構(gòu)建lqt疾病模型的方法及其在篩選藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及構(gòu)建LQT疾病模型的方法及其在篩選藥 物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 先天性長QT綜合征（long QT syndrome，LQTS)屬于遺傳性心律失常，是由于編碼 心肌細(xì)胞離子通道的基因異常所導(dǎo)致，也被稱為"離子通道病"。LQTS患者具有QT間期延 長（大于0. 48秒）和T波形態(tài)異常的心電圖特征，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的暈厥和室性心律 失常，尤其是尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動過速（Torsade de pointes, TdP)。據(jù)統(tǒng)計，未經(jīng)治療的 LQTS患者的10年死亡率高達50%，且約1/2500的患者終身伴隨猝死風(fēng)險。美國近年數(shù)據(jù) 顯示，LQTS在人群中的發(fā)病率約1:2000~1:5000,尤其多見于兒童和青少年。據(jù)此推算， 我國LQTS患者接近30萬。由于LQTS具有發(fā)病突然、猝死率高、青少年多發(fā)的特點，已成為 遺傳性心律失常的研宄前沿和熱點。目前認(rèn)為先天性LQTS是由于調(diào)控心室肌細(xì)胞膜復(fù)極 化離子通道的基因發(fā)生突變所致。
[0003] 然而，目前關(guān)于LQTS疾病模型的研宄仍有待深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的 一個目的在于提出一種具有能夠有效構(gòu)建LQT疾病模型的方法。
[0005] 在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建心肌細(xì)胞的方法，構(gòu)建獲得的心肌 細(xì)胞可以作為LQT疾病模型。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：（1)利用附著體載體，將 重編程因子編碼基因引入攜帶LQTS相關(guān)突變基因的體細(xì)胞中，以便獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞； 以及（2)在適于所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的條件下，培養(yǎng)所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，以便獲得 心肌細(xì)胞，所述心肌細(xì)胞構(gòu)成所述LQTS疾病模型。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法，能夠 快速有效地制備獲得LQTS疾病模型，且適于構(gòu)建JLNS型LQT疾病S疾病模型，另外，本發(fā) 明的方法利用附著體載體方式進行重編程，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的基因組不穩(wěn)定性及潛 在的致癌性的風(fēng)險，提高重編程效率。已知附著體質(zhì)粒在作為載體將外源基因引入細(xì)胞中 時，不會整合到供體細(xì)胞基因組中，并且附著體質(zhì)粒可以在后續(xù)細(xì)胞傳代過程中丟失，因此 可以得到無外源基因整合的重組細(xì)胞。但之前的很多嘗試?yán)酶街w質(zhì)粒作為載體將重編 程因子引入體細(xì)胞中來獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC)都未能成功，原因在于獲得誘導(dǎo)多能 干細(xì)胞需要同時轉(zhuǎn)入多個重編程因子，成功效率低。
[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人通過采用經(jīng)過優(yōu)化的重編程因子的組合以及附著體質(zhì)粒的分配， 可以成功地將重編程因子引入到來自LQT疾病患者的體細(xì)胞中。在本文中，所使用的術(shù)語 "重編程因子"是指一種或多種生物活性因子（例如生物活性因子混合物），其作用在細(xì)胞 上以改變轉(zhuǎn)錄，從而使細(xì)胞重編程為多潛能性（multipotency)或多能性（pluripotency) 細(xì)胞?？梢韵蚣?xì)胞提供重編程因子，所述細(xì)胞例如來自具有感興趣心臟病的家族史或遺傳 組成的個體的細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、尿液細(xì)胞等，這些因子能夠單獨提供或以 重編程因子的單一組合物（即預(yù)先混合的組合物）來提供?？梢韵嗤哪柋然虿煌哪?爾比來提供該因子?？梢栽谂囵B(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞的過程中一次或多次提供該因子。根據(jù)本發(fā) 明的實施例，所述重編程因子包括：0CT4、S0X2、KLF4、NANOG、SV40LT、L-MYC和LIN28。由此， 有利于提高重編程效率。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述附著體載體包括：第一附著體質(zhì)粒，所 述第一附著體質(zhì)粒攜帶編碼0CT4的核苷酸序列、編碼S0X2的核苷酸序列、編碼KLF4的核 苷酸序列、編碼NANOG的核苷酸序列；第二附著體質(zhì)粒，所述第二附著體質(zhì)粒攜帶編碼0CT4 的核苷酸序列、編碼S0X2的核苷酸序列、編碼KLF4的核苷酸序列、編碼SV40LT的核苷酸序 列；以及第三附著體質(zhì)粒，所述第三附著體質(zhì)粒攜帶編碼L-MYC的核苷酸序列、編碼LIN28 的核苷酸序列。由此，能夠有效提高重編程效率，且第三附著體質(zhì)粒攜帶編碼L-MYC的核苷 酸序列可以大大降低致癌風(fēng)險。在本發(fā)明的實施例中，發(fā)明人還利用常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn) 染方法來獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，通過比較發(fā)現(xiàn)，通過采用上述附著體質(zhì)粒組合，可以實現(xiàn)下 列優(yōu)點的至少之一：
[0007] 1)安全，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以獲得無外源基因整合的iPSC，具有很大的細(xì) 胞治療方面的潛力；而逆轉(zhuǎn)錄病毒在重編程過程中會整合到細(xì)胞基因組中去，會對供體細(xì) 胞基因組造成一定的干擾，并有致癌風(fēng)險。
[0008] 2)與傳統(tǒng)質(zhì)粒相比，附著體質(zhì)粒的表達時間較長，可以隨細(xì)胞的復(fù)制而復(fù)制，丟失 較慢，因此對于2-3周的重編程來講，可以起到穩(wěn)定表達外源基因的作用。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述攜帶LQT相關(guān)突變基因的體細(xì)胞為來自LQT患者的尿 液細(xì)胞。由此，避免了從皮膚等部位取樣而對患者造成的疼痛和傷害。本發(fā)明的發(fā)明人驚 奇地發(fā)現(xiàn)利用本發(fā)明經(jīng)過優(yōu)化的重編程因子的組合以及附著體質(zhì)粒的分配，可以成功地將 重編程因子引入到來自LQT疾病患者的尿液細(xì)胞中。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述LQT相關(guān)突變基因與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列 (NCBI索取號：CCDS7736. 1)相比具有c. 605-2A>G/c. 815G>A的突變。換句話說，也就是SEQ ID NO: 1中第605位的A突變?yōu)镚，第815位的G突變?yōu)锳。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟（1)進一步包括：（1-1)將所述附著體載體轉(zhuǎn)染所述攜 帶LQT相關(guān)突變基因的體細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)染后的體細(xì)胞；（1-2)于37°C、5% CO2條件下，利 用無滋養(yǎng)層人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC)重編程培養(yǎng)基培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染后的體細(xì)胞；（1-3)在 轉(zhuǎn)染后的第15天將培養(yǎng)基換成mTeSRl繼續(xù)培養(yǎng)；（1-4)在轉(zhuǎn)染后的第25天，選取具有典 型人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形態(tài)的克隆進行純化擴增，以便獲得所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。由此，能夠 快速有效地制備獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，且重編程效率高、致癌風(fēng)險低、安全性高。另外，獲得 的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞核型正常，高表達多能性標(biāo)記物內(nèi)源0ct4和內(nèi)源Sox2, Nanog，Rexl，表 達量與人胚胎干細(xì)胞株H9相當(dāng)。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述編碼0CT4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :2所示的 序列；所述編碼S0X2的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :3所示的序列；所述編碼NANOG的核 苷酸序列具有如SEQ ID NO :4所示的序列；所述編碼SV40LT的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :5所示的序列；所述編碼KLF4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :6所示的序列；所述編碼 L-MYC的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :7所示的序列；以及所述編碼LIN28的核苷酸序列 具有如SEQ ID NO :8所不的序列。由此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以進一步提尚重編程的效率。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，由誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法并不受特別限 制，發(fā)明人經(jīng)過多次篩選實驗，發(fā)現(xiàn)，可以所述心肌細(xì)胞是通過下列步驟獲得的。具體的， 步驟⑵進一步包括：（2-1)利用分散酶對步驟⑴中所得到的所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進行 分散，（2-2)按照2X10 5個細(xì)胞/10平方厘米，將所述多能干細(xì)胞接種在包被基質(zhì)膠的含有 mTeSRl培養(yǎng)基的平板上，并培養(yǎng)至融合度為70~90%融合度；（2-3)在超慢貼附六孔板 中，使用ACCUTASE細(xì)胞消化液，將步驟（2-2)中所得到的培養(yǎng)物消化為單細(xì)胞，并在含有 Matrigel (40mg/mL)、BMP4 (Ing/mL ;Invitrogen)和 Rho 激酶抑制劑（ROCK) (IOmM ;R&D)的 mTeSRl培養(yǎng)基中5%氧氣條件下進行培養(yǎng)24小時；（2-4)將步驟（2-3)中所得的培養(yǎng)物 進行清洗，并更換為含有抗壞血酸（AA, 50mg/mL ;Sigma)、2mM Gluta-MAX-I (Invitrogen)、 BMP4(10ng/mL)和人重組激活素-A(10ng/mL ;Invitrogen)的 StemPro34SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng) 三天；以及（2-5)向所得到的培養(yǎng)物中添加 Wnt抑制劑IWR-I (5mM;Enzo Life Sciences) 后繼續(xù)培養(yǎng)4天，以便獲得所述心肌細(xì)胞。由此可以顯著提高獲得心肌細(xì)胞的效率。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種心肌細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述心 肌細(xì)胞是通過前面所述的方法構(gòu)建的。
[0015] 在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了前面所述的心肌細(xì)胞在篩選藥物中的用途， 所述藥物用于治療LQT疾病，優(yōu)選JLNS型LQT疾病。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的心肌細(xì)胞保留 LQTS的基因型，心肌細(xì)胞表現(xiàn)出的特性與患者的臨床特征相吻合，通過使所述心肌細(xì)胞與 藥物接觸，能夠有效篩選用于治療LQT疾病，特別是JLNS型LQT疾病的藥物。具體的，根據(jù) 本發(fā)明的實施例，將候選化合物與根據(jù)本發(fā)明實施例的心肌細(xì)胞接觸，并且檢測與候選化 合物前后，心肌細(xì)胞的動作電位時程的延長，如果接觸后動作電位時程明顯的延長得到明 顯改善，則說明該候選化合物可以用于治療LQT疾病。利用該方法，發(fā)明人驗證了目前所使 用的exiletine滿足上述篩選要求。
[0016] 在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā) 明的實施例，該方法包括：（1)利用附著體載體，將重編程因子編碼基因引入體細(xì)胞；以及 (2)在適于體細(xì)胞重編程的條件下，對步驟（1)中得到的細(xì)胞進行培養(yǎng)，以便獲得誘導(dǎo)多能 干細(xì)胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的該方法能夠快速有效地