一種結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核?。═uberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)引 起的古老疾病，它與艾滋病、瘧疾并稱為當(dāng)今世界威脅人類健康的三大傳染病。研究表明 結(jié)核分枝桿菌基因組共編碼11種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Serine/threonine protein kinase，STPK)和兩種真核樣酪氨酸磷酸酶（PtpA和PtpB)，它們在結(jié)核分枝桿菌感染宿主 巨噬細(xì)胞的過程中可被分泌至宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中，這些蛋白分別與宿主細(xì)胞中不同的蛋白 分子相互作用，并且通過調(diào)控宿主細(xì)胞中各個靶蛋白的磷酸化水平來達(dá)到干擾真核生物信 號通路的目的。這些病原菌-宿主互作蛋白及其相關(guān)的炎癥和免疫信號通路將可能為抗結(jié) 核新藥設(shè)計提供全新的理想靶點。
[0003] 結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)分泌的PtpA蛋白屬于低分子量酪氨酸磷酸酯酶家 族，也叫做LowMWPTPs。研究表明：PtpA蛋白與真核細(xì)胞中的酪氨酸磷酸酯酶有很強(qiáng)的相似 性，它在病原宿主互作過程中起著重要的作用，參與調(diào)控多種重要的生理病理過程，并且已 發(fā)現(xiàn)PtpA蛋白與宿主中兩個蛋白分子(包括自噬相關(guān)蛋白VPS33B和V-ATPase復(fù)合體的H 亞基)存在相互作用，從而干擾宿主細(xì)胞的自噬過程以及對結(jié)核分枝桿菌的清除作用。但目 ill有關(guān)PtpA蛋白對細(xì)胞信號通路等方面的影響尚未明確。
[0004] 促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK) 級聯(lián)反應(yīng)通路是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能 活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。JNK和P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MPK通路的兩個重要分支，它們在細(xì)胞 增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用，而JNK和P38 蛋白激酶分別是兩個信號通路的中的關(guān)鍵調(diào)控因子。當(dāng)外界有細(xì)胞因子（TNFa，IL-1)、生 長因子（EGF)、特定抗原，以及紫外線和放射線等存在時，JNK和P38蛋白就會接受上游信 號分別被磷酸化活化成P-JNK和P-P38,并且進(jìn)一步磷酸化激活下游蛋白，進(jìn)而激活信號通 路，調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。我們之前的研究確定了可以抑制JNK和P38兩條信號通路 的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白PtpA，并發(fā)現(xiàn)泛素分子可以顯著提高PtpA的酶活性。
[0005] 本發(fā)明旨在進(jìn)一步揭示泛素調(diào)控PtpA的磷酸酶活性的分子機(jī)制及其調(diào)控序列及 關(guān)鍵的調(diào)控位點，進(jìn)而特異地調(diào)控PtpA酶活性及結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)存活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (Ubiquitin-interacting motif-like, UIML 結(jié)構(gòu)域)，其氨基酸序列如（a)或（b)或（c):
[0007] (a) SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列；
[0008] (b )在（a )中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有 泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能的由（a)衍生的多肽或其類似物；
[0009] (C)與（a)、（b)中氨基酸序列整體相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其類 似物。
[0010] 所述結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白是PtpA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所 述結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白PtpA可抑制JNK和P38兩條信號通路，泛素與PtpA通過WML結(jié) 構(gòu)域直接結(jié)合后顯著提高PtpA的磷酸酯酶活性。
[0011] 所述泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一種新的類似于真核細(xì)胞蛋白的UIM結(jié)構(gòu)域的類ΠΜ泛素 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是從PtpA蛋白的第115位氨基酸到第161位氨基酸，其中，疏水氨基酸序列 EEVFAVIESA (136-145)能夠與泛素發(fā)生疏水相互作用。
[0012] 所述WML結(jié)構(gòu)域的A26位點（即PtpA分子的A140位點）是可改變結(jié)核分枝桿菌 分泌蛋白與泛素分子結(jié)合能力的關(guān)鍵位點，該特異位點的突變（A140E)可導(dǎo)致Ub與PtpA結(jié) 合能力及其酶活調(diào)控功能的喪失。
[0013] 所述WML結(jié)構(gòu)域及其關(guān)鍵位點可用于制備抗結(jié)核藥物和新型疫苗，還可用于制 備調(diào)控JNK和P38的磷酸化水平的藥物。
[0014] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供所述WML結(jié)構(gòu)域蛋白的制備方法，是將 HML結(jié)構(gòu)域基因連接到載體pGEX-6P-l，得到重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-PtpA-UML ;將重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，用IPTG在30°C條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；超聲破菌、高速離心后收取 上清液；將上清液緩緩流過填充好的Glutathione-Sepharose beads中，然后加入柱洗漆緩 沖液充分洗滌柱子，最后加入2-3ml洗脫液洗脫蛋白；將收集的洗脫液加入到IOKD的蛋白 濃縮管中，3500rpm離心濃縮20分鐘；再在蛋白濃縮管中加入2mlPBS混勻后離心，分裝蛋 白，-80°C保存待用。
[0015] 本發(fā)明成果揭標(biāo)了宿主泛素分子被結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白PtpA分子所利用而提 高后者酶活的分子機(jī)制及其特異性結(jié)合序列及關(guān)鍵位點。本發(fā)明為基于PtpA分子的抗結(jié) 核藥物篩選和疫苗開發(fā)提供了特異性靶序列，基于該特性靶序列的抗結(jié)核新藥和新型疫苗 將有望提高抗結(jié)核治療的有效性和特異性并進(jìn)而降低抗結(jié)核藥物的毒副作用。此外，由于 臨床上多種疾病的發(fā)生都與JNK和P38信號通路的活性相關(guān)，調(diào)控JNK和P38的磷酸化水 平對于很多疾病都有控制作用。因此本發(fā)明成果將來還可為臨床多種疾病的治療提供新的 工具和思路，尤其在抗腫瘤等多種藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用等方面將有著廣闊的前景，也可 以直接應(yīng)用于科研領(lǐng)域或指導(dǎo)開發(fā)可逆性調(diào)控JNK和P38信號通路的制劑。
【附圖說明】
[0016] 圖I =PtpA蛋白序列及晶體結(jié)構(gòu)的解析。
[0017] 圖2 :結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白PtpAUML與宿主的Ub分子直接相互作用。
[0018] 圖3 :PtpA的A140E突變對泛素對PtpA磷酸酯酶活性調(diào)控能力的影響。
[0019] 圖4 :PtpA的A140E突變導(dǎo)致泛素喪失對其介導(dǎo)的去磷酸化p-JNK和p-P38的活 性調(diào)控功能。
【具體實施方式】
[0020] 結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白PtpA的制備方法、泛素蛋白的制備方法，以及泛素對 PtpA去磷酸化p-JNK和p-P38蛋白的影響、體外實驗反應(yīng)體系等參見中國發(fā)明專利申請 201310466907. 2 (-種使p-JNK和p-P38去磷酸化的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白PtpA)。