專利名稱：：一種結(jié)核分枝桿菌Rv1354c基因作為藥物靶標的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于微生物生物
技術領域：
，具體地涉及一種結(jié)核分枝桿菌Rvl354c基因(編碼的蛋白質(zhì))作為抗結(jié)核藥物靶標的應用。其應用范圍包括1)模擬結(jié)核分枝桿菌Rvl354c鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)；(2)建立針對結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的計算機藥物篩選系統(tǒng)；(3)運用步驟(2)的計算機藥物篩選系統(tǒng)從ZINC數(shù)據(jù)庫中篩選出16個與活性位點有高親和力的化合物，為研發(fā)新的抗結(jié)核藥物提供基礎。
背景技術：
：結(jié)核分枝桿菌是一種嚴重危害人類健康的病原菌，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界每年大約有三百萬人死于結(jié)核病，并且全球約有三分之一人的口感染處于潛伏狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌。近年來出現(xiàn)的藥物抗性菌株以及與HIV的共感染問題，使得這一形勢更加嚴峻。因此，尋找新的藥物靶標并研發(fā)新的抗結(jié)核藥物已成為當前全球控制結(jié)核病的重要措施之一(WorldHealthOrganization.2008tuberculosisfacts.Tech.rep.,WHO(2008))。Cyclic-di-GMP是一個廣泛存在于原核生物界的第二信使分子，具有鳥苷酸環(huán)化酶活性的GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)能夠催化Cyclic-di-GMP的合成，具有磷酸二酯酶活性的EAL結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)能夠催化Cyclic-di-GMP的水解。隨著近年來的深入研究發(fā)現(xiàn)，在多種對人類健康造成威脅的病原菌，如假單胞菌、霍亂弧菌、沙門氏菌和鼠疫桿菌中，Cyclic-di-GMP信號路徑參與調(diào)控許多與病原性細菌毒力、潛伏性感染、以及耐藥性有關的活動，顯示出了這一信號系統(tǒng)對于病原性細菌的重要性(肪mlingU，AmikamD.Cyclicdi-GMPasasecondmessenger.CurrOpinMicrobiol.2006Apr；9(2):218_28.JenalU,MaloneJ.Mechanismsofcyclic-di-GMPsignalinginbacteria.AnnuRevGenet.2006；40385-407.TamayoR,PrattJT,CamilliA.Rolesofcyclicdiguanylateintheregulationofbacterialpathogenesis.AnnuRevMicrobiol.2007；61:131-48.)。Cyclic-di-GMP信號路徑在結(jié)核分枝桿菌中的調(diào)控作用目前尚無報道。通過生物信息學分析，我們在結(jié)合分枝桿菌中鑒定了一個新的參與Cyclic-di-GMP信號路徑的蛋白質(zhì)Rvl354c。結(jié)構(gòu)域分析與序列比對分析表明該結(jié)核分枝桿菌Rvl354c包含GAF、GGDEF和EAL三個結(jié)構(gòu)域(見圖1)，并且GGDEF結(jié)構(gòu)域和EAL結(jié)構(gòu)域的關鍵殘基都十分保守。GAF結(jié)構(gòu)域是一個能夠感受多種信號的受體結(jié)構(gòu)域，因此Rvl354c可能通過接受不同的外界信號的而可逆的調(diào)控GGDEF結(jié)構(gòu)域和EAL結(jié)構(gòu)域的活性，通過這種調(diào)控作用改變胞內(nèi)第二信使Cyclic-di-GMP的濃度，進而影響病原菌的細胞活動。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于一種結(jié)核分枝桿菌Rvl354c基因作為藥物靶標的應用。其要點是1)模擬結(jié)核分枝桿菌Rvl354c鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)；(2)建立針對結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的計算機藥物篩選系統(tǒng)；(3)運用步驟(2)的計算機藥物篩選系統(tǒng)從ZINC數(shù)據(jù)庫中篩選出16個與活性位點有高親和力的化合物，為研發(fā)新的抗結(jié)核藥物提供基礎。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的首先獲取結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的蛋白質(zhì)序列，通過同源建模方法(ArnoldK.，BordoliL.，KoppJ.，andSchwedeT.(2006)TheSWISS-MODELWorkspace:Aweb-basedenvironmentforproteinstructurehomologymodelling.Bioinformatics,22,195-201.)得到結(jié)核分枝桿菌Rvl354c鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)，并通過比較分析，鑒定其活性位點。利用所獲的的三維結(jié)構(gòu)信息和活性位點信息，在計算機上構(gòu)建了一個針對結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的計算機藥物篩選系統(tǒng)，然后運用該系統(tǒng)從小分子化合物數(shù)據(jù)庫中篩選出16個與活性位點有高親和力的化合物分子。具體地，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種結(jié)核分枝桿菌Rvl354c基因作為藥物靶標的應用，其步驟如下(1)模擬結(jié)核分枝桿菌Rvl354c鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)；(2)建立針對結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的計算機藥物篩選系統(tǒng)；(3)運用步驟⑵的計算機藥物篩選系統(tǒng)從ZINC數(shù)據(jù)庫(http://blaster,docking.org/zinc7/)中篩選出16個與結(jié)核分枝桿菌Rvl354c活性位點有高親和力的化合該化合物具有下列特征化合物-1化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04632254英文名禾爾:2-acetyl-5-(2-furyl)cyclohexane-1,3-dione；結(jié)構(gòu)式化合物-2化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04149400英文名禾爾2~(hydroxymethylaminomethylene)indane-1,3-dione；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>化合物-3化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC00109814英文名稱2-[2-(3，4-diethoxyphenyl)-l-hydroxy-ethylidene]cyclohexane-1,3—dione結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>化合物-4化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC05286123英文名稱:benzene-l,2,3,4,5,6-hexamine；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>化合物-5化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807335英文名稱[4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)_5-(2-imino-6-oxo-3H-purin_9-yl)-tetrahydrofuran-3-yl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>化合物_6化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC02115188英文名稱2-[4-[(2-amino-4-oxo-3H-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid；結(jié)構(gòu)式化合物-7化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261903英文名稱[[3,4-dihydroxy-5-(6_oxo_lH_purin_9_yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxy-hydroxy-phosphoryl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>化合物-8化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807333英文名稱[4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)_5_(2-imino-6-oxo-3H-purin_9-yl)-tetrahydrofuran-3-yl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>化合物-9化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261904英文名稱[[3,4-dihydroxy-5-(6_oxo_lH_purin_9_yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxy-hydroxy-phosphoryl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>化合物-10化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC00716686英文名禾爾:4-benzoyl-3-hydroxy-5-phenyl-l-(2-piperazin-l-ylethyl)_5H_pyrrol-2—one；結(jié)構(gòu)式化合物-11化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04625081英文名稱2-[[2-[4-(l,3-dioxoisoindolin-2-yl)butanoyl]-5,5-dimethyl-3-oxo-l-cyclohexenyl]amino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>化合物-12化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261891英文名稱2_[4_[(2-amino-4-oxo-lH-pteridin_7-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>化合物-13化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04228242英文名稱[3,4-dihydroxy-5-(6-oxo-lH-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>化合物-14化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC02169121英文名稱2-[[4-[bis(carboxymethyl)amino]phenyl]-(carboxymethyl)amino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>化合物-15化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807329英文名3-(lH-imidazol-4-yl)~2~(2-phenoxyacetyl)amino-propanoicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>結(jié)構(gòu)式一種結(jié)核分枝桿菌Rvl354c基因作為藥物靶標的應用篩選的化合物，它是下列步驟制備的(1)模擬結(jié)核分枝桿菌Rvl354c鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)；(2)建立針對結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的計算機藥物篩選系統(tǒng)；(3)運用步驟⑵的計算機藥物篩選系統(tǒng)從ZINC數(shù)據(jù)庫(http://blaster,docking.org/zinc7/)中篩選出16個與結(jié)核分枝桿菌Rvl354c活性位點有高親和力的化合物，該化合物具有下列特征化合物-1化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04632254英文名禾爾:2-acetyl-5-(2-furyl)cyclohexane-1,3-dione；結(jié)構(gòu)式化合物-2化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04149400英文名禾爾2~(hydroxymethylaminomethylene)indane-1,3-dione；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>化合物-3化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC00109814英文名稱2-[2-(3,4-diethoxyphenyl)-l-hydroxy-ethylidene]cyclohexane—1,3—dione；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>化合物-4化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC05286123英文名稱:benzene-l,2,3,4,5,6-hexamine；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>化合物-5化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807335英文名稱[4-hydroxy-2_(hydroxymethyl)_5-(2-imino-6-oxo_3H-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-3-yl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>化合物-6化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC02115188英文名稱2-[4-[(2-amino-4-oxo-3H-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>化合物-7化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261903英文名稱[[3,4-dihydroxy-5-(6-oxo-lH-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxy-hydroxy-phosphoryl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>化合物-8化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807333英文名稱[4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)_5_(2-imino-6-oxo-3H-purin_9-yl)-tetrahydrofuran-3-yl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>化合物-9化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261904英文名稱[[3,4-dihydroxy-5-(6-oxo-lH-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxy-hydroxy-phosphoryl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>化合物-10化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC00716686英文名禾爾:4-benzoyl-3-hydroxy-5-phenyl-l-(2-piperazin-l-ylethyl)_5H_pyrrol-2-one；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>化合物-11化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04625081英文名稱2-[[2-[4-(l,3-dioxoisoindolin-2-yl)butanoyl]-5,5-dimethyl-3-oxo-l-cyclohexenyl]amino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>化合物-12化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261891英文名2~[4-[(2-amino-4-oxo-lH-pteridin-7-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>化合物-13化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04228242英文名稱[3,4-dihydroxy-5-(6-oxo-lH-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>化合物-14化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC02169121英文名禾爾2-[[4-[bis(carboxymethyl)amino]phenyl]-(carboxymethyl)amino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>化合物-15化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807329胃t名^3-(lH-imidazol-4-yl)-2-(2-phenoxyacetyl)已mino一propanoicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>化合物-16化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC01780085^JC^i^:2~[2,2-bis(ethoxycarbonyl)vinylamino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>顯而易見，本發(fā)明篩選的與結(jié)核分枝桿菌Rvl354c活性位點結(jié)合的化合物可在抗結(jié)核藥物開發(fā)中應用。更詳細的技術方案及其應用參見《具體實施方式》。圖1.Rvl354c結(jié)構(gòu)域信息。圖2.Rvl354cG⑶EF結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)圖。圖3.Rvl354cGGDEF結(jié)構(gòu)域天然底物結(jié)合位點。小球填充的空間區(qū)域為GGDEF結(jié)構(gòu)結(jié)合底物的部位圖4.2-[4-[(2-amino-4-oxo-3H-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid與受體的結(jié)合構(gòu)象，圖中1表示結(jié)核分枝桿菌Rvl354cGGDEF結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)，2代表小分子化合物2-[4-[(2-amino-4-oxo-3H-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid。具體實施例方式實施例1原始序列獲取與結(jié)構(gòu)域功能分析從NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的蛋白質(zhì)序列(gi15608494)，其全長包含623個氨基酸殘基。將結(jié)核分枝桿菌Rvl354c蛋白質(zhì)序列提交到保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫CDD(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)查詢結(jié)構(gòu)域信息，Rvl354c從N端到C端依次包含GAF、GGDEF和EAL三個結(jié)構(gòu)域(見圖1)，表明Rvl354c參與調(diào)控第二信使Cyclic-di-GMP。實施例2針對結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的計算機藥物篩選系統(tǒng)的構(gòu)建軟件平臺配置本實施例中構(gòu)建針對結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的計算機藥物篩選系統(tǒng)所用的操作系統(tǒng)為Linux操作系統(tǒng)，發(fā)行版本為FedoraCore7_i386版本。chimera軟件從網(wǎng)絡(http//www,cgl.ucsf.edu/chimera/)免費下載，下載后直接安裝。dms源代碼包從網(wǎng)絡(http://www,cgl.ucsf.edu/Overview/softwarc.html#dms)免費下載，在本機Iinux計算機上編譯得到可運行的二進制程序，然后安裝。通過與美國加利福尼亞大學Kimtz實驗室簽署使用協(xié)議，獲得DOCK軟件使用許可。通過網(wǎng)絡(http://dock,compbio.ucsf.edu/D0CK_6/index.htm)獲得DOCK軟件包的源代碼(版本為6.1)，在本地Iinux計算機上對源代碼進行編譯，得到可運行的二進制程序，然后安裝。后續(xù)實施例中所用到的sphgen、sphere_selector、showbox、grid、dock6程序以及相關的一些化學參數(shù)文件均來自DOCK軟件包。Rvl354c的三維結(jié)構(gòu)模擬與底物結(jié)合位點鑒定目前尚沒有用實驗方法解析的Rvl354c的三維結(jié)構(gòu)。申請人通過同源建模方法構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌Rvl354cGGDEF結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)。所用的同源建模工具為SWISS-MODEL(http//swissmodel.expasy.org/)。從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲取Rvl354c的蛋白質(zhì)序列(gi15608494)，然后將Rvl354c的蛋白質(zhì)序列提交到SWISS-MODEL，人工指定2v0nA為建模所用的模板蛋白進行同源建模，得到Rvl354cGGDEF結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)(見圖2)，保存為Rvl354c-GGDEF.pdb。通過與2v0nA中的底物結(jié)合位點相比較，鑒定出在Rvl354cGGDEF結(jié)構(gòu)域中對應的活性位點，將活性位點用小球占據(jù)的空間表征(見圖3)。計算機篩選系統(tǒng)的構(gòu)建(1)用chimera軟件打開Rvl354c_GGDEF.pdb，然后用“DockPr印”工具對其進行預處理，包括添加氫原子、添加加電荷信息、以及檢查結(jié)構(gòu)中的錯誤，處理完成后將保存為rec—charged·mol20(2)在步驟(1)的基礎上再用chimera軟件的“select”工具選擇所有氫原子，然后用”delete”工具將其刪除，處理完成后保存為recjoH.pdb。(3)用chimera軟件打開2V0N.pdb(來自PDB數(shù)據(jù)庫)，刪除與A鏈GGDEF結(jié)構(gòu)域底物結(jié)合位點結(jié)合的GTPαS之外的其它所有原子，處理完成后將剩余的GTPαS分子結(jié)構(gòu)保存為substrate.mol2。(3)使用dms程序生成Rvl354cGGDEF結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)的表面信息文件。在命令行下鍵入下列命令dmsrec_noH.pdb-n-wL4_ν_οrec.ms程序運行完成后生成rec.ms文件，即為表面信息文件。(4)使用sphgen程序生成圍繞表面的小球。sphgen程序的輸入文件為INSPH，在本實施例中，INSPH文件內(nèi)容配置如下rec.msRX0.04.01.4rec.sph配置好INSPH文件后在命令行下鍵入下列命令sphgen程序運行完成后生成rec.sph文件，即為包含小球信息的文件。(5)選擇能夠表征底物結(jié)合位點信息的小球集，在本實施例中選擇位于與GTPαS所有原子RMSD小于5.0埃的空間范圍內(nèi)的小球。鍵入下列命令sphere—selectorrec.sphsubstrate.mol25.0程序運行完成后生成selected—spheres,sph文件，即為包含小球信息的文件。(6)生成包圍活性位點的方格，鍵入下面的命令showbox<box.in其中box.in為配置文件，其內(nèi)容如下Y5selected—spheres·sph1rec—box.pdb程序運行完成后生成rec—box.pdb文件。(7)生成格點文件，鍵入下面的命令grid-igrid,in其中grid,in為配置文件，在本實施例中，其內(nèi)容如下compute_gridsyesgrid—spacing0.3output—moleculenocontact_scorenoenergy_scoreyesenergy—cutoff—distance9999atom—modelaattractive_exponent6repulsive_exponent12distance—dielectricyesdielectric—factor4bump_filteryesbump_overlap0.75receptor_filerec_charged.mo12box_filerec_box.pdbvdw_definition_filevdw_AMBER_parm99.defnscore_grid_prefixgrid程序運行完成后生成grid,nrg、grid,bmp、grid,out文件，包含底物結(jié)合位點的能量與空間信息等。通過上述步驟在計算機上建立了一個針對結(jié)核分枝桿菌Rcl354c的抑制劑篩選系統(tǒng)，使用該系統(tǒng)可以計算Rvl354c和小分子化合物的親和力，從而篩選具有潛在抑制作用的小分子化合物。實施例3針對結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的計算機藥物篩選應用(1)小分子化合物庫的準備本實施例中小分子化合物數(shù)據(jù)庫來自ZINC數(shù)據(jù)庫。ZINC是一個可以免費使用的用于虛擬篩選的化合物數(shù)據(jù)庫，由美國加利福尼亞大學藥物化學系的Shoichet研究小組建立并維護。ZINC數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)可以以SMILES，mol2，3DSDF等多種文件格式免費下載，特別適用于以分子對接為主的虛擬篩選策略，其中mol2格式可直接用于DOCK程序的輸入文件。ZINC是一個不斷更新的數(shù)據(jù)庫,本實施例中所使用的數(shù)據(jù)為ZINC7(httD://blasterdocking.org/ZinC7/)。ZINC數(shù)據(jù)庫何含的數(shù)據(jù)量+分巨大，伯其提供了多種方式可俥用戶根據(jù)自己的需要獲取相應的子數(shù)據(jù)集。在本實施例中，根據(jù)供應商選取了部分小分子化合物庫(http://zinc7.docking.orR/vendorO/)。總共下載了ZINC收錄的4個小分子化合物供應商(ACBBlocks公司，AcrosOrganics公司，Alfa-Aesar公司禾PChemicalBlock公司)的小分子化合物數(shù)據(jù)。表1小分子化合物庫信息<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>(2)基于分子對接的虛擬篩選這一步驟通過運行分子對接程序來從小分子化合物數(shù)據(jù)庫中篩選與Rvl354cGGDEF結(jié)構(gòu)域天然底物結(jié)合位點具有高親和力的小分子化合物。鍵入下面的命令可進行一次篩選dock6_irigid,in其中rigid,in為配置文件，指明包括小分子化合物庫數(shù)據(jù)文件的路徑等完成一次對接實驗所需的信息。在本實施例中，用于篩選aCrOS_pl.0.mO12數(shù)據(jù)庫所用的配置內(nèi)容如下ligand—atom—fileacros—pl.0.mol21imit_max_ligandsnoskip—moleculenoread—mol_solvationnocalculate—rmsdnoorient_ligandyesautomated—matchingyesreceptor—site—fileselected—spheres·sphmax_orientations1000critical—pointsnochemical—matchingnouse_ligand—spheresnoflexible_ligandnobump_filternoscore—moleculesyescontact—score—primarynocontact—score—secondarynogrid—score—primaryyesgrid—score—secondarynogrid—score—rep—rad—scale1grid—score—νdw—scale1grid—score—es—scale1grid—score—grid一prefixgriddock3.5_score_secondarynocontinuous—score—secondarynogbsa—zou—score—secondarynogbsa_hawkins_score_secondarynoamber—score—secondarynominimize—ligandyessimplex—max_iterations1000simplex—max—cycles1simplex—score—converge0.1simplex—cycle—converge1.0simplex—trans—step1.0simplex—rot_step0.1simplex_tors_step10.0simplex_final—minnosimp1ex—random—seed0atom—modelallvdw_defn_filevdw_AMBER_parm99.defnflex—defn—fileflex,defnflex_drive_fileflex_drive.tblligand—outfile—prefixrigidwrite_orientationsnonum—scored—conformers—written1rank—ligandsyesmax—ranked—ligands20程序運行完成后，即可得到親和力打分排在前20位的20個分子。同時也得到小分子化合物與受體結(jié)合的相對構(gòu)象(如2-[4-[(2-amino-4-oxo-3H-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid與受體活性位點的結(jié)合構(gòu)象如圖4所示)。用同樣的方法篩選acb_pl.0.mol2，alfa_pl.0.mol2,chemblock_pl.0.mol2，只需將rigid,in配置文件中的ligand_at0m_file設置為對應的化合物庫數(shù)據(jù)文件名。本實施例中所有的化合物庫篩選完成后，通過綜合親和力打分以及人工觀察小分子與靶蛋白Rvl354cGGDEF結(jié)構(gòu)域天然底物結(jié)合位點的空間互補情況，最終選擇了16個小分子(見圖5)作為本次實驗的篩選結(jié)果。表2本發(fā)明篩選的16個抑制劑分子<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120>一種結(jié)核分枝桿菌Rv1354c基因作為藥物靶標的應用<130><141>2009-03-13<160>1<170>PatentInversion3.1<210>1<211>623<212>PRT<213>Mycobacteriumtuberculosis<220><221>SIGNAL<222>(1)..(623)<223><400>1MetCysAsnAspThrAlaThrProGlnLeuGluGluLeuValThrThr151015ValAlaAsnGlnLeuMetThrValAspAlaAlaThrSerAlaGluVal202530SerGlnArgValLeuAlaTyrLeuValGluGlnLeuGlyValAspVal354045SerPheLeuArgHisAsnAspArgAspArgArgAlaThrArgLeuVal505560AlaGluTrpProProArgLeuAsnlieProAspProAspProLeuArg65707580LeulieTyrPheAlaAspAlaAspProValPheAlaLeuCysGluHis859095AlaLysGluProLeuValPheArgProGluProAlaThrGluAspTyr100105110GlnArgLeulieGluGluAlaArgGlyValProValThrSerAlaAla115120125AlaValProLeuValSerGlyGlulieThrThrGlyLeuLeuGlyPhe130135140lieLysPheGlyAspArgLysTrpHisGluAlaGluLeuAsnAlaLeu145150155160MetThrlieAlaThrLeuPheAlaGlnValGlnAlaArgValAlaAla165170175GluAlaArgLeuArgTyrLeuAlaAspHisAspAspLeuThrGlyLeu180185190HisAsnArgArgAlaLeuLeuGlnHisLeuAspGlnArgLeuAlaPro195200205GlyGlnProGlyProValAlaAlaLeuPheLeuAspLeuAspArgLeu210215220LysAlalieAsnAspTyrLeuGlyHisAlaAlaGlyAspGlnPhelie225230235240HisValPheAlaGlnArglieGlyAspAlaLeuValGlyGluSerLeu245250255lieAlaArgLeuGlyGlyAspGluPheValLeulieProAlaSerPro260265270MetSerAlaAspAlaAlaGlnProLeuAlaGluArgLeuArgAspGln275280285LeuLysAspHisValAlalieGlyGlyGluValLeuThrArgThrVal290295300SerlieGlyValAlaSerGlyThrProGlyGlnHisThrProSerAsp305310315320LeuLeuArgArgAlaAspGlnAlaAlaLeuAlaAlaLysHisAlaGly325330335GlyAspSerValAlaliePheThrAlaAspMetSerValSerGlyGlu340345350LeuArgAsnAsplieGluLeuHisLeuArgArgGlylieGluSerAsp355360365AlaLeuArgLeuValTyrLeuProGluValAspLeuArgThrGlyAsp370375380lieValGlyThrGluAlaLeuValArgTrpGlnHisProThrArgGly385390395400LeuLeuAlaProGlyCysPhelieProValAlaGluSerlieAsnLeu405410415AlaGlyGluLeuAspArgTrpValLeuArgArgAlaCysAsnGluPhe420425430SerGluTrpGlnSerAlaGlyLeuGlyHisAspAlaLeuLeuArglie435440445AsnValSerAlaGlyGlnLeuValThrGlyGlyPheValAspPheVal450455460AlaAspThrlieGlyGlnHisGlyLeuAspAlaSerSerValCysLeu465470475480GlulieThrGluAsnValValValGlnAspLeuHisThrAlaArgAla485490495ThrLeuAlaArgLeuLysGluValGlyValHislieAlalieAspAsp500505510PheGlyThrGlyTyrSerAlalieSerLeuLeuGlnThrLeuProlie515520525AspThrLeuLyslieAspLysThrPheValArgGlnLeuGlyThrAsn530535540ThrSerAspLeuVallieValArgGlylieMetThrLeuAlaGluGly545550555560PheGlnLeuAspValValAlaGluGlyValGluThrGluAlaAlaAla565570575ArglieLeuLeuAspGlnArgCysTyrArgAlaGlnGlyPheLeuPhe580585590SerArgProValProGlyGluAlaMetArgHisMetLeuSerAlaArg595600605ArgLeuProProThrCyslieProAlaThrAspProAlaLeuSer610615620權利要求一種結(jié)核分枝桿菌Rv1354c基因作為藥物靶標的應用，其步驟如下(1)模擬結(jié)核分枝桿菌Rv1354c鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)；(2)建立針對結(jié)核分枝桿菌Rv1354c的計算機藥物篩選系統(tǒng)；(3)運用步驟(2)的計算機藥物篩選系統(tǒng)從ZINC數(shù)據(jù)庫(http://blaster.docking.org/zinc7/)中篩選出16個與結(jié)核分枝桿菌Rv1354c活性位點有高親和力的化合物；該化合物具有下列特征化合物-1化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04632254英文名稱2-acetyl-5-(2-furyl)cyclohexane-1，3-dione；結(jié)構(gòu)式化合物-2化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04149400英文名稱2-(hydroxymethylaminomethylene)indane-1，3-dione；結(jié)構(gòu)式化合物-3化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC00109814英文名稱2-[2-(3，4-diethoxyphenyl)-1-hydroxy-ethylidene]cyclohexane-1，3-dione；結(jié)構(gòu)式化合物-4化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC05286123英文名稱benzene-1，2，3，4，5，6-hexamine；結(jié)構(gòu)式化合物-5化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807335英文名稱[4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-5-(2-imino-6-oxo-3H-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-3-yl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式化合物-6化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC02115188英文名稱2-[4-[(2-amino-4-oxo-3H-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid；結(jié)構(gòu)式化合物-7化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261903英文名稱[[3，4-dihydroxy-5-(6-oxo-1H-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxy-hydroxy-phosphoryl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式化合物-8化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807333英文名稱[4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-5-(2-imino-6-oxo-3H-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-3-yl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式化合物-9化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261904英文名稱[[3，4-dihydroxy-5-(6-oxo-1H-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxy-hydroxy-phosphoryl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式化合物-10化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC00716686英文名稱4-benzoyl-3-hydroxy-5-phenyl-1-(2-piperazin-1-ylethyl)-5H-pyrrol-2-one；結(jié)構(gòu)式化合物-11化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04625081英文名稱2-[[2-[4-(1，3-dioxoisoindolin-2-yl)butanoyl]-5，5-dimethyl-3-oxo-1-cyclohexenyl]amino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式化合物-12化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261891英文名稱2-[4-[(2-amino-4-oxo-1H-pteridin-7-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid；結(jié)構(gòu)式化合物-13化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04228242英文名稱[3，4-dihydroxy-5-(6-oxo-1H-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式化合物-14化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC02169121英文名稱2-[[4-[bis(carboxymethyl)amino]phenyl]-(carboxymethyl)amino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式化合物-15化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807329英文名稱3-(1H-imidazol-4-yl)-2-(2-phenoxyacetyl)amino-propanoicacid；結(jié)構(gòu)式化合物-16化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC01780085英文名稱2-[2，2-bis(ethoxycarbonyl)vinylamino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式F2009100611199C0000011.tif,F2009100611199C0000012.tif,F2009100611199C0000021.tif,F2009100611199C0000022.tif,F2009100611199C0000023.tif,F2009100611199C0000031.tif,F2009100611199C0000032.tif,F2009100611199C0000033.tif,F2009100611199C0000041.tif,F2009100611199C0000042.tif,F2009100611199C0000051.tif,F2009100611199C0000052.tif,F2009100611199C0000053.tif,F2009100611199C0000061.tif,F2009100611199C0000062.tif,F2009100611199C0000063.tif2.一種結(jié)核分枝桿菌Rvl354c基因作為藥物靶標的應用的篩選的化合物，它是下列步驟制備的(1)模擬結(jié)核分枝桿菌Rvl354c鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)；(2)建立針對結(jié)核分枝桿菌Rvl354c的計算機藥物篩選系統(tǒng)；(3)運用步驟(2)的計算機藥物篩選系統(tǒng)從ZINC數(shù)據(jù)庫(http://blaster.dockinR.orR/zinc7/)中篩選出16個與結(jié)核分枝桿菌Rvl354c活性位點有高親和力的化合物，該化合物具有下列特征化合物-1化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04632254化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC02169121英文名2-[[4-[bis(carboxymethyl)amino]phenyl]-(carboxymethyl)amino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>化合物-15化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807329英文名禾爾3~(lH-imidazol-4-yl)~2~(2-phenoxyacetyl)amino-propanoicacid；結(jié)構(gòu)式化合物-16化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC01780085英文名禾爾2-[2,2-bis(ethoxycarbonyl)vinylamino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式英文名禾爾:2-acetyl-5-(2-furyl)cyclohexane-1,3-dione；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>化合物_2化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04149400英文名禾爾2~(hydroxymethylaminomethylene)indane~l,3-dione；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>化合物_3化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC00109814英文名稱2-[2-(3,4-diethoxyphenyl)-l-hydroxy-ethylidene]cyclohexane-l,3-dione；結(jié)構(gòu)式化合物_4化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC05286123英文名稱benzene_l,2,3,4,5,6-hexamine；結(jié)構(gòu)式化合物_5化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807335英文名稱[4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)_5_(2-imino-6-oxo-3H-purin_9-yl)-tetrahydrofuran-3-yl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>化合物_6化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC02115188英文名禾爾2_[4-[(2-amino-4-oxo-3H-pteridin_6-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>化合物_7化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261903英文名稱[[3,4-dihydroxy-5-(6_oxo_lH_purin_9_yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxy-hydroxy-phosphoryl]oxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>化合物_8化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807333英文名稱[4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)_5_(2-imino-6-oxo-3H-purin_9-yl)-tetrahydrofu化合物_9化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261904英文名稱[[3,4-dihydroxy-5-(6_oxo_lH_purin_9_yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxy-hydroxy-phosphoryl]oxyphosphonicacid；化合物-io<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC00716686英文名禾爾:4-benzoyl-3-hydroxy-5-phenyl-l-(2-piperazin-l-ylethyl)-5H-pyrrol化合物-11化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04625081英文名稱`2-[[2-[4-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)butanoyl]-5,5-dimethyl-3-oxo-l-cyclohexenyl]amino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式結(jié)構(gòu)式；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>化合物-12化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04261891英文名禾爾2_[4-[(2-amino-4-oxo-lH-pteridin_7-yl)methylamino]benzoyl]aminopentanedioicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>化合物-13化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04228242英文名[3,4-dihydroxy-5-(6-oxo-lH-purin-9-yl)-tetrahydrofuran-2-yl]methoxyphosphonicacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>化合物-14化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC02169121英文名禾爾2_[[4_[bis(carboxymethyl)amino]phenyl]-(carboxymethyl)amino]aceticacid；結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>化合物-15化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC04807329英文名禾爾3~(lH-imidazol-4-yl)~2~(2-phenoxyacetyl)amino-propanoicacid結(jié)構(gòu)式化合物-16化合物在ZINC數(shù)據(jù)庫中的編號ZINC01780085英文名禾爾2-[2,2-bis(ethoxycarbonyl)vinylamino]aceticacid結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>3.權利要求2所述的化合物的抗結(jié)核藥學用途。全文摘要本發(fā)明屬于微生物生物
技術領域：
，具體地涉及一種結(jié)核分枝桿菌Rv1354c基因(該基因序列，編碼的蛋白質(zhì))作為抗結(jié)核藥物靶標的應用。其應用范圍包括1)模擬結(jié)核分枝桿菌Rv1354c鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)；(2)建立針對結(jié)核分枝桿菌Rv1354c的計算機藥物篩選系統(tǒng)；(3)運用步驟(2)的計算機藥物篩選系統(tǒng)從ZINC數(shù)據(jù)庫中篩選出16個與活性位點有高親和力的化合物，為研發(fā)新的抗結(jié)核藥物提供基礎。文檔編號C07D209/48GK101831486SQ200910061119公開日2010年9月15日申請日期2009年3月13日優(yōu)先權日2009年3月13日發(fā)明者何正國,崔濤,張磊申請人:華中農(nóng)業(yè)大學