專利名稱：：一種利用整合子系統(tǒng)定點(diǎn)、定向的基因重組方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種基因重組的方法，具體涉及一種利用整合子系統(tǒng)將目的基因定點(diǎn)且定向地進(jìn)行基因重組的方法。
背景技術(shù)：
：已知在生物技術(shù)研究中，將目的基因插入到染色體基因組DNA，可以采用同源重組的辦法或使用轉(zhuǎn)座子的方法，但實(shí)踐表明，同源重組的效率較低，操作麻煩，并且由于目的基因的插入而使原有基因遭受破壞；使用轉(zhuǎn)座子的方法，也存在插入到染色體的部位是隨機(jī)的，而且操作使用的轉(zhuǎn)座酶價(jià)格昂貴等缺陷。整合子由于其與細(xì)菌的多重耐藥性有關(guān)而得到廣泛的關(guān)注。近年來在非臨床菌株中發(fā)現(xiàn)有整合子的存在，其分布范圍要比預(yù)期廣得多。目前，本領(lǐng)域的有關(guān)學(xué)者主張將整合子作為細(xì)菌基因進(jìn)化的有力工具。通常，一個(gè)整合子至少包括三個(gè)最基本的元件編碼屬于酪氨酸重組酶家族的整合酶的基因，位于整合酶編碼區(qū)而與整合酶編碼方向相反的驅(qū)動(dòng)下游基因盒表達(dá)的啟動(dòng)子Pc，整合酶所識(shí)別的重組位點(diǎn)attl?；蚝杏梢粋€(gè)通常無啟動(dòng)子的開放讀碼框和3'端整合酶重組識(shí)別位點(diǎn)attC構(gòu)成。整合酶通常催化三種類型的重組反應(yīng)attlxattl、attlxattC、attCxattC，其中attlxattC之間的重組效率比另外兩種高得多，在此，由于attC序列具有一定的方向性，因而使得整合到attl位點(diǎn)的基因盒與Pc啟動(dòng)子方向一致而使其相應(yīng)的基因得到有效的表達(dá)。研究表明，數(shù)個(gè)基因盒可以同時(shí)存在于一個(gè)整合子中，其相應(yīng)基因的表達(dá)水平通常與其在整合子中的位置有關(guān)。距離Pc啟動(dòng)子越近的基因盒其表達(dá)水平越高，因此插入到attl位點(diǎn)的基因盒表達(dá)水平最高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種簡便、快速的基因重組的方法，具體涉及一種利用整合子系統(tǒng)將目的基因定點(diǎn)且定向地進(jìn)行基因重組方法，尤其涉及一種利用整合子系統(tǒng)將目的基因定點(diǎn)且定向地插入到大腸桿菌染色體的基因重組方法。本發(fā)明利用含有目的DNA片段的基因盒插入到整合子的attl位點(diǎn)時(shí)表達(dá)水平增高的原理，對陽性克隆進(jìn)行篩選。本方法采用整合子系統(tǒng)作為工具，首先構(gòu)建在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)含有attC序列的工具載體，然后將目的基因克隆到該載體，目的基因在宿主菌表達(dá)整合酶的情況下，能夠定點(diǎn)且定向地插入到大腸桿菌基因組DNA中的attI位點(diǎn)。實(shí)踐證明，本方法簡便易行，只需常規(guī)簡單的基因克隆操作，僅需要4天時(shí)間就可以將目的基因插入到宿主菌的染色體DNA中。所述的整合子系統(tǒng)作為分子生物學(xué)工具具有良好的應(yīng)用前景，例如可用于獲取含有目的基因的大片段DNA;同時(shí)，目的基因插入到宿主染色體定點(diǎn)且定向的特性，在基因治療中將有助于解決目的基因插入到基因組DNA的靶向性問題等。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案和方法實(shí)現(xiàn)1、通過PCR擴(kuò)增獲取目的基因；2、通過下述步驟制備工具載體構(gòu)建工具載體pACZC，其特征是在來源于pUC19質(zhì)粒(TaKaRa)的LacZ基因的兩側(cè)引入整合酶識(shí)別重組序列attC,將該片段克隆到pACYC184質(zhì)粒(JBacteriol，1978，134:1141-1156.)，該重組質(zhì)粒命名為pACZC，利用其上LacZ上的多克隆位點(diǎn)，將任意DNA片段裝配成基因盒結(jié)構(gòu)。在上述pACZC質(zhì)粒的LacZ編碼區(qū)加入篩選標(biāo)志基因aadA2，其編碼對鏈霉素的抗性，該重組質(zhì)粒命名為pACAZC。3、定點(diǎn)、定向地將目的基因插入到大腸桿菌的染色體中將高表達(dá)整合酶的質(zhì)粒pUCINT(中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30:1398-1400)轉(zhuǎn)化菌株DHS(專利申請?zhí)?00810033538.7)，在該株細(xì)菌的染色體DNA的已知位點(diǎn)含有整合酶識(shí)別重組序列attl，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌命名為DHS1;將目的基因克隆到工具載體pACAZC的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化DHS1菌株，利用整合酶催化高效率的attC位點(diǎn)和位點(diǎn)attl位點(diǎn)之間的重組反應(yīng)，以及其對attC位點(diǎn)識(shí)別的方向性，實(shí)現(xiàn)目的基因定點(diǎn)且定向地插入到DHS1菌株染色體DNA的attl位點(diǎn)。利用篩選標(biāo)志基因aadA2插入到attl位點(diǎn)時(shí)獲得整合子的面有啟動(dòng)子Pc而高效表達(dá)，在含有鏈霉素的LB瓊脂平板中篩選得到陽性克隆。為消除aadA2基因背景表達(dá)造成的假陽性克隆，使用PCR技術(shù)對篩選到的陽性克隆作進(jìn)一步的鑒定。采用本發(fā)明建立的方法及配套工具載體，在不使用特殊設(shè)備和試劑的情況下，僅用4天時(shí)間就可以把目的基因定點(diǎn)且定向地插入到大腸桿菌染色體。本方法簡便、快速、成本低廉，可應(yīng)用于分子生物學(xué)技術(shù)。圖1是目的基因插入到DHS1菌株基因組DNA的流程圖，其中，在HS1菌株中的矩形標(biāo)志表示目的基因在染色體上的插入位點(diǎn)，在篩選到的陽性克隆中較小的矩形標(biāo)志表示插入到大腸桿菌基因組的目的基因。圖2是重組質(zhì)粒pACZC的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，attCs和attCe是整合酶所識(shí)別的重組序列，其中attCs端的序列在整合到大腸桿菌的染色體時(shí)靠近attl位點(diǎn)，而attCe端的序列在整合到大腸桿菌的染色體時(shí)遠(yuǎn)離attl位點(diǎn)，為克隆目的基因可采用的限制性酶切位點(diǎn)有Hindin、Pstl、Sse8387I、SmaI、KpnI、SacI、PvuI、NdeI、ApalI。圖3是重組質(zhì)粒pACAZC的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，attCs和attCe是整合酶所識(shí)別的重組序列，其中attCs端的序列在整合到大腸桿菌的染色體時(shí)靠近attl位點(diǎn)，而attCe端的序列在整合到大腸桿菌的染色體時(shí)遠(yuǎn)離attl位點(diǎn)，aadA2為編碼鏈霉素抗性篩選標(biāo)記的基因，AAFQ為用于篩選陽性克隆所用的引物，為克隆目的基因可采用的限制性酶切位點(diǎn)有XhoI、BglII、Mlul、ApaI、SmaI、KpnI、SacI、PvuI、NdeI、ApalI。圖4是篩選陽性克隆用擴(kuò)增曲線，其中,A為從鏈霉素平板上挑選的三個(gè)含有質(zhì)粒pACSA2的DHS1菌落為模板的擴(kuò)增曲線；B為從鏈霉素平板上挑選的三個(gè)含有質(zhì)粒pACSAll的DHS1菌落為模板的擴(kuò)增曲線；1、2、3分別為菌落編號(hào)。圖5是擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線圖，其中，A圖對應(yīng)于圖4.A擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線，B圖對應(yīng)于圖4.B擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線，1、2、3分別為菌落編號(hào)。圖6是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，其中，A圖為以篩選出的在染色體DNA已插入200pb的菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，B圖為以篩選出的在染色體DNA已插入l.lkb的菌落為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖7表示將圖6A1泳道的擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化后的測序結(jié)果，劃線部分序列與引物SA2一致。圖8表示將圖6B1泳道的擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化后的測序結(jié)果，劃線部分序列與引物SA11一致。具體實(shí)施方式實(shí)施例1構(gòu)建工具載體pACAZC，其通過下述步驟實(shí)現(xiàn)(1)用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建含有attCs-LacZ-attCe基因盒的重組質(zhì)粒pACZC，構(gòu)建過程如下述attCs的擴(kuò)增體系為去離子水18.88ul，10Xbuffer2.5u1，dNTP2.0ix1，引物AADL0.5ul，引物L(fēng)AP2N0.5u1，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12ul，148號(hào)菌株基因組DNA0.5p1(該菌株含有的整合子序列與pCTX-M3質(zhì)粒上的整合子的序列相同，GenBankaccessionnumber:AF550415.2)。擴(kuò)增條件為95。C預(yù)變性5分鐘，94。C30秒，5(TC30秒，72。C30秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸7分鐘。attCe的擴(kuò)增體系為去離子水18.88u1，10Xbuffer2.1，d證2.0iU，引物AADUCLO.5ul，引物L(fēng)AP50.5ul，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12ul，148號(hào)菌株基因組DNA0.5iU，擴(kuò)增條件同前。LacZ的擴(kuò)增體系為去離子水18.88u1，10Xbuffer2.5li1，dNTP2.0y1，引物L(fēng)AP30.5u1，引物L(fēng)AP4N0.5u1，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12iU，稀釋過后的pUC19質(zhì)粒0.5ixl，擴(kuò)增條件同前。取1h1attCs擴(kuò)增產(chǎn)物加100u1去離子水稀釋后標(biāo)為attCs稀釋，取1y1attCe擴(kuò)增產(chǎn)物加100u1去離子水稀釋后標(biāo)為attCe稀釋，取1y1LacZ擴(kuò)增產(chǎn)物加100u1去離子水稀釋后標(biāo)為LacZ稀釋。attCs-Z的擴(kuò)增體系為去離子水18.88u1，10Xbuffer2.5u1，dNTP2.0ul，引物L(fēng)AP4N0.5ul，引物AADL0.5nl，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12ul，attCs稀釋0.5^1，LacZ稀釋0.5yl，擴(kuò)增條件同前，將擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化后標(biāo)為attCs-Z純化。Z-attCe的擴(kuò)增體系為去離子水18.88n1，10Xbuffer2.5u1，dNTP2.0Ul，引物L(fēng)AP30.5ul，引物AADUCL0.5ul，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12yl，attCe稀釋0.5ul，LacZ稀釋0.5ul，擴(kuò)增條件同前，將擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化后標(biāo)為Z-attCe純化。對attCs-Z純化和Z-attCe純化用EcoRI(TaKaRa)酶切，酶切體系為attCs-Z純化(或Z-attCe純化)34n1，10XHBuffer4u1，EcoRI(TaKaRa)2yl，37°Clh65°C10rain。對酶切產(chǎn)物切膠回收純化，獲取目的片段，各取21.5yl，10XLigaseBuffer5ul，T4DNALigase(TaKaRa)2u1，16°Clh65。C10min，對連接產(chǎn)物切膠回收純化，獲取目的片段，取1^1加100p1去離子水稀釋后標(biāo)為attCs-Z-attCe稀釋。attCs-Z-attCe的擴(kuò)增體系為去離子水18.88y1,10Xbuffer2.5"1，dNTP2.Owl,引物AADL0.5ul，引物AADUCL0.5ul，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.12ul，模板attCs-Z-attCe稀釋0.5nl，擴(kuò)增條件同前，擴(kuò)增結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收純化，取該純化產(chǎn)物34ul，10XHbuffer4ul，ClaI(TaKaRa)2ul，30°Clh65°C10min，對酶切產(chǎn)物切膠回收純化，標(biāo)為attCs-Z-attCe切純。同樣對pACYC184質(zhì)粒用ClaI(TaKaRa)和EcoRV(TaKaRa)酶切，對酶切產(chǎn)物切膠回收純化，標(biāo)為pACYC184切純。取attCs-Z-attCe切純4u1，pACYC184切純1u1，連接液SolutionI5ul，16°ClOh65°C10min。取上述連接產(chǎn)物5u1轉(zhuǎn)化50ulDH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布氯霉素平板，37"過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒作初步鑒定，最后經(jīng)測序確證。所構(gòu)建的pACZC重組質(zhì)粒如圖2所示。表1是構(gòu)建pACZC重組質(zhì)粒過程中使用的引物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)在pACZC質(zhì)粒的LacZ中插入鏈霉素篩選標(biāo)志基因aadA2，并且在適當(dāng)位置引入數(shù)個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，該重組質(zhì)粒命名為pACAZC，具體構(gòu)建過程如下aadA2基因的擴(kuò)增體系為去離子水40.5ul，10Xbuffer5wl，d,2.0"引物AADPFl.Oyl，引物AADSRl.Oul,PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.25ul，148號(hào)菌株基因組DNA0.25ul。擴(kuò)增條件為95。C預(yù)變性5分鐘，95°C30秒，55°C30秒，72'C60秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收純化，取該純化產(chǎn)物34ul，10XHbuffer4u1，PstI(TaKaRa)2ul，37°Clh65°C10min，對酶切產(chǎn)物切膠回收純化后，進(jìn)行第二次酶切，上述酶切純化產(chǎn)物30ul,10XTbuffer4u1，0.1%BSA4yl,SmaI(TaKaRa)2ul，30°Clh65°C10min，對酶切產(chǎn)物切膠回收純化，標(biāo)為aadA2切純。同樣對pACZC質(zhì)粒用PstI和SmaI酶切，對酶切產(chǎn)物切膠回收純化，標(biāo)為pACZC切純。取aadA2切純4u1，pACZC切純lul，連接液Solution15ul，16°C10h65°C10min。取上述連接產(chǎn)物5ul轉(zhuǎn)化50DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布氯霉素平板，37'C過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒作初步鑒定，最后經(jīng)測序確證。所構(gòu)建的pACZAC重組質(zhì)粒圖3所示。表2是構(gòu)建pACZAC重組質(zhì)粒過程中使用的引物。表2_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例2應(yīng)用該體系將pACYC184質(zhì)粒上約200bp和l.lkb大小的片段為例，作為目的基因定點(diǎn)且定向地插入大腸桿菌基因組DNA中。(1)在pACAZC的多克隆位點(diǎn)處插入pACYC184質(zhì)粒上約200bp和1.lkb大小的片段，并將該重組質(zhì)粒分別命名為pACSA2和pACSAll，具體操作過程如下述表3是構(gòu)建重組質(zhì)粒pACSA2和pACSAll過程中使用的引物。表3_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>獲取200bp目的基因的擴(kuò)增體系為去離子水40.5ul，10Xbuffer5u1，dNTP2.0y1，引物SM14561.0p1，引物SA21.0u1，PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa)0.25ul，稀釋后的pACYC184質(zhì)粒0.25"1。擴(kuò)增條件為95"C預(yù)變性5分鐘，95°C30秒，55"C30秒，72'C60秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收純化，取該純化產(chǎn)物34ul，10XLbuffer4ul，SacI(TaKaRa)2yl，37'Clh65°C10min，對酶切產(chǎn)物切膠回收純化后，進(jìn)行第二次酶切，酶切體系為上述酶切純化產(chǎn)物30Pi,10XTbuffer4ul，O.1%BSA4nl，SmaI(TaKaRa)2ul，30°Clh65°ClOmin，對酶切產(chǎn)物切膠回收純化，標(biāo)為SA2切純。同樣對pACAZC質(zhì)粒用SacI和SmaI酶切，對酶切產(chǎn)物切膠回收純化，標(biāo)為pACAZC切純。取SA2切純4ul，pACAZC切純lnl，連接液SolutionI5u1，16°C10h65°C10min。取上述連接產(chǎn)物5u1轉(zhuǎn)化50y1DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布氯霉素平板，37。C過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒作初步鑒定，最后經(jīng)測序確證。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pACSA2。按同樣的方法，使用引物SAll和SM1456構(gòu)建在pACAZC質(zhì)粒的LacZ多克隆位點(diǎn)插入片段長度約為1.lkb重組質(zhì)粒，并將其命名為pACSAll。(2)將上述重組質(zhì)粒pACSA2和pACSAll轉(zhuǎn)化DHS1感受態(tài)細(xì)胞，涂布氯霉素抗性平板，過夜培養(yǎng)后，挑選陽性克隆接種5mlLB液體培養(yǎng)基，并加10Wl氨芐青霉(終濃度為lOOixg/ml)素和10氯霉素(終濃度為20ug/ml)。過夜培養(yǎng)后取100u1菌液加lmlLB液體培養(yǎng)基稀釋，取IOOyl涂布鏈霉素(20ug/ml)抗性平板，過夜培養(yǎng)。(3)用羅氏LightCycler進(jìn)行real-timePCR快速篩選陽性克隆，通過下述步驟從上述過夜培養(yǎng)后的鏈霉素抗性平板上挑選三個(gè)菌落，加入50u1去離子水，振蕩混勻，IOO'C煮沸IO分鐘后，10000轉(zhuǎn)離心1分鐘，取上清作為模板進(jìn)行real-timePCR。擴(kuò)增體系為，SYBRPremixExTaq(TaKaRa)5^1，引物5CS5'GGCATCCAAGCAGCAAGC3'和AAFQ5'CATCCACTGCGGAGCCGTAC3'各0.2pl，3.6pl去離子水，1.0pl前述待測定模板。擴(kuò)增條件為95"預(yù)變性10s，隨后95'C變性10s，62'C退火8s，72'C延伸10s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后融解曲線的測定條件為從5(TC上升到95'C，上升速度為每秒O.1°C。擴(kuò)增曲線見圖4，可見l號(hào)擴(kuò)增曲線對應(yīng)的為陽性克??；擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線見圖5，其中A圖對應(yīng)于圖4.A擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線，B圖對應(yīng)于圖4.B擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線，1、2、3分別為菌落編號(hào)?？梢?號(hào)陽性克隆擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線呈單峰，說明擴(kuò)增是特異的。(4)用PCR技術(shù)對篩選出的陽性克隆中目的基因的插入位點(diǎn)作進(jìn)一步鑒定，測序確證擴(kuò)增產(chǎn)物，通過下述步驟擴(kuò)增體系為，去離子水68nl，10XLAbuffer10nl，dNTP16pl，擴(kuò)增過程中使用的引物為DHFQ25'TTGGCTCCCATCGCAGCMC3'5CS5'GGCATCCMGCAGCAAGC3',引物DHFQ2和5CS各2[U，LATaqDNA聚合酶(TaKaRa)1pl，上述經(jīng)real-timePCR證實(shí)為陽性克隆的DNA1擴(kuò)增條件為95'C預(yù)變性5分鐘，95'C1分鐘，55'C1分鐘，72'C1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度與預(yù)期一致(圖6)，初步證明在陽性克隆中目的基因插入到染色體的attl位點(diǎn)。對擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收純化，使用DHFQ2為引物進(jìn)行測序，以進(jìn)一步確證目的基因以預(yù)期方向插入到預(yù)期位置。測序結(jié)果表明目的基因以預(yù)期的方向和位置插入到染色體中(圖7，圖8)。SEQUENCELISTING〈110>復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院〈120〉一種利用整合子系統(tǒng)定點(diǎn)、定向的基因重組方法〈130〉11〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉4698〈212〉腿<213〉細(xì)菌〈400〉1gaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaactt60gtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggtt120ataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattggga180tatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctga240aaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattstggtgaaagtt300ggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttccc360ggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtat420ttattcggcgc犯agtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgattt已gtgtatgatggt480gtttttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagctgtccctcctgttcagctactg540acggggtggtgcgtaacggcaaaagcaccgccggacatcagcgctagcggagtgt已t已ct600ggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaa660aaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctc720actgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacg犯cggggc780ggagatttcctggaageitgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaa840agccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaa/tctgacgctcaaatc900agtggtggcg犯acccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccc%0tcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgc1020gtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggac1080tgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtctt1140gagtccaacccggaaagacatgcaa犯gcaccactggcagcagccactggt犯ttgattt1200agaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactga犯ggacaagttttggl加Otgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaacctt1320cgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaaga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粒pACZC。6、一種重組質(zhì)粒pACAZC，其特征是具有序列2的結(jié)構(gòu)。7、按權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒pACAZC，其特征是通過在重組質(zhì)粒pACZC的LacZ基因中融合了aadA2基因，其編碼對鏈霉素的抗性。8、權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒pACZC在制備將任意基因片段裝配成基因盒結(jié)構(gòu)中的用途。9、權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒pACAZC中的aadA2基因在篩選細(xì)菌染色體上整合有目的基因的陽性克隆中的用途。全文摘要本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種利用整合子系統(tǒng)定點(diǎn)、定向的基因重組方法，采用整合子系統(tǒng)作為工具，首先構(gòu)建在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)含有attC序列的工具載體，然后將目的基因克隆到該載體，目的基因在宿主菌表達(dá)整合酶的情況下，能夠定點(diǎn)且定向地插入到大腸桿菌基因組DNA中的attI位點(diǎn)。本方法簡便易行，不需要特殊的儀器和試劑，僅需要4天時(shí)間就可將目的基因插入到宿主菌的染色體DNA中。所述的整合子系統(tǒng)作為分子生物學(xué)工具具有良好的應(yīng)用前景，可用于獲取含有目的基因的大片段DNA；同時(shí)，目的基因插入到宿主染色體定點(diǎn)且定向的特性，有助于解決在基因治療中目的基因插入基因組DNA的靶向性問題。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101280301SQ20081003479公開日2008年10月8日申請日期2008年3月18日優(yōu)先權(quán)日2008年3月18日發(fā)明者明關(guān),元呂,楊澤華,楠陳,魏取好申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院