半乳糖苷酶活性；圖5為C端融合UPMT蛋白菌株的熒光測(cè)定。
具體實(shí)施例方式1、C端融合a -肽與蛋白水溶性的相關(guān)性驗(yàn)證(1)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)建麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)三種突變體折疊缺陷型和兩種包 涵體 MBP 突變體(Betton JM, Hofnung M. Foldingof a mutant maltose-binding protein of Escherichia coli whichforms inclusion bodies. The Journal of Biological Chemistry. 1996,271 (14) 8046-8052 ；Bajaj K, Chakrabarti P, VaradarajanR. Mutagenesis-based definitions and probes of residue burialin proteins.Proc Natl Acad Sci USA. 2005,102(45) :16221_16226.)。(2)構(gòu)建野生型及突變體MBP的C端與a -肽融合表達(dá)載體。野生型MBP與a -肽 融合表達(dá)載體，命名為MBP WT;折疊缺陷型MBP與a-肽融合表達(dá)載體，命名為G32D，即將 麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)第32位的甘氨酸(G)突變?yōu)樘於彼?D)；兩種包涵體MBP與a -肽 融合表達(dá)載體，命名分別為A264D和G32D/I33P，即MBP第264位的丙氨酸(A)突變?yōu)樘於?氨酸⑶和MBP第32位的甘氨酸(G)突變?yōu)樘於彼?D)，第33位的異亮氨酸⑴突變?yōu)?脯氨酸(P)。用TaKaRa公司提供的TaKaRa MutanBEST Kit試劑盒，以pMAL_c2x為模板分 別做定點(diǎn)突變，按說明書操作。(3)菌落顏色與融合蛋白(MBP及其突變體/ a肽)水溶性的相關(guān)性驗(yàn)證。野生型 及突變體MBP的C端與a -肽融合表達(dá)載體，即MBPWT、G32D、A264D及G32D/I33P分別轉(zhuǎn) 化E. coli ToplO感受態(tài)，用無菌涂布棒均勻涂布于事先制備好的含有100iig/mL Amp、40g/ mLX-gal和90g/mL IPTG的LB平板，37°C下暗培養(yǎng)16 18h。待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊 的單菌落時(shí)拿出平板。平板顯示A264D，G32D/I33P (兩個(gè)包涵體MBP)菌斑均顯示為白色； G32D (折疊缺陷MBP)菌斑顯示淺藍(lán)色；MBP WT(野生型MBP)菌斑顯示亮藍(lán)色。結(jié)果初步表明帶a片段的水溶性/折疊性增強(qiáng)的突變體胞內(nèi)表現(xiàn)出更強(qiáng)的半乳糖苷酶活性，菌斑 顏色更亮。說明菌斑的顏色與融合蛋白的折疊/水溶性相關(guān)。(4)體外測(cè)定帶a片段的融合蛋白的0 _半乳糖苷酶活性。將含有MBP WT、G32D、 A264D及G32D/I33P質(zhì)粒的E. coli ToplO單克隆菌株分別接種于含有Amp的5mL的LB液 體培養(yǎng)基中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，凍融法細(xì)胞破碎，以鄰硝基苯3-D-半乳吡喃糖苷(0NPG)為底 物，在體外測(cè)定融合蛋白a互補(bǔ)形成的半乳糖苷酶活性，一個(gè)酶活單位定義為每個(gè)細(xì) 胞每分鐘分解liimol 0NPG所需要的酶量。帶a片段的融合蛋白0 _半乳糖苷酶活性大 小依次為A264D，G32D/I33P (兩個(gè)包涵體MBP) < G32D (折疊缺陷MBP) < MBP WT(野生型 MBP)。結(jié)果表明帶a片段的水溶性/折疊性增強(qiáng)的突變體表現(xiàn)出更強(qiáng)的半乳糖苷酶 活性，其結(jié)果與平板試驗(yàn)中的菌斑顏色的變化相一致，進(jìn)一步證明通過菌斑的顏色可以反 應(yīng)上游蛋白的折疊/水溶性。2、C端融合UPMT與蛋白水溶性的相關(guān)性驗(yàn)證(1)構(gòu)建野生型及突變體MBP的C端與紅色熒光蛋白UPMT融合表達(dá)載體。純化的 cobA基因片段用Pst I /HindIII雙酶切分別裝入用相應(yīng)酶切MBP WT、G32D、A264D及G32D/ I33P質(zhì)粒中。用Pst I /HindIII雙酶切篩選重組子。篩選出的重組子標(biāo)記為MBP WT+UPMT， G32D+UPMT，A264D+UPMT 和 G32D/I33P+UPMT。S卩MBP WT+UPMT 為野生型 MBP 與 UPMT 融合表 達(dá)載體；G32D+UPMT為折疊缺陷MBP與UPMT融合表達(dá)載體；A264D+UPMT和G32D/I33P+UPMT 為兩種包涵體MBP與UPMT融合表達(dá)載體。(2)菌落顏色與融合蛋白(MBP及其突變體/UPMT)水溶性的相關(guān)性驗(yàn)證。野生 型及突變體MBP的C端與紅色熒光蛋白UPMT融合表達(dá)載體，即MBP WT+UPMT、G32D+UPMT、 A264D+UPMT及G32D/I33P+UPMT分別轉(zhuǎn)化E. coli ToplO感受態(tài)，用無菌涂布棒均勻涂布于 事先制備好的含有100 u g/mL Amp和90 u g/mL IPTG的LB平板，37°C下培養(yǎng)12 14h，待 出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時(shí)拿出平板，在紫外燈下觀察。平板顯示A264D+UPMT 和G32D/I33P+UPMT顯示微紅色菌斑；G32D+UPMT顯示淡紅色菌斑；MBP WT+UPMT顯示深紅色 菌斑。菌斑顏色表明帶UPMT的水溶性/折疊性增強(qiáng)的突變體胞內(nèi)表現(xiàn)出更強(qiáng)的酶活性，菌 斑顏色更亮，其結(jié)果與MBP/ a -肽融合蛋白菌斑顏色變化一致。說明菌斑顏色與融合蛋白 的折疊/水溶性相關(guān)，UPMT可以指示融合蛋白突變體的折疊和水溶性。(3)C端融合UPMT蛋白菌株的熒光測(cè)定。將含有pMal_c2x，MBPWT+UPMT, G32D+UPMT，A264D+UPMT 及 G32D/I33P+UPMT 質(zhì)粒的 E. coliToplO 或 DH5 a 單克隆菌株分別 接種于5mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，進(jìn)行蛋白熒光測(cè)定，以pMal-C2x (空質(zhì) 粒不含cobA基因)菌液為對(duì)照，用F-4500熒光分光光度儀(Hitachi，日本)分別測(cè)MBP WT+UPMT, G32D+UPMT, A264D+UPMT及G32D/I33P+UPMT每單位細(xì)胞的熒光產(chǎn)量，激發(fā)光為 357nm，發(fā)射光為620。熒光測(cè)定顯示兩個(gè)包涵體MBP/UPMT融合蛋白(即A264D+UPMT和 G32D/I33P+UPMT)有低的熒光值和對(duì)照產(chǎn)生的熒光值相近；其次為折疊缺陷MBP/UPMT融合 蛋白(即G32D+UPMT)較高，最高的為野生型MBP/UPMT融合蛋白(即MBP WT+UPMT)，其結(jié)果 與其菌斑顏色的變化結(jié)果一致，與MBP/ a -肽融合蛋白酶活測(cè)定的變化一致。說明帶UPMT 的水溶性/折疊性增強(qiáng)的突變體胞內(nèi)表現(xiàn)出更強(qiáng)的酶活性，菌斑產(chǎn)生的熒光更強(qiáng)，菌落熒 光與融合蛋白的折疊/水溶性相關(guān)，UPMT可以用于指示融合蛋白突變體的折疊和水溶性。
3、C端融合UPMT的表達(dá)T載體構(gòu)建
(1)利用定點(diǎn)突變方法對(duì)pMAL-c2x上Amp抗性基因中的Eamll05 I酶切位點(diǎn)進(jìn)行 同義突變以消除該酶切位點(diǎn)(以TaKaRa公司提供的TaKaRa MutanBEST Kit做定點(diǎn)突變)。 構(gòu)建方法如下一條PCR引物引入突變堿基，另一條引物設(shè)計(jì)成其互補(bǔ)引物，以pMAL-c2x質(zhì) 粒為模板，用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接加Dpnl消化過夜，純化產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，涂平板過夜培養(yǎng)，搖菌提質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證獲得序列無誤的突變體質(zhì) 粒,命名為pMuAmp-c2x。(2)用限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切含有編碼紅色熒光蛋白UPMT的基因 cobA的質(zhì)粒pMF+cobA，切膠回收800左右的小片段。(3)將回收的cobA基因裝入用限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切的 pMuAmp-c2x，重組質(zhì)粒命名為pUPMT。(4)利用定點(diǎn)突變的方法在cobA基因上游插入組氨酸(His)標(biāo)簽和多克隆位點(diǎn)序 列(MCS)，制備前表達(dá)T載體(以TaKaRa公司提供的TaKaRa MutanBEST Kit做定點(diǎn)突變)。 構(gòu)建方法如下在PCR引物中引入組氨酸(His)標(biāo)簽和多克隆位點(diǎn)序列(MCS)，以pUPMT質(zhì) 粒為模板，用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物為(陰影部分表示組氨酸(His) 標(biāo)簽，下劃線和方框表示不同的酶位點(diǎn))突變弓丨物3 :5'-c :|GACGGAGCGT(j gggtacc jGGATCCj TCTAGA [GTCGAC|- -3'突變引物4 =5'-CICGAGjGACGTACCGTC[GCIAGCPfel^^TGGTf -3'以 pUPMT
質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化6000bp左右的PCR產(chǎn)物，對(duì)其5、端磷酸化后連接，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5 a，涂平板過夜培養(yǎng)，紫外燈下挑選最紅的菌斑，搖菌提質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序(上海英駿 生物公司)檢測(cè)獲得序列無誤的突變體質(zhì)粒，命名為pUPMT-EamTA。(5)用Eamll05 I酶切前表達(dá)T載體，制得成熟的表達(dá)T載體，命名為 pUPMT-Eam-T。其中，模板pUPMT質(zhì)粒上自帶1個(gè)組氨酸標(biāo)簽CAT，Nde I (CATATG)、Pst I (CTGCAG)和Hind III三個(gè)酶切位點(diǎn)。多克隆位點(diǎn)序列與cobA基因融合，且多克隆位點(diǎn)序 列中含有兩個(gè)隱藏有3、突出T末端的Eamll05 I酶切位點(diǎn)，用Eamll05 I酶切，切膠純化 可以方便的得到成熟的T載體。
權(quán)利要求
一種用于篩選蛋白可溶性表達(dá)的T載體，其特征在于在出發(fā)載體pMAL c2x中引入6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽、多克隆位點(diǎn)序列(MCS)和編碼紅色熒光蛋白UPMT的cobA基因序列，其中多克隆位點(diǎn)序列與cobA基因融合，所述多克隆位點(diǎn)序列中含有兩個(gè)隱藏有3`突出T末端的Eam1105Ⅰ酶切位點(diǎn)，用Eam1105Ⅰ酶切，切膠純化可以方便的得到成熟的T載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的T載體，其特征在于所述多克隆位點(diǎn)序列(MCS)位于cobA基 因端的上游與cobA基因融合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的T載體，其特征在于所述多克隆位點(diǎn)序列(MCS)含有兩個(gè) Eaml 105 I酶切位點(diǎn)，兩個(gè)Eaml 105 I酶切位點(diǎn)之間有間隔序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的T載體，其特征在于所述6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽序列為 CATCACCATCACCATCAT。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一權(quán)利要求所述的T載體，其特征在于所述6個(gè)組氨酸(His) 標(biāo)簽和多克隆位點(diǎn)序列(MCS)為CATATGGCTAGC )GACGGTACGTC| CTCGAGC :^ACGGAGCGTC|g jGGTACCj ggatcc jTCTAGA| gtcgac jCTGCAG|
6.一種構(gòu)建用于篩選蛋白可溶性表達(dá)的τ載體的方法，其特征在于所述方法包括(1)同義突變出發(fā)載體PMAL-C2X上Amp抗性基因中的Eaml105 I酶切位點(diǎn)，用突變引 物1 5' -CTACAC :|GACGGGGAGpC[ AGGCAACTATGGATG-3'；突變引物 2 5“ -CATCCATAGTTGCCTGGCTCCCCGTCGTGTAG-3“，以 pMAL_c2x 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增，DpnI 消化過夜，純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，搖菌提質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證獲得序列無誤的突變體 質(zhì)粒,命名為pMuAmp-c2x。(2)用限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind III雙酶切含有編碼紅色熒光蛋白UPMT的基因cobA 的質(zhì)粒pMF+cobA，切膠回收800左右的小片段。(3)將回收的cobA基因裝入用限制性內(nèi)切酶NdeI和Hind III雙酶切的pMuAmp-C2x， 重組質(zhì)粒命名為pUPMT。(4)用定點(diǎn)突變的方法在cobA基因上游插入組氨酸(His)標(biāo)簽和多克隆位點(diǎn)序列 (MCS)，制備前表達(dá)T載體，用突變引物3 5' -C :^ACGGAGCGTC| GGGTACC [GGATCCt TCTAGA j^TCGAC|. -3'，突變引物 4 -CTCGAG jGACGTACCGTCl GCTAGC，以 pUPMT 質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化6000bp左右的PCR產(chǎn)物，對(duì)其5、端磷酸化后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α， 涂平板過夜培養(yǎng)，紫外燈下挑選最紅的菌斑，搖菌提質(zhì)粒，命名為pUPMT-EamTA。(5)用Eaml105 I酶切前表達(dá)T載體，制得成熟的表達(dá)T載體，命名為pUPMT-Eam-T。
7.權(quán)利要求1所述的用于篩選蛋白可溶性表達(dá)的T載體在篩選水溶性/折疊強(qiáng)的蛋白 突變體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白定向進(jìn)化領(lǐng)域中對(duì)水溶性/折疊強(qiáng)的蛋白突變體進(jìn)行篩選的一種高通量、靈敏度高、方便篩選的T載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明的T載體為在出發(fā)載體pMAL-c2x中引入6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽、多克隆位點(diǎn)序列(MCS)和編碼紅色熒光蛋白UPMT的cobA基因序列。本發(fā)明所構(gòu)建的用于篩選蛋白可溶性表達(dá)的T載體，帶有強(qiáng)的Ptac啟動(dòng)子，可以對(duì)PCR產(chǎn)物直接用于克隆、表達(dá)、純化；特別地，可以對(duì)水溶性強(qiáng)/超折疊的蛋白突變體進(jìn)行方便地篩選。
文檔編號(hào)C07K2/00GK101928719SQ20101020468
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者張寬亮, 范軍, 魏玲玲 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)