專利名稱：：用于篩選藥物的報(bào)告基因細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的，本發(fā)明涉及一種獨(dú)特的基因構(gòu)建物，含有所述構(gòu)建物的載體，含有所述載體的細(xì)胞，所述細(xì)胞可作為模型用于蛋白激酶c信號(hào)通路調(diào)節(jié)藥物的篩選。
背景技術(shù)：
：隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，基于細(xì)胞的藥物篩選模型被廣泛應(yīng)用于新藥開(kāi)發(fā)，特別是在對(duì)大量化合物的高通量篩選中。蛋白激酶C(PKC)是一類Ca2+、磷脂依賴性的蛋白激酶，在跨膜信號(hào)傳遞過(guò)程中起重要作用，介導(dǎo)多種膜受體，如G蛋白偶聯(lián)受體，酪氨酸激酶受體等的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。受體激活后導(dǎo)致下游信號(hào)分子的活化，如G蛋白、PLC等，這些信號(hào)分子再進(jìn)一步活化PKC，進(jìn)而引起基因的轉(zhuǎn)錄。TPA反應(yīng)元件(TRE)是與PKC信號(hào)偶聯(lián)的反應(yīng)元件，當(dāng)PKC激活后會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子AP-1與TRE的結(jié)合，從而激活TRE下游的基因轉(zhuǎn)錄[參見(jiàn)NetDasEvcimen，GeorgeL.King,TheroleofproteinkinaseCactivationandthevascularcomplicationsofdiabetes,PharmacologicalResearch55(2007)498-510]。PKC與多種疾病相關(guān)，如腫瘤侵襲、糖尿病綜合癥、脈管類疾病等，目前正作為一個(gè)熱門的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行新藥開(kāi)發(fā)。已上市的PKC抑制劑有禮來(lái)公司的ruboxistaurin[參見(jiàn)BirchKA,HeathWF，HermelingRN,JohnstonCM,Stra,L，DellC，SmithC，WilliamsonJR,Reifel-MillerA，LY290181,aninhibitorofdiabetes-inducedvasculardysfunction,blocksproteinkinaseC_stimulatedtranscriptionalactivationthroughinhibitionoftranscriptionfactorbindingtoaphorbolresponseelement,Diabetes.1996May;45(5):642-50]，用于治療糖尿病視網(wǎng)膜綜合癥，另外還有多個(gè)PKC抑制劑正在進(jìn)行臨床研究，包括治療糖尿病微血管并發(fā)癥的PKC-P抑制劑，治療乳腺癌的PKC-a反義藥物Affinitak，治療多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的4enzastaurin等[參見(jiàn)EricChurchill,GrantBudas，AliceVallentin,TomoyoshiKoyanagi，andDariaMochly-Rosen，PKCIsozymesinChronicCardiacDisease:PossibleTherapeuticTargets1Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2008.48:20.1-20.31]。PKC信號(hào)通路還與多種細(xì)胞膜受體的功能相關(guān)，可以通過(guò)檢測(cè)PKC的激活間接監(jiān)測(cè)受體的活性，從而用于受體的藥物篩選。G蛋白偶聯(lián)受體是人體內(nèi)最主要的一類與疾病相關(guān)的細(xì)胞膜受體超家族，其內(nèi)源配體囊括了激素，神經(jīng)遞質(zhì)，細(xì)胞因子，鈣離子，以及感官刺激等[參見(jiàn)NeubigRR，SiderovskiDP,RegulatorsofG-proteinsignallingasnewcentralnervoussystemdrugtargets,NatRevDrugDiscov.2002Mar;1(3):187-97]。市場(chǎng)上有近2/3的藥物都通過(guò)作用于GPCR起效，在藥物開(kāi)發(fā)中具有巨大價(jià)值。綜上，本領(lǐng)域還有必要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)調(diào)節(jié)PKC信號(hào)通路的物質(zhì)，建立篩選PKC信號(hào)通路調(diào)節(jié)物質(zhì)的模型或方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可用于篩選調(diào)節(jié)蛋白激酶C(PKC)信號(hào)通路的物質(zhì)的細(xì)胞模型及其用途。本發(fā)明的目的還在于提供基于所述細(xì)胞模型來(lái)篩選調(diào)節(jié)PKC信號(hào)通路的物質(zhì)的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物從5'端到3'端依次含有式I所示的結(jié)構(gòu)A—B—C(式I)其中，A具有SEQIDNO:5中第2-82位所示的序列(較佳的，A由SEQIDNO:5中第2-82位所示的序列構(gòu)成)；B為巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子序列；C為報(bào)告基因序列。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物從5'端到3'端依次含有式II所示的結(jié)構(gòu)A—B—C—D(式II)其中，D為Zeocin抗性基因序列;在另一優(yōu)選例中，所述的報(bào)告基因選自綠色熒光蛋白(GFP)基因，禾口/或熒光素酶(luciferase)基因。在另一優(yōu)選例中，所述的綠色熒光蛋白是增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)。在另一優(yōu)選例中，所述的報(bào)告基因是綠色熒光蛋白基因和熒光素酶基因的融合基因。在另一優(yōu)選例中，綠色熒光蛋白基因位于熒光素酶基因的下游。在另一優(yōu)選例中，A、B、C或D各元件之間為可操作地相連接。在另一優(yōu)選例中，A、B、C或D各元件之間具有0-1000bp的間隔序列。優(yōu)選的，A、B元件之間具有0-20bp(更佳的0-10bp，如3bp)的間隔序列；B、C元件之間具有0-1000bp(如735bp)的間隔序列；C、D元件之間具有0-600bp(如371bp)的間隔序列。在本發(fā)明的第二方面，提供一種載體，所述的載體中含有所述的構(gòu)建物。在本發(fā)明的第三方面，提供一種細(xì)胞，所述細(xì)胞具有蛋白激酶C信號(hào)通路；并且，所述細(xì)胞含有所述的載體；或其基因組中整合有所述的構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是真核細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞選自(但不限于)CH0細(xì)胞，HEK-293細(xì)胞或Hela細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞含有Gi/o偶聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR，如CCR5)或酪氨酸激酶受體(也是PKC通路成員)。在本發(fā)明的第四方面，提供所述的細(xì)胞的用途，用于篩選調(diào)節(jié)(如激活或抑制)蛋白激酶C(PKC)信號(hào)通路的物質(zhì)(如小分子、化合物或多肽)。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞用于蛋白激酶C激活劑(如激動(dòng)劑)或抑制劑(如拮抗劑)的篩選，或用于G蛋白偶聯(lián)受體的激活劑或抑制劑的篩選。在本發(fā)明的第四方面，提供一種篩選調(diào)節(jié)蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(1)將候選物質(zhì)給予所述的細(xì)胞；和(2)檢測(cè)所述細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)情況；其中，若所述候選物質(zhì)可提高報(bào)告基因的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是激活蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低報(bào)告基因的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是抑制蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，步驟(l)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到所述的細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)中；和/或步驟(2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中報(bào)告基因的表達(dá)，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的所述的細(xì)胞；如果測(cè)試組中報(bào)告基因的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(優(yōu)選顯著高于，如高50°/。以上，較佳的高100%以上；更佳的高200。/。以上)對(duì)照組，就表明該候選物是激活蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)；如果測(cè)試組報(bào)告基因的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低于，如低50%以上，較佳的低100%以上；更佳的低200%以上)對(duì)照組，就表明該候選物是抑制激活蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于調(diào)節(jié)蛋白激酶C信號(hào)通路有用的物質(zhì)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。圖l顯示了重組報(bào)告基因載體的示意圖。圖2顯示了PKC激動(dòng)劑在轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因載體的HEK-293細(xì)胞中可激活熒光素酶的表達(dá)。其中，A，轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因質(zhì)粒但未加入PKC激動(dòng)劑刺激的細(xì)胞；B，轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因質(zhì)粒同時(shí)還加入100nMPKC激動(dòng)劑刺激的細(xì)胞；C，裂解細(xì)胞后檢測(cè)得到的熒光素酶活性與gal(beta-gal)活性的比值比較(n二2，平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差)。圖3顯示了PKC激動(dòng)劑在轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因載體的Hela細(xì)胞中可激活熒光素酶的表達(dá)。其中，A，轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因質(zhì)粒但未加入PKC激動(dòng)劑刺激的細(xì)胞；B，轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因質(zhì)粒同時(shí)還加入100nMPKC激動(dòng)劑刺激的細(xì)胞，C，裂解細(xì)胞后檢測(cè)得到的熒光素酶活性與P-gal活性的比值比較(n二2，平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差)。圖4顯示了PKC激動(dòng)劑以及CCR5激動(dòng)劑在CH0/CCR5/luc細(xì)胞系中均可激活報(bào)告基因的表達(dá)。其中，A，未加入激動(dòng)劑剌激的CH0/CCR5/luc細(xì)胞；B，加入100nMPKC激動(dòng)劑PMA刺激的CH0/CCR5/luc細(xì)胞；C，加入10nMCCR5激動(dòng)劑RANTES刺激的CH0/CCR5/luc細(xì)胞；D，裂解細(xì)胞后檢測(cè)得到的熒光素酶活性比較(『2，平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差)。圖5顯示了CCR5激動(dòng)劑RANTES對(duì)CH0/CCR5/luc細(xì)胞系中報(bào)告基因的激活作用呈濃度依賴性。其中，A，CH0/CCR5/lucG4克??；B，CH0/CCR5/lucE8克?。籆，CH0/CCR5/lucA10克隆;D，CH0/CCR5/lucHll克?。籈，CH0/CCR5/lucD2克隆；包括5個(gè)RANTES的濃度梯度0.1nM，1nM，3.16nM，10nM，和IOOnM。(n=2，平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差)。圖6顯示了PKC抑制劑在轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因載體的Hela細(xì)胞中可抑制PMA引起的報(bào)告基因的表達(dá)。其中，PKC抑制劑為Ro-318220(Ro)，所用濃度為luM。圖7顯示了CCR5拮抗劑在CH0/CCR5/luc細(xì)胞系中可抑制報(bào)告基因表達(dá)的激活。四個(gè)CCR5拮抗劑作為篩選樣品，其CCR5活性在其他實(shí)驗(yàn)中己知。DMSO作為陰性對(duì)照。(n=2，平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差)。8具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入研究和設(shè)計(jì)，在質(zhì)粒載體中組合兼容包括12-0-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯(TPA)反應(yīng)元件(TRE)、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、報(bào)告基因和抗性基因的元件，這些元件可良好的配合，在轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，可在細(xì)胞內(nèi)高靈敏度地報(bào)告蛋白激酶C信號(hào)通路的情況。如本文所用，所述的"可操作地連接"是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動(dòng)子區(qū)被置于相對(duì)于報(bào)告基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被"可操作地連接"到該核酸序列上。構(gòu)建物及載體本發(fā)明提供了一種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物從5'端到3'端依次含有TRE重復(fù)序列，CMV啟動(dòng)子序列，和報(bào)告基因序列。所述的TRE是作為與PKC信號(hào)偶聯(lián)的反應(yīng)元件，當(dāng)PKC被激活或被抑制后，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子AP-1與TRE發(fā)生反應(yīng)，從而啟動(dòng)TRE下游基因的表達(dá)。本發(fā)明的構(gòu)建物中，TRE的下游基因?yàn)閳?bào)告基因，因此可通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)方便地得知PKC的激活或抑制情況。本發(fā)明采用TRE重復(fù)序列，比采用單一TRE具有更好的反應(yīng)靈敏性。單個(gè)的TRE由9個(gè)堿基組成ATGAGTCAG。優(yōu)選的，所述的TRE重復(fù)序列含有9個(gè)TRE序列(9XTRE);更優(yōu)選的，所述的9個(gè)TRE序列之間不含有其它間隔性的堿基序列(即具有SEQIDNO:5中第2-82位所示的序列)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于有間隔序列的情況，采用9個(gè)連續(xù)串聯(lián)的TRE序列(其中無(wú)間隔堿基序列)制備構(gòu)建物，在轉(zhuǎn)入細(xì)胞并制備成細(xì)胞篩選模型后，當(dāng)受到PKC調(diào)節(jié)劑刺激時(shí)，細(xì)胞模型的敏感性更理想。所述的"啟動(dòng)子"是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5'端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。本發(fā)明釆用CMV啟動(dòng)子，所述的CMV啟動(dòng)子適用于作為真核表達(dá)啟動(dòng)子。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的報(bào)告基因啟動(dòng)子為去除增強(qiáng)子的CMVmin啟動(dòng)子，這是由于CMV本身具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，其自帶的增強(qiáng)子可一定程度提高信號(hào)本底，并且去除增強(qiáng)子的CMV更有利于TRE增強(qiáng)子與報(bào)告基因的直接偶聯(lián)，所述啟動(dòng)子例如可從pcDNA3質(zhì)粒上頁(yè)通過(guò)PCR或酶切的方式獲得。在CMV啟動(dòng)子的下游為報(bào)告基因，所述的報(bào)告基因與CMV啟動(dòng)子可操作的相連接，所述的報(bào)告基因可以是不影響所述TRE重復(fù)序列的反應(yīng)狀態(tài)、可在CMV啟動(dòng)子的啟動(dòng)下表達(dá)、且可指示(或被檢測(cè)到)表達(dá)情況的基因。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的報(bào)告基因選自綠色熒光蛋白(GFP)基因，禾B/或熒光素酶(luciferase，Luc)基因。GFP作為一種標(biāo)記蛋白，其內(nèi)源熒光基團(tuán)在受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)可高效發(fā)射清晰可見(jiàn)的綠光。所述的GFP還包括在野生型GFP基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的蛋白，比如進(jìn)行基因優(yōu)化(如去除隱蔽性內(nèi)含子等)；或通過(guò)氨基酸替換提高GFP脫輔基蛋白在高溫(如37'C)條件下的正確折疊，以及改變GFP光譜特性等。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的GFP是增效的綠色熒光蛋白(EGFP)，EGFP為對(duì)綠色熒光蛋白進(jìn)行改進(jìn)后的蛋白，與GFP具有很高的同源性，在表達(dá)后發(fā)光的效果更為理想。本領(lǐng)域人員很容易獲得GFP或EGFP的序列，例如，可從pEGFP-Nl質(zhì)粒上通過(guò)PCR或酶切的方式獲得。熒光素酶作為報(bào)告基因有如下特點(diǎn)l)本底低熒光素酶本身在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，與特定的反應(yīng)元件偶聯(lián)后可用于特定藥物的篩選；2)反應(yīng)敏感熒光素酶介導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率高，發(fā)光強(qiáng)，易于檢測(cè)；3)反應(yīng)迅速熒光素酶介導(dǎo)的發(fā)光反應(yīng)速度快，每個(gè)樣品僅需幾秒種的檢測(cè)時(shí)間；4)底物清潔熒光素底物反應(yīng)敏感且不含同位素，有益于生態(tài)環(huán)境的保護(hù)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的報(bào)告基因是GFP和Luc的融合基因。釆用GFP作為報(bào)告基因，可在不裂解細(xì)胞的情況下、通過(guò)較為直觀的方法觀察到細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)的情況(呈現(xiàn)綠色)；釆用Luc作為報(bào)告基因，需要將細(xì)胞裂解，加入熒光素酶底物，測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確性高。因此將兩者進(jìn)行融合來(lái)作為報(bào)告基因，將更有利于藥物篩選過(guò)程中對(duì)結(jié)果的判斷。作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，所述的構(gòu)建物中，在報(bào)告基因的下游，還包含有Zeocin抗性基因序列。本領(lǐng)域人員可理解，不同抗性基因?qū)τ谄渖舷掠蔚囊恍┰墓δ?、或?qū)τ谀康幕虻谋磉_(dá)可產(chǎn)生不同的影響，因而需要在構(gòu)建時(shí)選擇合適的抗性基因。而采用Zeocin作為抗性基因來(lái)制備構(gòu)建物，Zeocin的表達(dá)對(duì)于TRE的反應(yīng)影響較小，且可良好地用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選和單克隆。在所述的構(gòu)建物中，A、B、C或D各元件之間以可操作的方式進(jìn)行連接，各種功能性元件的操作性連接方式是本領(lǐng)域人員所熟知的。通常，A、B、C或D各元件之間具有0-1OOObp的間隔序列。本發(fā)明還提供了一種載體，所述的載體含有前面所述的構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體是適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的克隆和表達(dá)的載體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的表達(dá)載體是PGL系列載體，更優(yōu)選的為PGL-3載體。含有所述構(gòu)建物的PGL-3載體在轉(zhuǎn)入細(xì)胞并制備成細(xì)胞篩選模型后，細(xì)胞模型的敏感性特別好。所述的載體中還可以含有一些對(duì)于TRE的反應(yīng)或報(bào)告基因的表達(dá)沒(méi)有負(fù)面影響作用的其它元件。細(xì)胞模型及用途本發(fā)明還提供一種細(xì)胞，所述細(xì)胞具有蛋白激酶C信號(hào)通路；并且，所述細(xì)胞含有前面所述的載體；或其基因組中整合有前面所述的構(gòu)建物。所述的細(xì)胞對(duì)于檢測(cè)蛋白激酶C信號(hào)通路的變化特別敏感，可作為良好的藥物篩選細(xì)胞模型。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞是真核細(xì)胞。蛋白激酶C信號(hào)通路廣泛分布于真核細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞選自(但不限于)CH0細(xì)胞，服K-293細(xì)胞或Hela細(xì)胞。所述的細(xì)胞帶有真核抗性，所述的真核抗性為Zeocin抗性，可良好地用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選和單克隆。本發(fā)明的細(xì)胞可作為細(xì)胞模型，用于篩選調(diào)節(jié)(如激活或抑制)蛋白激酶C(PKC)信號(hào)通路的物質(zhì)，也即篩選蛋白激酶C信號(hào)通路的激活劑(如激動(dòng)劑、上調(diào)劑等)或抑制劑(如拮抗劑，下調(diào)劑等)。所述的物質(zhì)例如小分子物質(zhì)、化合物或多肽。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞還含有Gi/o偶聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體(如CCR5)或酪氨酸激酶受體。上述受體存在于細(xì)胞膜上，與PKC信號(hào)通路相關(guān)。例如，CCR5在被激活后，可引起下游信號(hào)分子的活化，再進(jìn)一步活化PKC，進(jìn)而引起基因的轉(zhuǎn)錄。因此，可通過(guò)檢測(cè)PKC的激活間接監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜相關(guān)受體的活性，從而用于受體的藥物篩選。本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建報(bào)告基因細(xì)胞模型的方法，包括以下步驟(1)將EGFP序列連接到pGL3載體上的熒光素酶基因序列的下游，連接后得到熒光素酶與EGFP的融合基因；(2)將zeocin抗性基因連接到(l)獲得的載體中熒光素酶與EGFP的融合基因的下游，用于真核抗性篩選；(3)將CMVmin啟動(dòng)子連接于(2)獲得的載體上熒光素酶與EGFP的融合基因的上游，構(gòu)成真核表達(dá)元件；(4)將9個(gè)串聯(lián)的TRE序列連接到(3)獲得的載體上；(5)在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染(4)獲得的質(zhì)粒，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，zeocin篩選兩周后挑選單克隆，培養(yǎng)成細(xì)胞系。在另一優(yōu)選例中，EGFP序列通過(guò)NcoI酶切位點(diǎn)與pGL3質(zhì)粒上的熒光素酶基因連接構(gòu)成熒光素酶與EGFP融合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞選自HEK-293和Hela。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞為CHO/CCR5(即含有CCR5的CHO細(xì)胞)。篩選方法本發(fā)明以TRE作為分子靶點(diǎn)，可進(jìn)行針對(duì)PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物篩選，包括(但不限于)PKC激活劑或抑制劑的篩選，或偶聯(lián)PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的細(xì)胞受體(如G蛋白偶聯(lián)受體或酪氨酸激酶受體)激活劑或抑制劑的篩選。因此，本發(fā)明提供了一種篩選調(diào)節(jié)蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括將候選物質(zhì)給予所述的細(xì)胞；和檢測(cè)所述細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)情況；其中，若所述候選物質(zhì)可提高報(bào)告基因的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是激活蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低報(bào)告基因的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是抑制蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，為了更易于觀察到蛋白激酶C信號(hào)通路的變化，還可設(shè)置對(duì)照組，所述的對(duì)照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的所述的細(xì)胞。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，應(yīng)用PKC激動(dòng)劑來(lái)激活所述細(xì)胞中的PKC信號(hào)通路，從而篩選可拮抗PKC激動(dòng)劑對(duì)于PKC信號(hào)通路的激活作用的拮抗劑。12在本發(fā)明的一些實(shí)例中，提供了篩選PKC信號(hào)通路的拮抗劑方法，包括先釆用PKC激動(dòng)劑(如佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯，PMA)激活細(xì)胞內(nèi)的PKC信號(hào)通路，然后用候選藥物處理細(xì)胞，觀察候選藥物處理前后細(xì)胞內(nèi)的報(bào)告基因的表達(dá)情況，如被PKC激動(dòng)劑激活的PKC信號(hào)通路在候選藥物處理后表達(dá)比處理前顯著降低，則該候選藥物是潛在的PKC信號(hào)通路的拮抗劑。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，應(yīng)用表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體的所述細(xì)胞模型來(lái)篩選，從而篩選通過(guò)調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體而影響PKC信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑。在本發(fā)明的一些實(shí)例中，提供了篩選G蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑或拮抗劑的方法。例如，篩選G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑(如完全拮抗劑或者部分拮抗劑)的方法包括先應(yīng)用G蛋白偶聯(lián)受體(如CCR5)激動(dòng)劑(如可選自RANTES、MIP-la或MIP-l(3)處理細(xì)胞，然后用候選藥物處理細(xì)胞，觀察候選藥物處理前后細(xì)胞內(nèi)的報(bào)告基因的表達(dá)情況，如被G蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑激活的PKC信號(hào)通路在候選藥物處理后表達(dá)比處理前顯著降低，則該候選藥物是潛在的PKC信號(hào)通路的拮抗劑，或是潛在的G蛋白偶聯(lián)受體的拮抗劑。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個(gè)篩選庫(kù)，可對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于調(diào)節(jié)蛋白激酶C信號(hào)通路有用的物質(zhì)。因此，本發(fā)明還包括一類通過(guò)本發(fā)明的篩選方法獲得的調(diào)節(jié)PKC信號(hào)通路或細(xì)胞受體的調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)首次在質(zhì)粒載體中優(yōu)化組合了TPA反應(yīng)元件(TRE)、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、報(bào)告基因和抗性基因，這些元件可良好的配合，在轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，可在細(xì)胞內(nèi)高靈敏度地報(bào)告蛋白激酶C信號(hào)通路的情況。(2)本發(fā)明的細(xì)胞模型可用于對(duì)多個(gè)藥物靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，以及進(jìn)行針對(duì)多種適應(yīng)癥的藥物篩選，包括糖尿病，慢性心臟病，HIV感染，自身免疫性疾病等°(3)本發(fā)明可高通量化，可快速、簡(jiǎn)便地篩選藥物，適合用于大規(guī)模的藥物篩選。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例l熒光素酶和EGFP融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建以pEGFP-Nl(Clontech)為模板，用PCR的方法獲得EGFP基因片段，并在引物兩端分別設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)HindIII和BspHI。pGL3(promega)用HindIII，Ncol雙酶切后，酶切產(chǎn)物與載體質(zhì)粒pGL3酶切片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定。經(jīng)鑒定連接成功的質(zhì)粒記為pGL3-EGFP，在導(dǎo)入細(xì)胞后可表達(dá)EGFP與螢光素酶(luciferase)的融合蛋白。EGFP引物序列Ph5GCAGATCTTCATGAGTCAGACAGGCGTGTACGG3(SEQIDNO.1);P2:5AGGAAGCTTCGGTCCCGGTG3(SEQIDNO.2)。實(shí)施例2插入真核抗性基因的報(bào)告基因載體構(gòu)建將pSV40/Zeo2質(zhì)粒(購(gòu)自invitrogen)用Bamffl和SalI雙酶切，回收得到的l.lkb條帶，與pGL3-EGFP的BglII和SalI雙酶切產(chǎn)物連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取5個(gè)單克隆在大腸桿菌內(nèi)擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定成功后的質(zhì)粒記為pGL3-EGFP-Zeo。實(shí)施例3插入真核表達(dá)調(diào)控元件的報(bào)告基因載體構(gòu)建以pcDNA3為模板，用PCR的方法拉CMVmllin啟動(dòng)子，并在引物兩端分別設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)BglII和HindIII，酶切產(chǎn)物與載體質(zhì)粒pGL3-EGFP-Zeo酶切產(chǎn)物連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取5個(gè)單克隆在大腸桿菌內(nèi)擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定成功后的質(zhì)粒記為pGL3-CMVmin-EGFP-Zeo。根據(jù)TRE的序列，設(shè)計(jì)9個(gè)串聯(lián)的TRE，并在體外人工合成兩條互補(bǔ)單鏈，序列兩端分別設(shè)計(jì)KpnI和BglII的酶切位點(diǎn)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。體外將兩條單鏈退火，退火產(chǎn)物與pGL3-CMVmin-EGFP-Zeo酶切產(chǎn)物直接連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取5個(gè)單克隆在大腸桿菌內(nèi)擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定成功后的質(zhì)粒記為pGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo，并送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，以鑒定所有反應(yīng)元件序列的正確性。報(bào)告基因載體的模式圖如圖l。CMVmin引物序列P3:5-3GGAAGATCTGTAGGCGTGTACGG(SEQIDNO.3);P4:5-3CCCAAGCTTGGGTCTCCCTATA(SEQIDNO.4)。串聯(lián)的TRE引物序列P5:5-3CATGAGTCAGATGAGTCAGATGAGTCAGATGAGTCAGATGANO.5);(其中，前后的C作為粘性末端)；P6:5-3(SE(5IDNO.6)。實(shí)施例4PKC激動(dòng)劑在HEK-293細(xì)胞中可激活報(bào)告基因的表達(dá)HEK-293細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞，購(gòu)自ATCC)用含10%胎牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放于含5%002的37'C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HEK-293細(xì)胞以每孔20000個(gè)的密度鋪24孔板，24小時(shí)后細(xì)胞匯合度約90%。用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染(分子克隆實(shí)驗(yàn)方法，第二版，787792頁(yè))，每孔轉(zhuǎn)染200ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo質(zhì)粒，同時(shí)轉(zhuǎn)染50ngp-gal質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染內(nèi)參。轉(zhuǎn)染后8小時(shí)換新鮮培養(yǎng)液，37°C，5%<302條件下培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入終濃度為100riM的PKC激動(dòng)齊lJPMA(購(gòu)自Sigma)，培養(yǎng)12小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察熒光。然后吸取培養(yǎng)液，加入熒光素酶裂解液(購(gòu)自Promega)，裂解10分鐘后，將細(xì)胞裂解液置-8(TC保存待檢測(cè)。檢測(cè)之前室溫化開(kāi)細(xì)胞裂解液，并在室溫平衡至少30分鐘。平衡好的細(xì)胞裂解液再分別測(cè)試P-gal活性和熒光素酶活性。取10ul裂解液，加入40ulTris和50ul(3-gal檢測(cè)緩沖液，37'C培養(yǎng)2小時(shí)后加入100ulNaHC03終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上用405nM的濾片檢測(cè)讀數(shù)。另取取20ul裂解液，加入10ul熒光素酶底物(購(gòu)自Promega)，在微盤(pán)冷光檢測(cè)儀(Microlumatplus,購(gòu)自perkinelmer)上讀數(shù)。結(jié)果表明，磷酸鈣轉(zhuǎn)染后的293細(xì)胞成功表達(dá)了(3-gal，見(jiàn)圖2A,其讀數(shù)用于排除轉(zhuǎn)染率上的誤差(即作為basal)。報(bào)告基因質(zhì)粒也成功表達(dá)，在熒光顯微鏡下能看到明顯的綠色熒光，見(jiàn)圖2B。在100nM的PMA刺激的細(xì)胞中，綠色熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于未刺激的細(xì)胞，而熒光素酶活性則比未刺激的細(xì)胞提高了約IO倍，見(jiàn)圖2C。實(shí)施例5PKC激動(dòng)劑在Hda細(xì)胞中可激活報(bào)告基因的表達(dá)Hela細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞，購(gòu)自ATCC)用含10。/。胎牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放于含5%(:02的37'C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Hela細(xì)胞以每孔1500個(gè)的密度鋪96孔板，24小時(shí)后細(xì)胞匯合度約95%。用Lipofectamine(購(gòu)自Invitrogen)轉(zhuǎn)染，每孔轉(zhuǎn)染150ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo質(zhì)粒，同時(shí)轉(zhuǎn)染100ng卩-gal質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染內(nèi)參。轉(zhuǎn)染后5小時(shí)換新鮮培養(yǎng)液，37°C，5%(:02條件下培養(yǎng)過(guò)夜。其余操作步驟同實(shí)施例4。結(jié)果表明，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞成功表達(dá)了p-gal，見(jiàn)圖3A，其讀數(shù)用于排除轉(zhuǎn)染率上的誤差(即作為basal)。報(bào)告基因質(zhì)粒也成功表達(dá)，在熒光顯微鏡下能看到明顯的綠色熒光，見(jiàn)圖3B。在100nM的PMA刺激的細(xì)胞中，綠色熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于未刺激的細(xì)胞，而熒光素酶活性則比未刺激的細(xì)胞提高了IO倍，見(jiàn)圖3C。實(shí)施例6PKC抑制劑在Hela細(xì)胞中可抑制PMA引起的報(bào)告基因表達(dá)Hela細(xì)胞以每孔1500個(gè)的密度鋪96孔板，24小時(shí)后細(xì)胞匯合度約95%。用Lipofectamine(購(gòu)自Invitrogen)轉(zhuǎn)染，每孑L轉(zhuǎn)染150ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo質(zhì)粒，同時(shí)轉(zhuǎn)染100ng(3-gal質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染內(nèi)參。轉(zhuǎn)染后5小時(shí)換新鮮培養(yǎng)液，37°C，5%(302條件下培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入終濃度為lmM的PKC拮抗劑Ro31-8220(購(gòu)自Sigma)，37°C，5%(:02條件下預(yù)孵育3小時(shí)后加入終濃度為10nM的PKC激動(dòng)劑PMA，培養(yǎng)10小時(shí)后收細(xì)胞。其余操作步驟同實(shí)施例4。結(jié)果表明，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞成功表達(dá)了(3-gal，其讀數(shù)用于排除轉(zhuǎn)染率上的誤差(即作為basal)。報(bào)告基因質(zhì)粒也成功表達(dá)，在熒光顯微鏡下能看到明顯的綠色熒光。在10nM的PMA刺激的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著高于未刺激的細(xì)胞，而加入Ro31-8220和PMA的細(xì)胞中，熒光素酶的活性與本底表達(dá)并無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖6。說(shuō)明10nM的PMA對(duì)PKC的激動(dòng)作用被Ro31-8220成功抑制。此結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致，說(shuō)明本發(fā)明構(gòu)建的報(bào)告基因系統(tǒng)可應(yīng)用于PKC拮抗劑的篩選。實(shí)施例7CHO/CCR5細(xì)胞系的建立從人白細(xì)胞(全血來(lái)源上海市血液中心)的總cDNA文庫(kù)中通過(guò)RT-PCR克隆目的基因，得到編碼CCR5的全長(zhǎng)DNA，用限制性內(nèi)切酶HindlII/Xho1(購(gòu)自Promega)雙酶切它們的全長(zhǎng)DNA及空質(zhì)粒pcDNA3(購(gòu)自Invitrogen)，再通過(guò)T4連接酶(購(gòu)自Promega)將它們的全長(zhǎng)DNA插入pcDNA3(購(gòu)自Invitrogen)中，得到質(zhì)粒pcDNA3-CCR5。質(zhì)粒的序列通過(guò)測(cè)序得到確證。CCR5PCR弓l物P7:5-3TCTAAGCTTGGCACGAGTCG3(SEQIDNO.7);P8:5-3TACCTCGAGAACAGGCAACGTA3(SEQIDNO.8)。CHO細(xì)胞(中華倉(cāng)鼠卵細(xì)胞，購(gòu)自ATCC)用含10。/。胎牛血清的a-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放于含5%<:02的37'C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒于CHO細(xì)胞中。72小時(shí)后在培養(yǎng)液中加入600嗎/mlG418(G418為一種抗生素，pcDNA3含G418抗性基因)，維持兩周使得那些有G418抗性的細(xì)胞存活下來(lái)。接著，用MiniMACs免疫磁珠快速分選法(MiltenyiBiotec公司)篩選表達(dá)CCR5的CHO細(xì)胞，重復(fù)兩次后挑單克隆。FACS(熒光活化的細(xì)胞篩選，F(xiàn)luorescence-activatedCellSorting)檢測(cè)細(xì)胞表面CCR5表達(dá)情況用0.04%EDTA-PBS(PBS:磷酸緩沖溶液)消化細(xì)胞，每管加入約106個(gè)細(xì)胞，用冷的PBS洗兩遍；加入10)ag/ml—抗(小鼠來(lái)源anti-CXCRl、anti-CXCR4或anti-CCR5，均購(gòu)自R&D)100ial，4。C避光孵育lh;用冷的0.1。/。BSA-PBS洗細(xì)胞17兩次，加入1:100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗小鼠的二抗(購(gòu)自JacksonImmunoResearch)80pl，4。C避光孵育40min;用冷的0.1。/。BSA-PBS洗細(xì)胞兩次，加入300plPBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度。淘汰受體表達(dá)低的克隆。此后FACS定期檢測(cè)細(xì)胞的受體表達(dá)情況，選擇維持3個(gè)月受體表達(dá)陽(yáng)性率沒(méi)有明顯下降且用["S]-GTP丫S結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)受體功能穩(wěn)定的克隆作為穩(wěn)定表達(dá)受體的細(xì)胞系。上述制備獲得的細(xì)胞系記為CHO/CCR5，用于后續(xù)的實(shí)施例。實(shí)施例8報(bào)告基因載體在CHO/CCR5細(xì)胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與CHO/CCR5/luc細(xì)胞系的建立CHO/CCR5細(xì)胞用含G418和10。/。胎牛血清的a-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放于含5%C02的37'C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CHO/CCR5以每孔75000個(gè)的密度鋪24孔板，24小時(shí)后細(xì)胞匯合度約90%。用Lipofectamine(購(gòu)自Invitrogen)轉(zhuǎn)染，每孑L轉(zhuǎn)染500ngpGL3-9TRE-CMVmin-EGFP-Zeo質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后5小時(shí)換新鮮培養(yǎng)液，37°C，5%C02條件下培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將孔內(nèi)的細(xì)胞以不同的密度鋪24孔板，24小時(shí)后在培養(yǎng)液中加入250嗎/mlZeocin(購(gòu)自Invitrogen)，維持篩選壓力兩周，每隔三天換一次液。隨后，細(xì)胞在無(wú)血清培液中培養(yǎng)24小時(shí)，再加入10nM的RANTES培養(yǎng)12小時(shí)，用0.04。/。EDTA-PBS消化細(xì)胞，離心后去除上清，加入無(wú)血清培液重新懸浮，濃度為l(^個(gè)/ml。FACS分選并收集帶GFP熒光的細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，用0.04。/。EDTA-PBS消化細(xì)胞，并用培液稀釋至10個(gè)/ml，鋪96孔板。培養(yǎng)兩周后挑選有單克隆的孔，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。選擇陽(yáng)性細(xì)胞克隆擴(kuò)大，凍存，記為CHO/CCR5/luc。其中五個(gè)單克隆分別記為D2，AIO，Hll，E8和G4。實(shí)施例9PKC激動(dòng)劑在CHO/CCR5/luc細(xì)胞系中可激活報(bào)告基因的表達(dá)CHO/CCR5/luc細(xì)胞用含Zeocin和10%胎牛血清的a-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放于含5%032的37'C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CHO/CCR5/luc細(xì)胞每孔1200個(gè)的密度鋪96孔板，24小時(shí)后用無(wú)血清的a-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，加入終濃度為100nM的PMA、終18濃度10nM的RANTES、或者DMSO。培養(yǎng)12小時(shí)后裂解細(xì)胞，取20ul裂解液，加入10ul熒光素酶底物(購(gòu)自Promega)，在微盤(pán)冷光檢測(cè)儀(Microlumatplus,購(gòu)自perkinelmer)上讀數(shù)。結(jié)果表明，報(bào)告基因在CH0/CCR5/luc細(xì)胞中有本底表達(dá)，見(jiàn)圖4A，有可見(jiàn)的綠色熒光及可測(cè)的熒光素酶活性，證明報(bào)告基因確實(shí)已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。100nM的PMA處理后，細(xì)胞裂解液的熒光素酶活性顯著提高，見(jiàn)圖4B，證明報(bào)告基因系統(tǒng)在CH0/CCR5/luc細(xì)胞中工作正常。在加入10nMRANTES后，可明顯引起熒光素酶報(bào)告基因活性的增加，見(jiàn)圖4C。熒光素酶的活性比較見(jiàn)圖4D。實(shí)施例IOCCR5激動(dòng)劑RANTES在CHO/CCR5/luc細(xì)胞系中可激活報(bào)告基因的表達(dá)CHO/CCR5/luc細(xì)胞每孔1200個(gè)的密度鋪96孔板，24小時(shí)后用無(wú)血清的a-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同終濃度的RANTES(購(gòu)自R&D)，終濃度分別是0.1nM，0.3nM，lnM,3nM，10nM，100nM。培養(yǎng)12小時(shí)后裂解細(xì)胞，取20ul裂解液，加入10ul熒光素酶底物(購(gòu)自Promega),在微盤(pán)冷光檢測(cè)儀(Microlumatplus，購(gòu)自perkinelmer)上讀數(shù)。結(jié)果表明，所選的五個(gè)單克隆，D2，AIO，Hll，E8禾口G4，均穩(wěn)定表達(dá)了熒光素酶報(bào)告基因，有明顯的本底表達(dá)。RANTES激動(dòng)后引發(fā)CCR5受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活PKC，進(jìn)而引起熒光素酶報(bào)告基因活性的增加，并與RANTES呈濃度依賴性，見(jiàn)圖5A-E。5個(gè)CHO/CCR5/luc克隆的RANTES刺激曲線EC50值如表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>五個(gè)單克隆的RANTES刺激ECso值均在l10nM之間，表明報(bào)告基因細(xì)胞系的劑量反應(yīng)有較高的敏感性，可用于激動(dòng)劑藥物的大規(guī)模篩選，同時(shí)還可以用于針對(duì)RANTES的拮抗劑篩選。實(shí)施例llCCR5拮抗劑在CHO/CCR5/luc細(xì)胞系中可抑制報(bào)告基因表達(dá)的激活CHO/CCR5/luc細(xì)胞G4克隆每孔1200個(gè)的密度鋪96孔板，24小時(shí)后用無(wú)血清的a-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，加入終濃度是IOOnM的藥物(分別是CCR5拮抗劑TD0501，TD0232，TD0082或TD0517，均由上海靶點(diǎn)藥物有限公司提供)，在37'C，5%(302條件下預(yù)培養(yǎng)3小時(shí)后，在培養(yǎng)體系中加入終濃度為10nM的RANTES。繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)后，裂解細(xì)胞，其余操作步驟同實(shí)施例9。結(jié)果表明，RANTES可顯著刺激熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，證明本發(fā)明構(gòu)建的藥物篩選系統(tǒng)工作正常。在篩選的5個(gè)藥物中，TD0501不能拮抗RANTES對(duì)CCR5受體的激動(dòng)作用，而TD0232，TD0082以及TD0517均表現(xiàn)出了CCR5拮抗劑的活性，見(jiàn)圖7。在本方法上得到的結(jié)論與通過(guò)其他篩選方法得出的結(jié)論一致，證明了本方法的可靠性。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表<110〉中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120〉用于篩選藥物的報(bào)告基因細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法<130〉080832<160〉8〈170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉33〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物〈400〉1gcagatcttcatgagtcagacaggcgtgtacgg33<210〉2〈211>20〈212〉隠<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉2aggaagcttcggtcccggtg20<210〉3<211>23<212〉隱<213>人工序列<220〉<221〉misc_feature<223>引物<400>3ggaagatctgtaggcgtgtaegg<210〉4<211〉22<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>4cccaagcttgggtctccctata<210〉5<211>83<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉5catgagtcagatgagtcagatgagtcagatgagtcagatgagtcagatgagtcagatgag60tcagatgagtcagatgagtcagc83〈210〉6〈211〉91<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>niisc_feature〈223〉引物<400>6tcgagctgactcatctgactcatctgactcatctgactcatctgactcatctgactcatc60tgactcatctgactcatctgactcatggtac91<210〉7<211〉2022<212〉腿<213〉人工序列〈220〉<221〉misc—feature<223〉引物<■>7tctaagcttggcacgagtcg20<210>8〈211>22<212>DNA〈213〉人T序列權(quán)利要求1.一種構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物從5’端到3’端依次含有式I所示的結(jié)構(gòu)A—B—C(式I)其中，A具有SEQIDNO5中第2-82位所示的序列；B為巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子序列；C為報(bào)告基因序列。2.如權(quán)利要求l所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物從5'端到3'端依次含有式II所示的結(jié)構(gòu)A—B—C—D(式n)其中，D為Zeocin抗性基因序列。3.如權(quán)利要求l所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的報(bào)告基因選自綠色熒光蛋白基因，禾口/或熒光素酶基因。4.一種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建物。5.—種細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞具有蛋白激酶C信號(hào)通路；并且，所述細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的載體；或其基因組中整合有權(quán)利要求l-3任一所述的構(gòu)建物。6.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞選自CH0細(xì)胞，HEK-293細(xì)胞或Hela細(xì)胞。7.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞含有Gi/o偶聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體或酪氨酸激酶受體。8.權(quán)利要求5所述的細(xì)胞的用途，其特征在于，所述的細(xì)胞用于篩選調(diào)節(jié)蛋白激酶C信號(hào)通路的物質(zhì)。9.一種篩選調(diào)節(jié)蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括(1)將候選物質(zhì)給予權(quán)利要求5或6所述的細(xì)胞；和(2)檢測(cè)所述細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)情況；其中，若所述候選物質(zhì)可提高報(bào)告基因的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是激活蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低報(bào)告基因的表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是抑制蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(l)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到權(quán)利要求5或6所述的細(xì)胞中；和/或步驟(2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中報(bào)告基因的表達(dá)，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的權(quán)利要求5或6所述的細(xì)胞；如果測(cè)試組中報(bào)告基因的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于對(duì)照組，就表明該候選物是激活蛋白激酶C信號(hào)通路的潛在物質(zhì)；如果測(cè)試組報(bào)告基因的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照組，就表明該候選物是抑制激活蛋白激酶c信號(hào)通路的潛在物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開(kāi)了一種獨(dú)特的基因構(gòu)建物，所述構(gòu)建物兼容了TPA反應(yīng)元件、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、報(bào)告基因和抗性基因的元件，這些元件可良好的配合，在轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，可在細(xì)胞內(nèi)高靈敏度地報(bào)告蛋白激酶C信號(hào)通路的情況。本發(fā)明還公開(kāi)了含有所述構(gòu)建物的載體，含有所述載體的細(xì)胞，所述細(xì)胞可作為模型用于蛋白激酶C信號(hào)通路調(diào)節(jié)藥物的篩選。本發(fā)明提供的報(bào)告基因細(xì)胞模型可用于篩選與蛋白激酶C信號(hào)通路相關(guān)的藥物，具有機(jī)制明確、操作簡(jiǎn)便、可高通量化的特點(diǎn)，對(duì)蛋白激酶C信號(hào)通路相關(guān)的藥物篩選有積極的意義。文檔編號(hào)C12N15/11GK101544975SQ200810035070公開(kāi)日2009年9月30日申請(qǐng)日期2008年3月25日優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日發(fā)明者瑜吳,應(yīng)鎖環(huán),瑾張,翟培彬,楊蘇,鋼裴,力陳,陳仁海申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院