一種單克隆抗體與抗原和基因以及它們的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的狂犬病病毒單克隆抗體、相應(yīng)能夠用于制備高效價的單克隆抗體的抗原蛋白與編碼它們的基因以及它們的用途。本發(fā)明的單克隆抗體具有氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的輕鏈可變區(qū)以及氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的重鏈可變區(qū)，可以由保藏號為CGMCC?No.7956的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。本發(fā)明公開的抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示，可以由堿基序列如SEQ?ID?NO：4所示的基因編碼。本發(fā)明的單克隆抗體與國外同類產(chǎn)品的效價相當(dāng)，用于RFFIT檢測中時能夠表現(xiàn)出熒光強(qiáng)度和持久性均較高的特性。此外，以本發(fā)明的抗原蛋白作為抗原進(jìn)行免疫而制得的單克隆抗體的效價較高。
【專利說明】一種單克隆抗體與抗原和基因以及它們的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種狂犬病病毒單克隆抗體、狂犬病病毒的抗原蛋白、編碼它們的基 因以及它們的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前國際上通用的檢測狂犬病病毒（rabies virus)的快速熒光灶抑制試驗 (Rapid fluorescence focus inhibition test，RFFIT)方法：將固定量的病毒與系列稀釋 的待測血清和已知滴度的對照血清一起37°C溫育，加入敏感細(xì)胞懸液。再經(jīng)溫育后，細(xì)胞 形成單層，這時用冷的丙酮固定，用熒光標(biāo)記的狂犬病病毒核蛋白（NP)單克隆抗體染色，以 檢測未被中和的病毒的存在(熒光灶)，繼而計算每種待測血清中的抗體的效價。進(jìn)行RFFIT 檢測都需要熒光標(biāo)記的NP抗體，敏感高效的熒光標(biāo)記狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體診斷 試劑是該技術(shù)的關(guān)鍵因素。
[0003] 狂犬病病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量較低，不易從狂犬病病毒顆粒獲得大量純化的 NP，加之狂犬病病毒的NP不含糖基，本身免疫較弱，不易制備抗NP抗體。目前這種關(guān)鍵試 劑在國內(nèi)尚無獲得正式批準(zhǔn)文號的熒光標(biāo)記的狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體診斷試劑，而 進(jìn)口產(chǎn)品則價格昂貴、周期長，所以快速檢測狂犬病病毒抗原和抗體的方法在國內(nèi)一直未 能建立，嚴(yán)重影響了狂犬病的臨床診斷、疫苗質(zhì)量控制和流行病學(xué)調(diào)查等項工作的進(jìn)行。因 此，獲取新的狂犬病病毒抗體具有重大的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種新的狂犬病病毒單克隆抗體、相應(yīng)能夠用于制備高效價 的單克隆抗體的抗原蛋白與編碼它們的基因以及它們的用途。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體具有 氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所示的輕鏈可變區(qū)以及氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示的重鏈 可變區(qū)。
[0006] 第二方面，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞的保藏號為CGMCC No.7956。
[0007] 第三方面，本發(fā)明提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 7956的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
[0008] 第四方面，本發(fā)明提供了第一方面和/或第三方面所述的單克隆抗體在制備檢測 狂犬病病毒的試劑中的用途。
[0009] 第五方面，本發(fā)明提供了第一方面和/或第三方面所述的單克隆抗體在制備檢測 狂犬病病毒抗體的試劑中的用途。
[0010] 第六方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測待檢樣本中狂犬病病毒抗體的試劑盒，該 試劑盒含有熒光標(biāo)記的單克隆抗體和固定液，所述單克隆抗體為第一方面和/或第三方面 所述的單克隆抗體。 toon] 其中，所述待檢樣本一般為血清。
[0012] 所述固定液可以為75-85% (v/v)的丙酮水溶液。
[0013] 所述熒光標(biāo)記可以為本領(lǐng)域常用的各種熒光標(biāo)記,例如異硫氰酸熒光素（FITC)、 四乙基羅丹明（RB200)和羧基四甲基羅丹明（TAMRA)等。
[0014] 本發(fā)明的試劑盒還可以含有抗體稀釋液、洗液、標(biāo)準(zhǔn)品和封閉液等，本領(lǐng)域技術(shù)人 員能夠根據(jù)需要對此進(jìn)行選擇，在此不再贅述。
[0015] 第七方面，本發(fā)明提供了一種抗原蛋白，該抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0 :3 所示。
[0016] 第八方面，本發(fā)明提供了一種編碼第七方面所述的抗原蛋白的基因。優(yōu)選地，本發(fā) 明中編碼上述抗原蛋白的基因的喊基序列如SEQ ID N0 :4所不。
[0017] 第九方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，該重組載體具有第八方面所述的基因。
[0018] 第十方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子含有第九方面所述的重組載體。
[0019] 第十一方面，本發(fā)明還提供了編碼第一方面所述的單克隆抗體的輕鏈和/或重鏈 的基因。
[0020] 編碼第一方面所述的單克隆抗體的輕鏈的基因的堿基序列可以如SEQ ID N0 :11 所示。
[0021] 編碼第一方面所述的單克隆抗體的重鏈的基因的堿基序列可以如SEQ ID N0 :12 所示。
[0022] 本發(fā)明的單克隆抗體與國外同類產(chǎn)品的效價相當(dāng)，用于RFFIT檢測中時能夠表現(xiàn) 出熒光強(qiáng)度和持久性均較高的特性。此外，以本發(fā)明的抗原蛋白作為抗原進(jìn)行免疫而制得 的單克隆抗體的效價較高。
[0023] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
[0024] 生物保藏
[0025] 本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞為鼠雜交瘤細(xì)胞（Mouse Hybridoma)，于2013年7月12日被 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(縮寫為CGMCC，地址：北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)，保藏編號為CGMCC No.7956。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0027] 實(shí)施例中，使用的狂犬病病毒由中國疾病預(yù)防控制中心從北京市患狂犬病的病犬 大腦中分離得到，DMEM和胎牛血清（fetal serum of bovine，F(xiàn)BS)均購自Thermo公司。實(shí) 施例中，未注明具體條件的實(shí)驗方法的，均按照常規(guī)條件進(jìn)行。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] (1)抗原蛋白的制備
[0030] 參照《分子克隆實(shí)驗指南》第三版（J.薩姆布魯克等人，科學(xué)出版社，2002)第7-8 章，提取狂犬病病毒感染細(xì)胞的全RNA (該操作委托中國疾病預(yù)防控制中心完成)、逆轉(zhuǎn)錄得 到相應(yīng)的cDNA、以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR使用的上游引物如SEQ ID NO :5所示，下游引物如SEQ ID NO :6所示。
[0031] 上游引物：5' -GAACCATATGGATGCCGACAAGATTGTG-3'（SEQ ID NO :5)
[0032] 下游引物：5' -ACCTCGAGTTATGAGTCATTCGAATACG-3'（SEQ ID NO :6)
[0033] 委托華大基因?qū)CR擴(kuò)增獲得的基因進(jìn)行測序，得到其堿基序列如SEQ ID NO :4 所示。
[0034] TTATGAGTCATTOGAATAOGTCTTGTTTAGAAACTCGGCGAATGAGTTTGGACGGGCTTGATGATTGGAACT
[0035] GACTGAGACATATCTCOGTATATGOGATCTTTTTAGTOGACCTCCATTCATCATAATTCGAGCATAAACAGC
[0036] TTCTGGACCTCTGGTTTCACOGGAGAAGTAGTCTTCGTCATCAGAGTTGACAGTTCCATCATCTGCCAATGC
[0037] CAOGTCAGTCTTTGTCAGTTCAGCTGCCTCGTATTCTTGAAGTTCTTTCTCATCTCTGAAGAATCTTCTTTC
[0038] GAATGTTCCTCTCCCAAAGAATTCCTCCCCTAGATAGCCCCCTAGAACAGACATCTCATGAGGAGCACATGC
[0039] GGCAATAACTGTTGCATTTAGGGATCTGATTTGACCCATATAGCATCCAACAAAGTGAATAAGATTGAACAC
[0040] ATGACCAAOGGCATTCGATGAATAAGGAGACTTCCCACTCAAGCCTAGTGAACGGAAGTGAATGAAATAAGA [0041 ] GTGAGGAACAGCOGTCTCCTGCCCTGGCTCGAACATTCTTCTTATCTCTTCCTCAAAGTTCTTATGGAAGAA
[0042] GTACAATATTGCTTCTCTTGOGGTGAGATTGATCTGCTTTATGAACCCAGTAAACGATACCAGCCCTGAACA
[0043] GTCTTCATAAGCAGTAACAACTGTGCCCGCTCTGATTGCTGAATATAGATGCTCAATCCGAGAGAAAAACAT
[0044] GTOGTAGGTTCCGGCCAAAAATCTGAAGTTOGGTATGGTACTCCAATTAGCACACATTTTGTGAGTTGTCAT
[0045] TAGAGTATGGTGCTCCACGATTTTAACAAAAGGAGCTGTTTCAAAAATCTGCTCTATCCTATCTGCAATGTT
[0046] TGTTTTATAGTTACOGGTGTTTTGTCCTGATATTTTGCTCAACCTATACAGACTTAGGAGAAGACCAACCAA
[0047] AGATGCATGCTCAGAGACGGTGGGGTCCCTTGTCATCTCCATGCCTCCTGTCAGAGCCCAATTCCCTTCTAC
[0048] ATCATTACGTTTTATTTCCACCAGAGAATTTGGGGTGATCTTGTCTCCTTTTCGTGCAATCACGATTCCATA
[0049] GCTGGTCCAGTCTTCCGGACACGTCCCCTCAAAGAACTGCATTGCTGCTGCCAAGTAGGAACATACATCGTC
[0050] GGGATCAAGTTTGGOGGCATTCATGCCTGATAAAACTGATTTGTATGCTTTGTTCAAGTOGGGGGCTTTCCC
[0051] TAGGGTTATACAGGGCTTTTTCAAATCTTTGATAGCAGGGTACTTGTACTCATATTGATCCGCGATAATCTC
[0052] AGGCCTCAAAGAGACCACCTGATTATTAGCTCTGAACACAATCTTGTOGGCATCCAT (SEQ ID NO ：4)
[0053] 參照《分子克隆實(shí)驗指南》第三版（J.薩姆布魯克等人，科學(xué)出版社，2002)第1章 和第15章，將堿基序列如SEQ ID NO :4所示的基因連接到pET28a+(帶有His-tag)的Ndel 酶切位點(diǎn)與Xhol酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pET28a+-RV，將重組質(zhì)粒pET28a+-RV轉(zhuǎn)化入 原核表達(dá)菌株大腸桿菌BL21中，篩選陽性克隆并通過PCR(引物如SEQ ID N0:5和SEQ ID NO :6所示)驗證目的基因的成功導(dǎo)入，從而制備能夠表達(dá)上述基因的轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子并 超聲破碎菌體而獲得含有抗原蛋白的溶液，純化后得到濃度為12. 5mg/ml的抗原蛋白（氨 基酸序列如SEQ ID N0 :3所示)溶液，-80°C保存?zhèn)溆茫兓木唧w操作為：取含有抗原蛋白 的溶液，〇. 45um濾膜過濾后用DEAE離子親和層析對相應(yīng)的抗原蛋白做純化處理，純化后對 樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，選擇含有抗原成分的最佳的洗脫溶液，進(jìn)一步進(jìn)行鎳柱親和 純化)。
[0054] MDADKIVFRANNQWSLRPEIIADQYEYKYPAIKDLKKPCITLGKAPDLNKAYKSVLSGMNAAKLDPDDVCS
[0055] YLAAAMQFFEGTCPEDWTSYGIVIARKGDKITPNSLVEIKRNDVEGNWALTGGMEMTRDPTVSEHASLVGLL
[0056] LSLYRLSKISGQNTGNYKTNIADRIEQIFETAPFVKIVEHHTLMTTHKMCANWSTIPNFRFLAGTYDMFFSR
[0057] IEffi,YSAIRAGTWTAYEDCSGLVSFTGFIKQINLTAREAILYFFHKNFEEEIRRMFEPGQETAVPHSYFIH
[0058] FRSLGLSGKSPYSSNAVGHVFNLIHFVGCYMGQIRSLNATVIAACAPHEMSVLGGYLGEEFFGRGTFERRFF
[0059] RDEKELQEYEAAELTKTDVALADDGTVNSDDEDYFSGETRGPEAVYARIMMNGGRLKRSHIRRYVSVSSNHQ
[0060] ARPNSFAEFLNKTYSNDS (SEQ ID NO ：3)
[0061] (2)雜交瘤細(xì)胞的獲得
[0062] 根據(jù)《精編免疫學(xué)實(shí)驗指南》（科利根等人，科學(xué)出版社，2009)中第2章記載的方 法，用步驟（1)得到的抗原蛋白對雌性Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆， 并通過ELISA (可以參照《精編免疫學(xué)實(shí)驗指南》（科利根等人，科學(xué)出版社，2009)第1章單 元1. 1的基本方案部分）篩選陽性克隆子，最終選取陽性結(jié)果最好，即抗體表達(dá)量最佳的克 隆細(xì)胞株，經(jīng)培養(yǎng)后保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No. 7956， 保藏日期為2013年7月12日。
[0063] (3)單克隆抗體的制備
[0064] 參照《精編免疫學(xué)實(shí)驗指南》（科利根等人，科學(xué)出版社，2009)第1章培養(yǎng)步驟 (2)獲得的雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 7956,并參照《精編蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗指南》（科利根等人， 科學(xué)出版社，2007)第8章從培養(yǎng)液中提取純化單克隆抗體，獲得純化的單克隆抗體(或參 照CN101560255A中權(quán)利要求2記載的方法獲得)。
[0065] (4)單克隆抗體可變區(qū)氨基酸序列的確定
[0066] 參照《分子克隆實(shí)驗指南》第三版（J.薩姆布魯克等人，科學(xué)出版社，2002)第7-8 章或《精編免疫學(xué)實(shí)驗指南》（科利根等人，科學(xué)出版社，2009)中記載的方法，從雜交瘤細(xì)胞 中提取mRNA，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法分析編碼單克隆抗體的基因序列，進(jìn)而分析相應(yīng)的單克 隆抗體的氨基酸序列，使用的引物如表1所示，測得cDNA序列分別如表2中的SEQ ID N0 : 11 (輕鏈)和SEQ ID NO :12 (重鏈)所示，從而獲得單克隆抗體可變區(qū)氨基酸序列分別如表 2中的SEQ ID N0 :1 (輕鏈）和SEQ ID N0 :2 (重鏈）所示。
[0067] 表 1
[0068]

【權(quán)利要求】
1. 一種單克隆抗體，該單克隆抗體具有氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示的輕鏈可變區(qū) 以及氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重鏈可變區(qū)。
2. -種雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞的保藏號為CGMCC No. 7956。
3. -種單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 7956的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
4. 權(quán)利要求1或3所述的單克隆抗體在制備檢測狂犬病病毒的試劑中的用途。
5. 權(quán)利要求1或3所述的單克隆抗體在制備檢測狂犬病病毒抗體的試劑中的用途。
6. 用于檢測待檢樣本中狂犬病病毒抗體的試劑盒，該試劑盒含有熒光標(biāo)記的單克隆抗 體和固定液，所述單克隆抗體為權(quán)利要求1或3所述的單克隆抗體。
7. -種抗原蛋白，該抗原蛋白的氣基酸序列如SEQ ID NO :3所不。
8. -種編碼權(quán)利要求7所述的抗原蛋白的基因。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因，其中，該基因的堿基序列如SEQ ID NO :4所示。
10. -種重組載體，該重組載體具有權(quán)利要求8或9所述的基因。
11. 一種轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子含有權(quán)利要求10所述的重組載體。
12. -種編碼權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的輕鏈和/或重鏈的基因。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的基因，其中，編碼輕鏈的基因的堿基序列如SEQ ID NO :11 所示，編碼重鏈的基因的堿基序列如SEQ ID NO :12所示。
【文檔編號】C07K14/145GK104109205SQ201310516761
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】紀(jì)軍 申請人:紀(jì)軍