專(zhuān)利名稱(chēng)：結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因及其玉米表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因及其玉米表達(dá)載體和應(yīng)用， 屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的傳染性疾病，由結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)感染引起。全球大約有三分之一的人感染 過(guò)結(jié)核(大約21億)，每年新發(fā)病1000萬(wàn)人，卡介苗(BCG)作為預(yù)防結(jié)核病的 疫苗，近100年來(lái)雖然廣泛用于新生兒的預(yù)防接種，但保護(hù)率只有50%左右， 而對(duì)成年人的保護(hù)率在不同地區(qū)，在0 80°/。之間波動(dòng)；另外接種BCG還能使 少數(shù)人發(fā)生較嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)生播散性感染而致死。鑒于結(jié)核病發(fā)生的嚴(yán) 重態(tài)勢(shì)，加強(qiáng)結(jié)核病的防治工作、探索結(jié)核病的早期診斷及研制開(kāi)發(fā)新型預(yù) 防、治療的疫苗，已成為當(dāng)前國(guó)際乃至我國(guó)關(guān)注的緊迫而優(yōu)先的課題。
新型抗結(jié)核疫苗的研制，選取優(yōu)勢(shì)抗原最為重要。結(jié)核分枝桿菌的Hsp65 蛋白(熱休克蛋白65KD)屬于Hsp70家族，有很強(qiáng)的免疫原性，能誘導(dǎo)和增 強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫的發(fā)生，并可激活yST細(xì)胞，可以在動(dòng)物體 內(nèi)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染產(chǎn)生強(qiáng)烈的保護(hù)性免疫反應(yīng)，是人體感染結(jié)核桿菌 以后免疫系統(tǒng)的主要靶抗原和T細(xì)胞攻擊的主要對(duì)象。因此Hsp65是一種理想 的疫苗候選抗原。來(lái)源于結(jié)核分支桿菌Esat6是一種非常重要的T細(xì)胞免疫 原，是MTB培養(yǎng)早期分泌的相對(duì)分子質(zhì)量為6kD的早期分泌性抗原靶(6kD early secretory antigenic target, Esat6)，由結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)Y277片 段編碼，全長(zhǎng)288bp，編碼95個(gè)氨基酸。Esat6在機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答中， 通過(guò)活化巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞等釋放炎癥遞質(zhì)腫瘤壞死因子和 組胺等；并參與誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞分化、成熟并促進(jìn)y干擾素介導(dǎo)的Esat-6特 異性Thl細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)程。雖然Hsp65抗原和Esat6分別在感染免疫中的作用 已經(jīng)被研究證實(shí)有效,但對(duì)Esat6協(xié)同Hsp65抗原在結(jié)核桿菌感染中的免疫應(yīng) 答特點(diǎn)和保護(hù)力尚不清楚。轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器是利用基因工程重組技術(shù)和植物自生代謝原理 產(chǎn)生具有特殊功能的蛋白，常見(jiàn)的有人或動(dòng)物的保護(hù)性抗原蛋白、抗體和一 些重要的多肽等，它們具有重要藥用價(jià)值和商業(yè)市場(chǎng)。轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng) 器和微生物反應(yīng)器、動(dòng)物反應(yīng)器相比較具有生產(chǎn)成本低、表達(dá)產(chǎn)物具有天然 的生物活性、安全性好的優(yōu)點(diǎn)，這也是轉(zhuǎn)基因植物得到迅速發(fā)展的重要原因 之一。
啟動(dòng)子是調(diào)控外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)的開(kāi)關(guān)，它直接影響到外源基因 在植物體內(nèi)的豐度、表達(dá)組織或發(fā)育時(shí)期，所以，能否選擇到適宜受體植物 的啟動(dòng)子使其有較高的表達(dá)量，成為轉(zhuǎn)基因植物發(fā)展的一個(gè)瓶頸問(wèn)題。
植物表達(dá)啟動(dòng)子分為三種組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異型 啟動(dòng)子。目前在絕大多數(shù)雙子葉轉(zhuǎn)基因植物中廣泛使用的啟動(dòng)子是來(lái)源于花
椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子，單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來(lái)自玉米的 Ubiquitin啟動(dòng)子和來(lái)自水稻的Actinl啟動(dòng)子等。CaMV35S、 Actinl、 Ubiquitin等均為強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，控制外源的基因在轉(zhuǎn)基因植株的各個(gè)部 位和整個(gè)生育期表達(dá)。CaMV35S啟動(dòng)子在雙子葉植物中的表達(dá)效率高于單子 葉植物，而Actinl、 Ubiquitin等啟動(dòng)子在單子葉植物中的表達(dá)效率較高， 這可能與單、雙子葉植物，在轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子序列識(shí)別上有差異。
選擇合適的植物表達(dá)啟動(dòng)子，是解決表達(dá)量低的有效途徑，而選擇的依 據(jù)主要以受體材料的特性來(lái)決定。在植物基因工程研究中， 一個(gè)表達(dá)載體系 統(tǒng)是至關(guān)重要的。目前報(bào)道植物轉(zhuǎn)基因研究中多采用高效組成型啟動(dòng)子，如 CaMV35S、畫(huà)V啟動(dòng)子等，在它們調(diào)控下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中所有的發(fā) 育階段和所有的部位都能表達(dá)，這在轉(zhuǎn)抗病基因和抗蟲(chóng)基因時(shí)，會(huì)收到較好 的效果。但對(duì)表達(dá)特殊營(yíng)養(yǎng)成分的基因，例如表達(dá)乙肝抗原基因等，外源基 因在植物內(nèi)持續(xù)高效的表達(dá)，不僅造成營(yíng)養(yǎng)成分的浪費(fèi)，而且往往會(huì)造成植 物形態(tài)的改變，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)影響到植物的正常發(fā)育。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種結(jié)核Hsp65和Esat6融 合抗原基因。
本發(fā)明的另一 目的在于提供一種包含上述結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原 基因的玉米表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的再一 目的在于提供上述方法構(gòu)建的玉米表達(dá)載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗 原基因，其序列如SEQ ID N0.5所述。
一種包含了上述結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因的玉米表達(dá)載體的構(gòu) 建方法，包括以下步驟
(1) 根據(jù)人結(jié)核分支桿菌H37Rv株Hsp65和Esat6基因的編碼序列設(shè) 計(jì)融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的1對(duì)引物
上游引物序列為Pl 5' - TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTG - 3'，含 BglII酶切位點(diǎn)和起始密碼子ATG;
下游引物序列為P2 5' - GC TCTAGA CTATGCGAACATCCCAGTG - 3'，含 Xba I酶切位點(diǎn)和終止密碼子CTA;
(2) 以質(zhì)粒pEGFPHsp65-Esat6為模板，用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物Pl和 P2進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增Hsp65-linker-Esat6;
(3) pCR-G載體的構(gòu)建
用HindIII和BamHI分別雙酶切質(zhì)粒pUBCG和pCR 2. 1，經(jīng)瓊脂糖電泳 分離，從pUBCG酶切產(chǎn)物回收1. 4kb的玉米種子特異表達(dá)啟動(dòng)子Globulin-l， 從pCR 2. 1酶切產(chǎn)物回收3. 9kb的載體片段，將兩個(gè)回收片段連接、轉(zhuǎn)化獲 得重組質(zhì)粒pCR-G;
(4) pCAMBIA1300-nos-bar載體的構(gòu)建
用Sacl和EcoRI分別雙酶切質(zhì)粒pGFP-2和pUC18，經(jīng)瓊脂糖電泳分離， 從pGFP-2酶切產(chǎn)物中回收270bp的nos片段，從pUC18酶切產(chǎn)物中回收2. 6kb 的載體片段，將兩個(gè)回收片段以T4連接酶連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒pUC18-nos;用Xbal和EcoRI酶切pUC18-nos，回收含有nos及多克隆位點(diǎn)的DNA 片段，與經(jīng)相同處理的質(zhì)粒pC層BIA-1300連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒 pCAMBIA-1300-nos;
用XhoI酶切質(zhì)粒pMDXl，回收560bp的bar基因片段，用Xhol切除質(zhì) 粒pCAMBIA-1300-nos內(nèi)潮霉素抗性基因，回收pCAMBIA-1300-nos并進(jìn)行末 端脫磷酸；將bar基因片段與pCAMBIA-1300-nos連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒 pCAMBIA1300-nos-bar;
(5)中間載體pCRGHLE的克隆與構(gòu)建
用BamHI和Xbal分別雙酶切步驟(3)所得質(zhì)粒pCR-G和步驟(2)所 得Hsp65-linker-Esat6，經(jīng)瓊脂糖電泳分離，純化后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化篩選獲 得重組載體pCRGHLE;(6)目的載體pCAMBIA1300GHLE的克隆與構(gòu)建
用HindIII和Xbal雙酶切步驟(5)所得重組載體pCRGHLE，得到 globulin-1和Hsp65-linker-Esat6的聯(lián)合片段，將HindIII和Xbal雙酶切 步驟(4)所得pCAMBIA1300-nos-bar后的片段與上述聯(lián)合片段連接、轉(zhuǎn)化 篩選獲得目的載體pCAMBIA1300GHLE。
步驟(2)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在95'C預(yù) 變性5 min,然后進(jìn)入下列循環(huán)95°C、 30 s, 56°C、 50 s， 72°C、 90 s，共 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72"C延伸10min，擴(kuò)增完畢后置4'C終止反應(yīng)；所述混
合液組成如下
濃度為10umo1/1的上游引物Pl 1 y 1
濃度為lOumol/1的下游引物P2 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度
各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
pEGFPHsp65-Esat6 1 u 1
Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液 5 u 1
Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 3 u 1
滅菌水 37. 7 u 1
上述方法構(gòu)建的結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因玉米表達(dá)載體作為制 備疫苗的用途。該載體是植物雙元表達(dá)載體，可以攜帶結(jié)核Hsp65和Esat6 融合抗原基因被轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米幼胚，繼而獲得玉米轉(zhuǎn)基因 植株，也可以將結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因整合到植物基因組中，使 抗原基因在植物中正常表達(dá)出含有結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因的表達(dá) 蛋白質(zhì)作為口服疫苗。
本發(fā)明的原理是(l)改造質(zhì)粒pCR 2. 1，插入種子特異表達(dá)啟動(dòng)子 globulin-1;改造質(zhì)粒pCAMBIA1300，插入nos終止序列和選擇標(biāo)記bar基 因，除去原有的潮霉素抗性基因；將結(jié)核桿菌的優(yōu)勢(shì)抗原Hsp65和Esat-6 基因?qū)氲街参锉磉_(dá)載體pCAMBIA1300中， 一同導(dǎo)入表達(dá)載體的還有玉米胚 乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子glubulin-l基因和bar基因及nos終止子；(2) globulin-1是來(lái)源于玉米的特異性啟動(dòng)子，可以帶動(dòng)插入下游的外源基因在 玉米胚乳中大量表達(dá)；(3) pCAMBIA1300載體自帶的CaMV35S組成型啟動(dòng)子 也可以帶動(dòng)插入下游的外源基因在玉米胚乳中大量表達(dá)。
基因Hsp65和Esat6在NCBI中的登陸號(hào)為M15467和AF420491。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)本發(fā)明將
Hsp65和Esat6兩種抗原同時(shí)克隆到同一載體上，構(gòu)建含結(jié)核桿菌Hsp65和 Esat6的融合質(zhì)粒，以期融合Hsp65和Esat6 口服疫苗能比其中一種口服疫苗 單獨(dú)的免疫效果強(qiáng)；(2)本發(fā)明構(gòu)建由玉米種子特異表達(dá)啟動(dòng)子globulin-l 調(diào)控的結(jié)核優(yōu)勢(shì)抗原Hsp65和Esat6融合基因表達(dá)載體，使其特異、高效地 在玉米種子中表達(dá)，可以克服組成型啟動(dòng)子在應(yīng)用中的缺陷，這一研究在國(guó) 內(nèi)外鮮有報(bào)道；目前，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米幼胚，獲得部 分轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步研究利用轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)結(jié)核Hsp65和Esat6融合 抗原基因口服疫苗的免疫效果奠定基礎(chǔ)。


圖1是PCR擴(kuò)增的Hsp65-linker-Esat6圖。
圖2是表達(dá)載體pCAMBIA1300示意圖(含bar和nos終止子)。
圖3是中間載體pCRG示意圖。
圖4是重組載體pCAMBIA1300GHLE示意圖。
圖5是pCRG構(gòu)建示意圖。
圖6是pCAMBIA1300-nos-bar構(gòu)建示意圖。
圖7是pCAMBIA1300GHLE構(gòu)建示意圖。
圖8是pCRGHLE雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，
其中，1為pCRGHLE的hindIII和xbal雙酶切產(chǎn)物；M為lkb DNA ladder marker。
圖9是pCAMBIA1300GHLE雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，
其中，M為lkb DNA ladder marker; 1為pCAMBIA1300GHL質(zhì)粒；2為 pCAMBIA 1300GHLE的hindlll和xbal雙酶切產(chǎn)物；3為pCAMBIA1300單酶切 產(chǎn)物。
圖10是pCRG HindlII+BamHI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖， 其中，l-3為pCRG HindiII+BamHI雙酶切產(chǎn)物；M為250bp marker。 圖11是pCAMBIA1300-nos Xbal+EcoRI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖， 其中，1-3為pCAMBIA1300-nos的Xbal+EcoRI雙酶切產(chǎn)物；M為250bp marker 0
圖12是pCAMBIA1300-nos—bar Xhol單酶切瓊脂糖凝膠電泳圖， 其中，M為250bp marker; 1為pCAMBIA 1300—nos— bar的Xhol單酶切產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施 方式不限于此。
首先對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的說(shuō)明如下
質(zhì)粒pUBCG、 pGFP-2、 pUC18、 pCR 2. 1、 pCAMBIA1300 (均為廣東省農(nóng) 業(yè)科學(xué)院作物所玉米室提供)；pEGFPHsp65-Esat6 (本實(shí)驗(yàn)室保存)；玉米種 子特異表達(dá)啟動(dòng)子為本廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所玉米室自主分離。
大腸桿菌菌株XLl-blue (本實(shí)驗(yàn)室保存)；
試劑酶類(lèi)(大連寶生物公司)；試劑盒(質(zhì)粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物清 潔試劑盒，DNA膠回收純化試劑盒)(OMEGA); PCR引物合成(上海生工生物 工程公司)；重組質(zhì)粒上目的基因的序列測(cè)定(廣州拓譜公司)；
農(nóng)桿菌菌株LBA4404 (廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所玉米室提供)
培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)。YEB培養(yǎng)基用于農(nóng)桿菌的培養(yǎng)。
實(shí)施例1: Hsp65 — linker—Esat-6基因的克隆與質(zhì)粒載體的構(gòu)建
(1) 克隆基因引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)人結(jié)核分支桿菌H37Rv株Hsp65和Esat6基因的CDS序列設(shè)計(jì)融合 抗原基因Hsp65-linker-Esat6的1對(duì)引物，
上游引物序列為Pl 5' TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTG - 3'，含 BglII酶切位點(diǎn)和起始密碼子ATG;
下游引物序列為P2 5' - GC TCTAGA CTATGCGAACATCCCAGTG _ 3'，含 Xba I酶切位點(diǎn)和終止密碼子CTA.
(2) PCR反應(yīng)與克隆
以質(zhì)粒pEGFPHsp65-Esat6為模板，用引物PI, P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增 Hsp65-linker-Esat6,具體步驟如下將混合液在95。C預(yù)變性5 min，然后 進(jìn)入下列循環(huán)95°C、 30s，56°C、 50 s， 72°C、 90 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最 后72'C延伸10min，擴(kuò)增完畢后置4"C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下 濃度為10umo1/1的上游引物Pl 1 u 1
濃度為lOumol/1的下游引物P2 1 U 1濃度
各為2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
pEGFPHsp65-Esat6 1 u 1
Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液 5 u 1
Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 3 u 1
滅菌水 37. 7 u 1
PCR產(chǎn)物上樣電泳(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 7%的瓊脂糖)，回收1. 9KB的目的條 帶，如圖1所示，帶1為Hsp65-1 inker-Esat6片斷，帶2為T(mén)akara公司lkb DNA marker,用OMEGA PCR產(chǎn)物清潔試劑盒純化并溶于50ulddH20.
(3) pCR-G載體的構(gòu)建(構(gòu)建示意圖如圖5所示)
用Hindlll和BamHI分別雙酶切質(zhì)粒pUBCG和pCR 2. 1，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 8% 的瓊脂糖分離，從pUBCG酶切產(chǎn)物回收1.4kb的玉米種子特異表達(dá)啟動(dòng)子 globulin-1，從pCR 2. 1酶切產(chǎn)物回收3. 9kb的載體片段，將兩個(gè)回收片段 用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue,酶切鑒定獲得重組質(zhì)粒pCR-G (結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖3)，酶切驗(yàn)證(如圖IO所示)。
(4) pCAMBIA1300-nos-bar載體的構(gòu)建(構(gòu)建示意圖如圖6所示)
用Sacl和EcoRI完全雙酶切質(zhì)粒pGFP-2和pUC18，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的 瓊脂糖分離后用DNA快速回收試劑盒從pGFP-2酶切產(chǎn)物中回收270bp的nos 片段，從pUC18酶切產(chǎn)物中回收約2.6kb的載體，將兩個(gè)回收片段以T4連 接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，酶切鑒定重組質(zhì)粒pUC18-nos;再 用Xbal和EcoRI酶切pUC18-nos，回收含有nos及多克隆位點(diǎn)的DNA片段， 與經(jīng)相同處理的質(zhì)粒pCAMBIA-1300 (結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2)用T4連接酶連接、 轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，酶切鑒定獲得的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA-1300-nos，限制酶切與測(cè)序鑒定插入片段為nos (如圖8所示)。
用XhoI酶切質(zhì)粒pMDXl，回收約560bp的bar基因，用Xhol切除質(zhì)粒 pCAMBIA-1300-nos內(nèi)潮霉素抗性基因，回收大片段pCAMBIA-1300-nos并進(jìn) 行末端脫磷酸(如圖11所示)；將含有bar基因片段的DNA與 pCAMBIA-1300-nos用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，酶切鑒定獲 得的重組質(zhì)粒。利用限制性酶切和測(cè)序鑒定bar基因插入方向，將構(gòu)建的質(zhì) 粒的命名為pCAMBIA1300-nos-bar (如圖12所示)。
(5) 中間載體pCRGHLE的克隆與構(gòu)建
用BamHI和Xbal分別雙酶切步驟(3)所得質(zhì)粒pCR-G和步驟(2)所所示)經(jīng)瓊脂糖電泳分離，純化后，用T4 連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；感受態(tài)細(xì)胞的制備，重組質(zhì)粒篩選等方 法參見(jiàn)《分子克隆》(Maniatis等，1989)。篩選到正確的重組子pCRGHLE。 (6)目的載體pCAMBIA1300GHLE的克隆與構(gòu)建(構(gòu)建示意圖如圖7所示) 用HindIII和Xbal雙酶切步驟(5)所得重組載體pCRGHLE，得到 globulin-1和Hsp65-linker-Esat6的聯(lián)合片段，將HindIII和Xbal雙酶切 步驟(4)所得pCAMBIA1300-nos-bar后的片段與上述聯(lián)合片段用T4連接酶 連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選正確的重組子pCAMBIA1300GHLE (結(jié)構(gòu)示意圖 見(jiàn)圖4，雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖如圖9所示)。
實(shí)施例2
提取篩選實(shí)施例l所得重組表達(dá)載體pCAMBIA1300GHLE，電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿 菌LBA4404，方法參照盧圣棟《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》。提取質(zhì)粒后用 HindIII和XbaI進(jìn)行雙酶切，鑒定，最終確定重組質(zhì)粒pCAMBIA1300GHLE轉(zhuǎn)入 到了LBA4404中。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述 實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、 修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。序列表
<110>暨南大學(xué)
〈120>結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因及其玉米表達(dá)載體和應(yīng)用
<130〉 8
〈160〉 3
<170〉 Patentln version 3. 5
<210> 1
〈211〉 1075
〈212〉 腿
〈213〉 結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因
〈400〉 1
gaatgggcactgatagatcc atgcccccat gtcgccgccaccgggaacggaagccttctc60
cttttccggcttgtcggcaa cgacggcctc ggtggtcaggaacagccccgcgatggacgc120
cgcattctgcagcgccgaac gggtcacctt gaccgggtcagc犯cgccggcagcgagcag180
atcctcgtagacaccggtct gaacgttcag tccgtggccagccggcaggttgcgcacctt240
ctcggccaccacgcccggct ccagcccgga gttg犯ggcgatctgcttcagcggggcctc300
cagcgccaccttcacgatgt tggcgccggt cgcctcgtcgccttcgagcttcagctcgtc360
c已gggtcggggccgcttgca acagcgtcac acccccaccggcgacgatgccctcctcgac420
ggcggccttggcattgcgaa ccgcatcctc gatgcggtgcttgcgctccttgagttcgac■
ctcggtggcggcaccggcct tgatcaccgc gacaccaccggccagcttggccagccgctc540
ctgcagcttctcacggtcgt agtcggagtc gctgttctcgatctcctggcggatctgggc600
cactcgtccggcgatggcgt cggtgtcacc ggcgccctcgacgatggtggtctcgtcctt660
ggtgaccacgaccttgcggg ccttgcctag cagcgacaggtcggcgttctccagcgtcag720
gccgacctcttcgctgatca cctgaccacc ggtgagaatggccatatcctgcagcatcgc780
cttgcggcggtcgccgaagc cgggagcctt gaccgccaccg3cttg3aagtgccgcggat840
cttgttgacgaccagggtgg acagcgcctc gccctcgacgtcctcggcgatgatcagcag900
cggcttaccggctccgatga ccttctcgag cagcggcagcagatccttgacagtggacac960
cttggagctgaccagcagga tgtaggggtc ctccaggaccgctctgacgctccgggtcgg1020
tcacgagtaccccgagatgt agcccttgtc gacgcataccctcggtgagctcgag1075
<210> 2 <211> 27〈212〉 DNA
〈213〉 融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的上游引物 〈400〉 2
ttagatctgc aatggccaag acaa/ttg 27
〈210〉 3 〈211〉 27 〈212〉 DNA
<213〉融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的下游引物 〈400〉 3
gctctagact atgcgaacat cccagtg 2權(quán)利要求
1、一種結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因，其特征在于其序列如SEQID NO.1所述。
2、 一種包含了權(quán)利要求1所述結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因的玉米表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟(1) 根據(jù)人結(jié)核分支桿菌H37Rv株Hsp65和Esat6基因的編碼序列設(shè) 計(jì)融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的1對(duì)引物上游引物序列為Pl 5' - TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTG - 3'，含 BglII酶切位點(diǎn)和起始密碼子ATG;下游引物序列為P2 5' - GC TCTAGA CTATGCGAACATCCCAGTG - 3'，含 Xba I酶切位點(diǎn)和終止密碼子CTA;(2) 以質(zhì)粒pEGFPHsp65-Esat6為模板，用歩驟(1)設(shè)計(jì)的引物Pl和 P2進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增Hsp65-1 inker-Esat6;(3) pCR-G載體的構(gòu)建用HindIII和BamHI分別雙酶切質(zhì)粒pUBCG和pCR 2. 1，經(jīng)瓊脂糖電泳 分離，從pUBCG酶切產(chǎn)物回收1.4kb的玉米種子特異表達(dá)啟動(dòng)子globulin-l， 從PCR 2. 1酶切產(chǎn)物回收3. 9kb的載體片段，將兩個(gè)回收片段連接、轉(zhuǎn)化獲 得重組質(zhì)粒pCR-G;(4) pCAMBIA1300-nos-bar載體的構(gòu)建用Sacl和EcoRI分別雙酶切質(zhì)粒pGFP-2和pUC18，經(jīng)瓊脂糖電泳分離， 從pGFP-2酶切產(chǎn)物中回收270bp的nos片段，從pUC18酶切產(chǎn)物中回收2. 6kb 的載體片段，將兩個(gè)回收片段連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒pUC18-nos;用XbaI 和EcoRI酶切pUC18-nos，回收含有nos及多克隆位點(diǎn)的DNA片段，與經(jīng)相 同處理的質(zhì)粒pCAMBIA-1300連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA-1300-nos;用XhoI酶切質(zhì)粒pMDXl，回收560bp的bar基因片段，用Xhol切除質(zhì) 粒pC扁BIA-1300-nos內(nèi)潮霉素抗性基因，回收pCAMBIA-1300-nos并進(jìn)行末 端脫磷酸；將bar基因片段與pCAMBIA-1300-nos連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒 pCAMBIA1300-nos-bar;(5)中間載體pCRGHLE的克隆與構(gòu)建用BamHI和Xbal分別雙酶切步驟(3)所得質(zhì)粒pCR-G和步驟(2)所 得Hsp65-linker-Esat6，經(jīng)瓊脂糖電泳分離，純化后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化篩選獲得重組載體pCRGHLE;(6)目的載體pCAMBIA1300GHLE的克隆與構(gòu)建用HindIII和Xbal雙酶切步驟(5)所得重組載體pCRGHLE，得到 globulin-l和Hsp65-linker-Esat6的聯(lián)合片段，將HindIII和Xbal雙酶切 步驟(4)所得pCAMBIA1300-nos-bar后的片段與上述聯(lián)合片段連接、轉(zhuǎn)化 篩選獲得目的載體pCAMBIA1300GHLE。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述玉米表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于步驟 (2)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在95'C預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入下列循環(huán)95°C、 30 s，56。C、 50 s， 72°C、 90 s,共進(jìn)行40個(gè)循 環(huán)，最后72。C延伸10min，擴(kuò)增完畢后置4。C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為10umo1/1的上游引物Pl 1 " 1濃度為lOumol/l的下游引物P2 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的濃度各為2.5 mM的dNTP混合物 4 u 1pEGFPHsp65-Esat6 1 ti 1Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液 5 u 1Ex耐熱性DNA聚合酶 0. 3 p 1滅菌水 37. 7 y 1
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法構(gòu)建的玉米表達(dá)載體作為制備疫苗的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因及其玉米表達(dá)載體和應(yīng)用。該玉米表達(dá)載體的構(gòu)建方法是(1)根據(jù)人結(jié)核分支桿菌H37Rv株Hsp65和Esat6基因的編碼序列設(shè)計(jì)融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的1對(duì)引物P1和P2；(2)以質(zhì)粒pEGFPHsp65-Esat6為模板，用引物P1和P2進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增Hsp65-linker-Esat6；(3)pCR-G載體的構(gòu)建；(4)pCAMBIA1300-nos-bar載體的構(gòu)建；(5)中間載體pCRGHLE的克隆與構(gòu)建；(6)目的載體pCAMBIA1300GHLE的克隆與構(gòu)建。本發(fā)明結(jié)核Hsp65和Esat6融合抗原基因的表達(dá)載體可用于制備疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101613701SQ20081022069
公開(kāi)日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者李君武, 胡建廣 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)