專利名稱：：結(jié)核分枝桿菌抗原限制性表位肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有抗結(jié)核的治療性活性肽，尤其是涉及一種結(jié)核分枝桿菌抗原限制性表位肽。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病治療性多肽疫苗發(fā)展的前提基礎(chǔ)是結(jié)核桿菌抗原的發(fā)現(xiàn)及其細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位的鑒定。結(jié)核抗原表位的鑒定，是設(shè)計基于CTL表位的結(jié)核多肽疫苗的重要途徑。Rvl410c為結(jié)核桿菌的耐藥相關(guān)蛋白，含有518個氨基酸，其基因在P25位點。已有報道指出，Rvl410c蛋白的功能可能為耐藥泵，存在于細胞膜上，其對氨基糖類抗生素與四環(huán)素有抗性作用，并證明其對利血平耐藥性與對溴化乙錠敏感性都有一定作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD8+CTL在抗結(jié)核感染保護性應(yīng)答中起著重要和獨特的作用，CD8+CTL對靶細胞發(fā)揮殺傷作用，必須能識別靶細胞表面與相應(yīng)MHC-I類分子結(jié)合的特異性抗原表位，即細胞毒性T淋巴細胞(CytotoxicTlymphocyte,CTL)表位。由一個或數(shù)個不同保護性抗原組成的融合蛋白亞單位疫苗以及抗原肽多表位疫苗占了目前全世界正在研究的170多種結(jié)核疫苗的大部分。保護效果優(yōu)于卡介苗且副作用小的亞單位疫苗將可能成為卡介苗的理想替代品。研究表明細胞免疫對結(jié)核桿菌感染具有保護性作用。在大多數(shù)感染中，細胞免疫反應(yīng)是由識別并結(jié)合的肽或非肽抗原決定的，最終在機體內(nèi)出現(xiàn)相對有限的數(shù)個病原特異性細胞免疫應(yīng)答，即免疫優(yōu)勢反應(yīng)，因此鑒定這些具有保護性作用的抗原優(yōu)勢表位是設(shè)計有效疫苗的重要步驟。由于CD8+T細胞識別抗原受等位基因MHC-I(HLA)的限制，篩選潛在的疫苗候選表位需要考慮到HLA限制性，以確保絕大多數(shù)人群中的抗原識別。由于個體內(nèi)僅存在少數(shù)幾個型別的MHC-I類分子，而每個MHC-I類分子可與一系列同種類的抗原肽結(jié)合進而形成多種多樣的MHC-肽復合物，這樣就使機體免疫系統(tǒng)可以針對眾多抗原發(fā)生特異性的免疫應(yīng)答。因此，篩選具有一定親和力與MHC-I類分子有效結(jié)合的表位肽，是誘導特異性細胞免疫應(yīng)答的一個重要環(huán)節(jié)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有一定親和力與MHC-I類分子有效結(jié)合的結(jié)核分枝桿菌抗原限制性表位肽。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案本發(fā)明所述的結(jié)核分枝桿菌抗原限制性表位肽，它包括候選肽P510、P452和P470，所述候選肽P510的氨基酸序列為TLAPQVEPL，分子量為967;所述候選肽P452的氨基酸序列為SLLDRAAAI，分子量為043;所述候選肽P470的氨基酸序列為LMYGEIFTI，分子量為1108。本發(fā)明的優(yōu)點在于利用結(jié)核桿菌自身的抗原篩選出具有抗結(jié)核的治療性活性肽，鑒定的上述候選肽均未見文獻報道，不僅為研制基于Rvl410c抗原的結(jié)核疫苗提供了理論基礎(chǔ)，并為設(shè)計基于混合T細胞表位的結(jié)核多表位肽疫苗提供更多的信息，為后續(xù)多價的抗原肽疫苗構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明運用Pubmed提供的結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，篩選結(jié)核桿菌耐藥蛋白，選取免疫原性強的保護性抗原進行BLAST同源性分析，其中與人類的蛋白質(zhì)同源性差異大于50%的蛋白質(zhì)作為候選的抗原。最終確定結(jié)核桿菌耐藥蛋白Rvl410c作為目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。根據(jù)抗原的一級結(jié)構(gòu)，采用免疫信息學手段，運用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL1.2數(shù)據(jù)庫對此蛋白抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位進行了預(yù)測分析，見表1。表1Rvl410c抗原HLA-A2以及HLA-A3限制性CTL表位預(yù)測蛋白位置序列SYFPEITHIBIMASNetCTL<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>從表1中可以看出在預(yù)測中，當A2的結(jié)合力在25分以上時，這些表位肽都將會成為我們將來所要研究的潛在的結(jié)核抗原表位疫苗。圖l-a，圖l-b是本發(fā)明候選肽的合成流程圖。圖2-a，圖2-b，圖2-c分別是候選肽P510、P452和P470的質(zhì)譜鑒定圖。圖3-a，圖3-b，圖3-c分別是候選肽P510、P452和P470的細胞流式圖。具體實施例方式本發(fā)明所述的結(jié)核分枝桿菌抗原限制性表位肽，它包括候選肽P510、P452和P470，所述候選肽P510的氨基酸序列為TLAPQVEPL(Thr-Leu-Ala-Pro-Qln-Val-Elu-Pro-Leu)，分子量為967;所述候選肽P452的氨基酸序列為SLLERAAAI(Ser-Leu-Leu-Elu-Arg-Ala-Ala-Ala-Ile)，分子量為943;所述候選肽P470的氨基酸序列為LMYGEIFTI(Leu-Met-Tyr-Gly-Glu-Ile-Phe-Thr-Ile)，分子量為1108。本發(fā)明表位肽采用標準Fmoc方案進行合成，如圖l-a，圖l_b所示，首先通過樹脂與目的多肽的第一位帶保護基的氨基酸在一定條件下進行縮合，隨后脫掉保護基，加入第二個氨基酸進行縮合。重復以上步驟，直到加入第九個氨基酸，脫掉其保護基后，利用切割試劑把九肽從樹脂上切下得到粗肽。經(jīng)HPLC純化后，其純度大于95%，得到精肽。質(zhì)譜分析并證實其分子量符合理論值。肽質(zhì)譜鑒定圖見圖2-a，圖2-b，圖2-c。肽/MHC結(jié)合力分析利用流式細胞術(shù)檢測待測肽與T2A2細胞的結(jié)合力，見圖3-a，圖3-b，圖3-c。候選肽與HLA-A*0201結(jié)合活性見表2。表2候選肽與HLA_A*0201結(jié)合力及穩(wěn)定性試驗結(jié)果FIa_1.980.40.38P510P452P470FIa=(表位肽平均熒光強度_背景平均熒光強度)/背景平均熒光強度，如果FI>1.5:候選肽與HLA-A*0201/03具有強結(jié)合力；1.5>FI>1.0:中等結(jié)合力；FI<0.5:弱結(jié)合力從表2中可以看出，候選肽P510與T2A2細胞的結(jié)合力較高，候選肽P452、P470與T2A2細胞的結(jié)合力較低一些。附氨基酸縮寫表5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求一種結(jié)核分枝桿菌抗原限制性表位肽，其特征在于它包括候選肽P510、P452和P470，所述候選肽P510的氨基酸序列為TLAPQVEPL，分子量為967；所述候選肽P452的氨基酸序列為SLLERAAAI，分子量為943；所述候選肽P470的氨基酸序列為LMYGEIFTI，分子量為1108。全文摘要本發(fā)明公開了一種結(jié)核分枝桿菌抗原限制性表位肽，它包括候選肽P510、P452和P470，所述候選肽P510的氨基酸序列為TLAPQVEPL，分子量為967；所述候選肽P452的氨基酸序列為SLLERAAAI，分子量為943；所述候選肽P470的氨基酸序列為LMYGEIFTI，分子量為1108。本發(fā)明的優(yōu)點在于利用結(jié)核桿菌自身的抗原篩選出具有抗結(jié)核的治療性活性肽，鑒定的上述候選肽均未見文獻報道，不僅為研制基于Rv1410c抗原的結(jié)核疫苗提供了理論基礎(chǔ)，并為設(shè)計基于混合T細胞表位的結(jié)核多表位肽疫苗提供更多的信息，為后續(xù)多價的抗原肽疫苗構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。文檔編號C07K7/00GK101724023SQ20101003022公開日2010年6月9日申請日期2010年1月21日優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日發(fā)明者呂虹,朱宇皇,祁元明,翟明霞,陳飛,高艷鋒申請人:鄭州大學