專利名稱：人類新基因famlf在人基因重組、惡性腫瘤基因檢測(cè)、特異性單克隆抗體的研制與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及人類新基因(FAMLF)的全長(zhǎng)DNA序列、構(gòu)建出 該基因全長(zhǎng)cDNA的T克隆、設(shè)計(jì)出針對(duì)該基因的序列特異擴(kuò)增區(qū)域的PCR引物、并研制出 針對(duì)該基因所表達(dá)蛋白的特異性單克隆性抗體，細(xì)分所屬領(lǐng)域如下(一)分子生物學(xué)范疇。( 二 )抗體制備研究領(lǐng)域。(三)臨床血液病研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人類基因組學(xué)研究已實(shí)現(xiàn)從結(jié)構(gòu)基因組向后基因組 的全面轉(zhuǎn)變，人類基因組中24中染色體的絕大部分的序列(除少數(shù)間隔外)已經(jīng)明確。估 計(jì)人類基因組中大約有20000-25000個(gè)基因。完成基因組序列測(cè)定成為破解人類遺傳奧秘 的歷史性開端，接下來(lái)的任務(wù)更加艱巨，目前主要是要完成以下目標(biāo)一是識(shí)別、分離、鑒定 和克隆所有基因(現(xiàn)在只克隆出一萬(wàn)多個(gè))；二是搞清每個(gè)基因的功能及基因之間的相互 作用和相互關(guān)系。有科學(xué)家估計(jì)，到21世紀(jì)晚些時(shí)候，基因治療有可能走向臨床應(yīng)用大舞 臺(tái)，為人類健康做出重要貢獻(xiàn)。而惡性腫瘤由于其高發(fā)病率和死亡率而成為基因治療首選 病種，腫瘤相關(guān)基因的克隆將為惡性腫瘤的基因治療提供靶點(diǎn)，是基因治療的重要基礎(chǔ)之。
白血病是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，估計(jì)我國(guó)白血病的發(fā)病率每年 2. 71/10萬(wàn)，每年死于白血病患者近4萬(wàn)人，五年無(wú)病生存率僅達(dá)20%左右，難治性復(fù)發(fā)性 白血病發(fā)生率有上升趨勢(shì)。白血病的生物學(xué)行為復(fù)雜多變，發(fā)病機(jī)制以及發(fā)生、發(fā)展的分子 生物學(xué)基礎(chǔ)尚未闡明。臨床上對(duì)白血病的預(yù)防、治療、預(yù)后判斷尚缺乏有效的手段，骨髓移 植患者的治愈率僅40%左右，目前死亡率仍居高不下。近年來(lái)的遺傳學(xué)研究表明白血病是多基因相關(guān)腫瘤，國(guó)際上對(duì)白血病基礎(chǔ)研究 的主要進(jìn)展，很大一部分是來(lái)自對(duì)白血病相關(guān)基因的研究。一些研究結(jié)果表明，bcr/abl、 c-myc、bcl-l、tal-l、RARa、CAN、MLL、NUP98等癌基因與白血病發(fā)生發(fā)展有密切相關(guān)。國(guó)外對(duì) 白血病的研究熱點(diǎn)集中于對(duì)白血病相關(guān)基因的克隆與鑒定，主要通過構(gòu)建一般的基因組文 庫(kù)或cDNA文庫(kù)并進(jìn)行篩選，但其特異性不高，篩選陽(yáng)性率較低。福建省白血病發(fā)病率高于 全國(guó)，白血病患者人數(shù)眾多，白血病基因資源豐富，尤其是白血病高發(fā)家系多見，其白血病 遺傳基因具有獨(dú)特的研究?jī)r(jià)值。家族性白血病既是一種血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，又是一種與 遺傳因素高度相關(guān)的疾病，其遺傳基因具有獨(dú)特的研究?jī)r(jià)值。我們1981年起對(duì)福建省山區(qū) 一個(gè)白血病高發(fā)家系(家系圖譜見附圖一)，進(jìn)行了遺傳學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等方面研究，目前 課題組成員在以往對(duì)此急性白血病高發(fā)家系遺傳機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用抑制消 減雜交(SSH)等分子生物學(xué)技術(shù)，以IV-18患者骨髓作為Tester，正常人骨髓作為Driver， 成功構(gòu)建了家族性急性髓系白血病cDNA抑制性消減文庫(kù)，應(yīng)用DifferentialScreening技術(shù)篩選鑒定文庫(kù)，確認(rèn)28個(gè)基因?yàn)殛?yáng)性差異表達(dá)基因，陽(yáng)性克隆送交測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提 交GenBank進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)了 17個(gè)有差異表達(dá)的白血病相關(guān)已知基因的EST 片斷和11個(gè)未知的白血病相關(guān)新EST片段，11個(gè)新的EST片段全部在美國(guó)NIH的基因庫(kù) GENBANK成功注冊(cè)。通過一步法半定量RT-PCR篩查，發(fā)現(xiàn)其中4條新的EST片段在髓系白血 病人中高表達(dá)，而在正常人中低表達(dá)。選取4條中的zywB-87 (GenBank注冊(cè)號(hào)CV973101)， 通過電子克隆和SMART-RACE技術(shù)，成功克隆了有差異表達(dá)的zywB-87所對(duì)應(yīng)的新基因cDNA 全長(zhǎng)，該基因定位于染色體lq31. 3，cDNA全長(zhǎng)2313bp，編碼82個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，含有信 號(hào)肽，富含亮氨酸重復(fù)單位(LRR_SD22)，內(nèi)在固有無(wú)序結(jié)構(gòu)域等功能區(qū)。Blast檢索FAMLF 為功能未知的新基因，已被GenBank收錄，并被命名為FAMLF，核酸注冊(cè)號(hào)為EF413001,蛋白 質(zhì)灃冊(cè)號(hào)為ABN58747。新基因FAMLF在急性髓系白血病病人中的表達(dá)明顯高于正常人中的 表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 01)，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)新基因FAMLF很可能定位于 細(xì)胞膜，參與細(xì)胞信息傳遞途徑中某些蛋白的磷酸化；FAMLF的高表達(dá)，可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖 信號(hào)的持續(xù)活化，或者細(xì)胞凋亡信號(hào)的抑制，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。并已經(jīng)通過T-A克 隆的方法成功構(gòu)建出包含F(xiàn)AMLF基因全長(zhǎng)cDNA的T克隆，已經(jīng)成功研制出針對(duì)FAMLF蛋白 特異性單克隆性抗體，經(jīng)過Western Bloting驗(yàn)證出該新基因表達(dá)的蛋白質(zhì)在急性髓系白 血病患者中高表達(dá)在正常人中低表達(dá)，F(xiàn)AMLF基因的相關(guān)功能正在進(jìn)一步研究證實(shí)中。本研究成果，充分利用、發(fā)揮該家系遺傳學(xué)資源的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，緊密結(jié)合臨床潛在的 應(yīng)用前景，對(duì)白血病相關(guān)基因的克隆進(jìn)行針對(duì)性的探討研究。為今后開發(fā)白血病特異性基 因藥物、基因診斷芯片、診斷抗體奠定基礎(chǔ)。該項(xiàng)目研究對(duì)于開發(fā)研制抗白血病新藥，提高 白血病診斷準(zhǔn)確率與治療效果，提高福建省白血病的治愈率有重要的作用，有潛在重大的 社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提出一種人類新基因FAMLF的全長(zhǎng)cDNA序列、構(gòu)建出該基因全 長(zhǎng)cDNA的T克隆、設(shè)計(jì)出針對(duì)該基因的序列特異擴(kuò)增區(qū)域的PCR引物、并研制出針對(duì)該基 因所表達(dá)蛋白的特異性單克隆性抗體，以及在基因重組、惡性腫瘤基因檢測(cè)、特異性單克隆 抗體及基因藥物制備中的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是與家族性急性髓系白血病相關(guān)的新基因(FAMLF)的 cDNA及其完整開放讀碼框的多核苷酸序列，它包含一個(gè)cDNA全長(zhǎng)的序列〈一〉，序列表代 號(hào)為SEQ ID NO :1，一個(gè)完整開放讀碼框的序列< 二 >，序列表代號(hào)為SEQ ID NO :2。本發(fā)明的內(nèi)容包括但不限于家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的 全長(zhǎng)cDNA序列SEQ ID NO :1、FAMLF基因的完整開放讀碼框序列SEQ ID NO :2，還包括 克隆FAMLF基因所用的引物、包含F(xiàn)AMLF基因的重組載體、分析FAMLF基因差異表達(dá)所 需要的FAMLF基因高效特異擴(kuò)增的序列(檢測(cè)基因)、其序列特異擴(kuò)增區(qū)域(sequence characterizedamplified region, SCAR)的PCR引物、制備FAMLF基因單克隆抗體所用的 免疫多肽表位、針對(duì)FAMLF基因所表達(dá)蛋白質(zhì)的特異性單克隆抗體以及它們?cè)诨A(chǔ)研究、 基因診斷、基因質(zhì)量等領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用。它們是這樣實(shí)現(xiàn)的1、應(yīng)用抑制消減雜交(SSH)等分子生物學(xué)技術(shù)，以福建省白血病高發(fā)家系患者 IV-18的骨髓作為Tester，正常人骨髓作為Driver，成功構(gòu)建了家族性急性髓系白血病cDNA抑制性消減文庫(kù)，應(yīng)用Differential Screening技術(shù)篩選鑒定文庫(kù)，確認(rèn)28個(gè)基因?yàn)?陽(yáng)性差異表達(dá)基因，陽(yáng)性克隆送交測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn) 了 17個(gè)有差異表達(dá)的白血病相關(guān)已知基因的EST片斷和11個(gè)未知的白血病相關(guān)新EST片 段，11個(gè)新的EST片段全部在美國(guó)NIH的基因庫(kù)GENBANK成功注冊(cè)。2、通過一步法半定量RT-PCR篩查，發(fā)現(xiàn)其中4條新的EST片段在髓系白血病人中 高表達(dá)，而在正常人中低表達(dá)。選取4條中的zywB-87 (GenBank注冊(cè)號(hào)CV973101)通過電 子克隆和SMART-RACE技術(shù)，成功克隆了有差異表達(dá)的zywB-87 (GenBank注冊(cè)號(hào)CV973101) 所對(duì)應(yīng)的新基因cDNA全長(zhǎng)見SEQ ID NO :1，該基因定位于染色體lq31. 3，cDNA全長(zhǎng)2313bp， 編碼82個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)見SEQ ID N0:3，含有信號(hào)肽，富含亮氨酸重復(fù)單位(LRR_SD22)， 內(nèi)在固有無(wú)序結(jié)構(gòu)域等功能區(qū)。Blast檢索FAMLF為功能未知的新基因，已被GenBank收 錄，并被命名為FAMLF，核酸注冊(cè)號(hào)為EF413001,蛋白質(zhì)灃冊(cè)號(hào)為ABN58747。3、通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)新基因FAMLF很可能定位于細(xì)胞膜，參與細(xì)胞信息傳 遞途徑中某些蛋白的磷酸化；FAMLF的高表達(dá)，可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖信號(hào)的持續(xù)活化，或者細(xì) 胞凋亡信號(hào)的抑制，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。新基因FAMLF在急性髓系白血病病人中的 表達(dá)明顯高于正常人中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 01)。4、從福建省白血病高發(fā)家系中的患者IV-18骨髓液的單個(gè)核細(xì)胞中提取mRNA，根 據(jù)上述發(fā)現(xiàn)的FAMLF基因序列，設(shè)計(jì)、合成引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、T-A克隆，構(gòu)建出可編碼82 氨基酸殘基的FAMLF全長(zhǎng)cDNA序列的T克隆。5、根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)的FAMLF基因的開放讀碼框序列見SEQ ID NO :2，設(shè)計(jì)、合成該基 因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的免疫表位多肽，免疫紐西蘭白兔，制備出針對(duì)該蛋白的特異性單克隆 性抗體，并應(yīng)用Western Bloting驗(yàn)證該抗體的活性。6,FAMLF基因在mRNA水平的表達(dá)分析根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)的FAMLF基因的cDNA序列， 設(shè)計(jì)、合成該基因的引物，通過一步法RT-PCR對(duì)該基因的在急性髓系白血病與正常人之間 的差異表達(dá)進(jìn)行分析。7、FAMLF基因在蛋白水平的表達(dá)分析應(yīng)用上述發(fā)明的FAMLF特異性單克隆抗體， 通過Western Bloting對(duì)該基因的在急性髓系白血病與正常人之間的差異表達(dá)進(jìn)行分析。通過一步法RT-PCR、Western Bloting發(fā)現(xiàn)FAMLF在急性髓系白血病中的表達(dá)水 平比其在正常人的表達(dá)水平高，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。FAMLF的高表達(dá)，可能導(dǎo)致細(xì)胞增 殖信號(hào)的持續(xù)活化，或者細(xì)胞凋亡信號(hào)的抑制，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。本發(fā)明的所述的新基因FAMLF可以是DNA形式或者是RNA形式。DNA形式包括 cDNA、基因組DNA、人工合成的DNA或通過基因工程所獲得的DNA。DNA可以是單鏈的或是 雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與序列表SEQ ID NO :2所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。編碼序列表SEQ ID NO :2的成熟多肽 的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列； 成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。本發(fā)明還涉及多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或 多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天 然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng) 域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺
6失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及在FAMLF序列信息基礎(chǔ)上衍生、設(shè)計(jì)出來(lái)的反義RNA(antisense)、siRNA(small interfering RNA)、核酶(ribozyme)、三鏈 DNA 形成脫氧寡核苷酸(triple helix-forming oligo-nucleotides，TF0)等基因治療產(chǎn)品。本發(fā)明提供克隆出FAMLF基因全長(zhǎng)cDNA所需要的引物序列見SEQ ID N0:4，提供 含有編碼人重組FAMLF的多核苷酸的重組載體。包括克隆載體和表達(dá)載體；對(duì)發(fā)明來(lái)說， 編碼人重組FAMLF的多核苷酸序列可插入到各種載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸 的重組載體，特別是重組載體。包括本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病 毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體/轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動(dòng)子、增 強(qiáng)子等)和選擇性標(biāo)記基因。本發(fā)明提供含有FAMLF的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞。本發(fā)明中，人重組 FAMLF的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該 多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞； 或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大 腸桿菌，鏈霉菌屬；細(xì)菌細(xì)胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如 果蠅S2或Sf9 ；動(dòng)物細(xì)胞如CH0、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。本發(fā)明提供生產(chǎn)人重組基因FAMLF的方法。用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述 DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方 法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機(jī)械 方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的 人重組基因FAMLF。一般來(lái)說有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼人重組基因FAMLF的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核 苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞； (3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)，為重組多肽；在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng) 基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合 適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間；在步驟(3)中，重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。 如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白， 為重組多肽。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性 處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝 膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLc)和其它各種液相層析技術(shù)及這些 方法的結(jié)合。本發(fā)明的編碼人重組基因FAMLF的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例 如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫(kù)雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢出具有共 同結(jié)構(gòu)特征的克隆的多核苷酸片段。本發(fā)明提供分析該基因表達(dá)及差異表達(dá)所需要的FAMLF基因高效特異擴(kuò)增的引 物序列(檢測(cè)基因)見SEQ ID N0:5，及分析該基因差異表達(dá)的RT-PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條 件。所提供的引物可以用于以下技術(shù)包括但不局限于一步法RT-PCR半定量分析、兩步法 RT-PCR半定量分析、各種熒光定量PCR等PCR反應(yīng)、用于作為基因芯片的引物使用、熒光原
Southern Bloting>^vtlf Northern Bloting本發(fā)明提供基因FAMLF所表達(dá)蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的序列SEQ ID NO :3，以及生 產(chǎn)基因FAMLF特異性單克隆抗體所用的多肽表位序列SEQ ID NO :6。本發(fā)明的其它多肽涉及免疫特異性地結(jié)合序列SEQ ID NO :2或保藏克隆編碼的多 肽、它們的多肽片段或變體、和/或本發(fā)明表位(通過本領(lǐng)域熟知用于測(cè)定特異性抗體_抗 原結(jié)合的免疫測(cè)定法確定的)的抗體和T細(xì)胞抗原受體(TCR)。已知此基本抗體結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。每個(gè)四聚體由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，每 對(duì)具有一條“輕鏈”(約25kDa)和一條“重鏈”(約50-70kDa)。每一條鏈的氨基端部分包 括約100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。每一條鏈的羧基端部分 規(guī)定了恒定區(qū)，其主要負(fù)責(zé)效應(yīng)功能。人類輕鏈劃分為k和\輕鏈，重鏈劃分為y、5、 Y、a或￡，并分別將抗體的同種型規(guī)定為IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE。每對(duì)輕鏈/重鏈的 可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，完整的IgG抗體有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除了雙功能或雙特異性抗體外，這兩個(gè)結(jié) 合位點(diǎn)是相同的。這些鏈均表現(xiàn)出相同的一般結(jié)構(gòu)，即通過三個(gè)超變區(qū)(又稱作互補(bǔ)決定區(qū)或⑶R) 連接起來(lái)的相對(duì)保守構(gòu)架區(qū)(FR)。來(lái)自每對(duì)重鏈和輕鏈的CDR通過構(gòu)架區(qū)進(jìn)行排列，使得 可以與特異表位結(jié)合。從N端至C端，輕鏈和重鏈包含域FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3 和FR4。依據(jù)Kabat具有免疫意義的蛋白質(zhì)的序列(National Institutes of Health, Bethesda, McL雙特異性或雙功能抗體是具有兩個(gè)不同重鏈/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)的人 工雜合抗體。雙特異性抗體可以通過多種方法制備，這些方法包括融合雜交瘤或連接Fab’ 片段。此外，雙特異性抗體可以形成為“diabodies”。 本發(fā)明抗體包括，但不限于多克隆、單克隆、多特異性、人類、人源化或嵌合抗體， 單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab')片段，通過Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段，抗獨(dú)特型(抗Id)抗體 (包括例如針對(duì)本發(fā)明抗體的抗Id抗體)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗體(即，intrabodies)，和上述 所有的結(jié)合表位的片段。術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中用于指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子 的免疫學(xué)活性部分或片段，即含有免疫特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。本發(fā)明免 疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG，IgE, IgM, IgD, IgA和IgY)、類 (例如 IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgAl 和 IgA2)或亞類。最優(yōu)選地，抗體是本發(fā)明的人類抗原結(jié)合性抗體片段，包括但不限于Fab、Fab’和 F(ab，)2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH域的片 段。抗原結(jié)合性抗體片段，包括單鏈抗體，可以僅包含可變區(qū)或還包含以下所有或部分鉸 鏈區(qū)、CH1、CH2、和CH3域。本發(fā)明還包括包含可變區(qū)和鉸鏈區(qū)、CHI、CH2和CH3域的任何組合的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明抗體可以來(lái)自任何動(dòng)物來(lái)源包括鳥類和哺乳動(dòng)物類。優(yōu)選地， 該抗體是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞。本文中，“人類” 抗體包括具有人類免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，包括分離自人免疫球蛋白文庫(kù)或分離 自不表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白的一或多種人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的抗體。本發(fā)明抗體可 以是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或更多的多特異性的。多特異性抗體可以對(duì)于本 發(fā)明多肽的不同表位具有特異性，或可以對(duì)本發(fā)明多肽以及對(duì)異源表位如異源多膚或固體 支持材料具有特異性。本發(fā)明抗體可以根據(jù)其識(shí)別或特異結(jié)合的本發(fā)明表位或多肽部分來(lái)描述或規(guī)定。 該表位或多肽部分可以按本文所述規(guī)定，例如通過N端和C端位置、通過連續(xù)氨基酸殘基的 大小來(lái)規(guī)定。本發(fā)明的優(yōu)選表位包括序列SEQ ID NO :2編碼的多肽的。本發(fā)明包括編碼 這些表位的多核苷酸。本發(fā)明的甚至更優(yōu)選表位包括相應(yīng)于本發(fā)明家族性急性髓系白血病 相關(guān)新基因(FAMLF)的胞外環(huán)或其片段和變體的肽，例如序列SEQ ID NO :2編碼的多肽的 氨基酸。本發(fā)明抗體也可以根據(jù)其交叉反應(yīng)性來(lái)描述或規(guī)定。包括不結(jié)合本發(fā)明多肽的 任何其它類似物、直向同源物、同系物的抗體。結(jié)合與本發(fā)明多肽至少95%、至少90%、至 少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、至少50%—致 (使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法計(jì)算)的多肽的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。不和與本 發(fā)明多肽不足95%、不足90%、不足85%、不足80%、不足75%、不足70%、不足65%、不足 60%、不足55%、不足50%—致(使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法計(jì)算)的多肽結(jié)合 的抗體也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明抗體(包括含有抗體片段或其變體、或由其組成的分子)可以免疫特異性 地結(jié)合人家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)，序列SEQ ID NO :2所編碼多肽和/或 猴家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的多肽或多肽片段或變體。優(yōu)選地，本發(fā)明 抗體免疫特異性地與人類家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā) 明抗體免疫特異性地與人和猴的家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)結(jié)合。而且， 優(yōu)選地，本發(fā)明抗體免疫特異性地結(jié)合人家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)和鼠 家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)更優(yōu)選地，本發(fā)明抗體免疫特異性地與人家族 性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)結(jié)合，其中該抗體對(duì)人家族性急性髓系白血病相關(guān) 新基因(FAMLF)比對(duì)鼠家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)具有較高的親和性。作為非限制性例子，如果抗體與第一抗原結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)小于抗體對(duì)于第二 抗原的Kd時(shí)，可以認(rèn)為該抗體優(yōu)先地結(jié)合第一抗原。本發(fā)明抗體還可以根據(jù)其與本發(fā)明多肽結(jié)合的親和性來(lái)描述或定義。優(yōu)選的 結(jié)合親和性包括具有小于5 X 1(T2M、1(T2M、5 X 1(T3M、1(T3M、5 X 1(T4M、1(T4M的解離常數(shù)或 Kd的那些。更優(yōu)選的結(jié)合親和性包括具有小于5X10-5M、10-5M、5X10-6M、10_6M、5X10-7M、 10_7M、5X10_8M或10_8M的解離常數(shù)或Kd的那些。甚至更優(yōu)選的結(jié)合親和性包括具有 小于 5 X 1(T9M、1(T9M、5 X 1(T10、1(T10M、5 X 1(T"M、1(T"M、5 X 1(T12M、1(T12M、5 X 1(T13M、1(T13M、 5X10-14M、10_14M、5X10-14M、或 10_15M 的解離常數(shù)或 Kd 的那些。本發(fā)明還提供競(jìng)爭(zhēng)地抑制抗體與本發(fā)明表位結(jié)合的抗體，這是通過本領(lǐng)域已知用 于確定競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的任何方法例如本文描述的免疫測(cè)定法確定的。該抗體競(jìng)爭(zhēng)性地抑制至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、或至少50%的
表位結(jié)合。本發(fā)明抗體可以用作本發(fā)明多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑。例如，本發(fā)明包括部分或完 全地破壞受體/配體與本發(fā)明多肽相互作用的抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體與本文公開的抗 原表位或其部分結(jié)合。本發(fā)明的特征在于受體特異性抗體和配體特異性抗體。本發(fā)明還以 不妨礙配體結(jié)合但阻止受體激活的受體特異性抗體為特征。受體激活(即信號(hào)傳遞)可 以通過本文所述或其它本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)確定。例如，可以通過使用免疫沉淀及隨后的 western印跡分析(見上述)檢測(cè)受體或其底物的磷酸化(例如酪氨酸或絲氨酸/蘇氨 酸)，確定受體激活。本發(fā)明還涉及既阻止配體結(jié)合又阻止受體激活的受體特異性抗體、以及識(shí)別受體 一配體復(fù)合物并優(yōu)選地不特異識(shí)別未結(jié)合的受體或未結(jié)合的配體的抗體。同樣，本發(fā)明還 包括與配體結(jié)合并阻止配體與受體結(jié)合的中和抗體，以及與配體結(jié)合由此阻止受體激活但 不阻止配體與受體結(jié)合的抗體。本發(fā)明還包括激活受體的抗體。這些抗體可以作為受體激 動(dòng)劑起作用，即通過例如誘導(dǎo)受體二聚化，增強(qiáng)或激活所有或部分的配體介導(dǎo)的受體激活 的生物學(xué)活性。這些抗體可以被確定為生物學(xué)活性(包括本文公開的本發(fā)明肽的特定生物 學(xué)活性)的激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑。上述抗體激動(dòng)劑可以使用本領(lǐng)域已知方法制備。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)或其片段或變體 的抗體，包含具有本發(fā)明抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表 達(dá)的任何一條重鏈和/或本發(fā)明抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì) 胞系表達(dá)的任何一條輕鏈的氨基酸序列的多肽。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病 相關(guān)新基因(FAMLF)或其片段或變體的抗體，包含具有本發(fā)明抗家族性急性髓系白血病相 關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的任何一個(gè)重鏈VH域和/或本發(fā)明抗家族性急性 髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的任何一個(gè)輕鏈VL域的氨基酸序列 的多肽。本發(fā)明抗體包含本發(fā)明單一抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表 達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的VH域和VL域的氨基酸序列。本發(fā)明抗體包含本發(fā)明兩種不同抗家族性急 性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系所表達(dá)的VH域和VL域的氨基酸序列。 本發(fā)明還包括如下分子，所述分子包含免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基 因(FAMLF)的、本發(fā)明抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá) 的VH和/或VL域的抗體片段或變體，或由其組成，本發(fā)明還包括編碼這些VH和VL域、分 子、片段和/或變體的核酸分子。本發(fā)明還提供免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多 肽或多肽片段或變體的抗體，其中所述抗體包含如下多肽或由如下多肽組成，該多肽具有 本發(fā)明一種或多種抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的 重鏈中任何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)VH CDR的氨基酸序列。尤其是，本發(fā)明提供包含如下多肽或由如下多肽組成的、免疫特異性地結(jié)合家族 性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體，所述多肽具有本發(fā)明一種或多種抗家族性 急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的重鏈中VH CDR1的氨基酸序 列。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體包含如下多肽 或由其組成，其中所述多肽具有本發(fā)明一種或多種抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因
10(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的重鏈中VH⑶R2的氨基酸序列。免疫特異性地結(jié)合家族性 急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體包含如下多肽或由其組成，其中所述多肽具有 本發(fā)明一種或多種抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系袁達(dá)的 重鏈中VH⑶R3的氨基酸序列。包含這些抗體或抗體片段或其變體、并免疫特異性地結(jié)合 家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)或家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF) 片段或其變體的分子也包括在本發(fā)明內(nèi)，同樣編碼這些抗體、分子、片段和/或變體的核酸 分子也包括在內(nèi)。本發(fā)明還提供免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多 肽或多肽片段或變體的抗體，其中所述抗體包含如下多肽或由其組成，所述多肽具有具有 本發(fā)明一種或多種抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的 輕鏈中任何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)VL CDR的氨基酸序列。尤其是，本發(fā)明提供包含如下 多肽或由如下多肽組成的、免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF) 的抗體，所述多肽具有本發(fā)明一種或多種抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗 體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈中VL CDR1的氨基酸序列。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系 白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體包含如下多肽或由其組成，其中所述多肽具有本發(fā)明一 種或多種抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈中VL CDR2的氨基酸序列。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體 包含如下多肽或由其組成，其中所述多肽具有本發(fā)明一種或多種抗家族性急性髓系白血病 相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系袁達(dá)的輕鏈中VL CDR3的氨基酸序列。包含這些抗體 或抗體片段或其變體、并免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)或 家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)片段或其變體的分子也包括在本發(fā)明內(nèi)，同樣 編碼這些抗體、分子、片段和/或變體的核酸分子也包括在內(nèi)。本發(fā)明還提供免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多 肽或家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽片段或變體的抗體(包括含有抗體片 段或變體或由其組成的分子)，其中所述抗體包含本發(fā)明一種或多種抗家族性急性髓系白 血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系所表達(dá)的重鏈或輕鏈中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更 多個(gè)VHCDR以及一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)VL CDR，或由它們組成。尤其是，本發(fā)明提供免疫 特異性結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽或多肽變體或變體的抗體，其 中所述抗體包含本發(fā)明一種或多種抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表 達(dá)細(xì)胞系所表達(dá)的重鏈或輕鏈中VH⑶R和VL CDR的VH⑶R1和VL⑶Rl、VH⑶R1和VL CDR2、VHCDR1 和 VL CDR3、VH CDR2 和 VL CDR1、VH CDR2 和 VL CDR2、VH CDR2 和 VL CDR3、 VH CDR3禾口 VH CDRUVH CDR3禾口 VL CDR2、VH CDR3禾口 VL CDR3、或它們的任何組合，或由它 們組成。這些組合中的一種或多種來(lái)自于本發(fā)明單一抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基 因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系。包含這些抗體的片段或變體或由其組成的、免疫特異性結(jié)合 G蛋白趨化因子受體(CCR5)的分子也包含在本發(fā)明內(nèi)，同樣編碼這些抗體、分子、片段或變 體的核酸分子也包括在內(nèi)。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明抗體(包括含有抗體片段或其變體或由其組成的分子) 的核酸分子，一般是分離的核酸分子。本發(fā)明核酸分子編碼如下抗體(包括含有抗體片 段或其變體或由其組成的分子)，所述抗體包含具有本發(fā)明抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的重鏈的任一個(gè)VH域的氨基酸序列的VH域和具有 本發(fā)明抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈的氨基 酸序列的VL域，或由它們組成。本發(fā)明核酸分子編碼如下抗體(包括含有抗體片段或其 變體或由其組成的分子)，所述抗體包含具有本發(fā)明抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因 (FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的重鏈的任一個(gè)VH域的氨基酸序列的VH域或具有本發(fā)明抗 家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈的氨基酸序列的 VL域，或由它們組成。本發(fā)明還提供包含本文所述抗體分子(例如VH域和/或VL域)的變體(包括衍 生物)或由其組成的抗體，其中該抗體免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基 因(FAMLF)或其片段或變體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將突變引入編碼本 發(fā)明分子的核苷酸序列中，這些技術(shù)包括例如導(dǎo)致氨基酸替代的定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘 變。優(yōu)選地，該變體(包括衍生物)編碼少于50個(gè)氨基酸替代、少于40個(gè)氨基酸替代、少 于30個(gè)氨基酸替代、少于25個(gè)氨基酸替代、少于20個(gè)氨基酸替代、少于15個(gè)氨基酸替代、 少于10個(gè)氨基酸替代、少于5個(gè)氨基酸替代、少于4個(gè)氨基酸替代、少于3個(gè)氨基酸替代或 少于2個(gè)氨基酸替代(相對(duì)于參考VH域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL域、VL CDR1、VL CDR2或VL CDR3而言)?！氨Ｊ匕被崽娲笔侵笇被釟埢娲鸀榫哂袔嗨齐姾傻?側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有帶相似電荷的側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在現(xiàn)有技術(shù)中已有定義。這 些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨 酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半 胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨 酸)、0分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸、組氨酸)的氨基酸?；蛘?，可以沿著全部或部分的編碼序列，例如通過飽和誘變隨 機(jī)地引入突變，并可以就生物學(xué)活性篩選所獲突變體以鑒定保留活性(例如結(jié)合家族性急 性髓系白血病相關(guān)新基因的能力)的突變體。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽或其片段或 變體的本發(fā)明抗體(包括含有其抗體片段或變體或由其組成的分子)，包含如下核苷酸序 列編碼的氨基酸序列或由其組成，所述核苷酸序列與互補(bǔ)于本發(fā)明一種或多種抗家族性急 性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系表達(dá)的一個(gè)VH或VL域的編碼序列的核 苷酸序列雜交，所述雜交的條件是嚴(yán)緊條件，倒如與濾膜結(jié)合DNA在6 X氯化鈉/檸檬酸鈉 (SSC)中約45°C下雜交，之后在0. 2XSSC/0. 1 % SDS中于約50_65°C下作一或多次洗滌；高 度嚴(yán)緊條件，倒如與濾膜結(jié)合核酸在6XSSC中約45°C下雜交，之后在0. 1XSSC/0. 2% SDS 中于約68°C下作一或多次洗滌；或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它嚴(yán)緊雜交條件。編碼這些抗 體的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。正如本領(lǐng)域熟知的，具有相似氨基酸序列的多肽、或其片段或變體常常具有相似 的結(jié)構(gòu)和許多相同的生物學(xué)活性。因此，免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān) 新基因(FAMLF)多肽或家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽片段或變體的抗 體(包括含有其抗體片段或變體或由它們組成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VH域 或由其組成，所述氨基酸序列與本發(fā)明抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體 表達(dá)細(xì)胞系所表達(dá)的重鏈的VH域的氨基酸序列有至少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%或至少99%的一致性。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽或家族性急 性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽的片段或變體的抗體(包括含有其抗體片段或變體 或由它們組成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VL域或由其組成，所述氨基酸序列與 本發(fā)明抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體表達(dá)細(xì)胞系所表達(dá)的輕鏈的VL 域的氨基酸序列有至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少 65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的一致 性。本發(fā)明還包括與本文所述一種或多種抗體具有一種或多種相同生物學(xué)特征的抗 體(包括含有其抗體片段或變體或由它們組成的分子)。所謂“生物學(xué)特征”是指抗體的體 外或體內(nèi)活性或性質(zhì)，如結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)(例如表達(dá)在細(xì) 胞表面的家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)、膜嵌合家族性急性髓系白血病相關(guān) 新基因(FAMLF)、和/或家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的片段或變體)的能 力；基本上抑制或破壞家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)與家族性急性髓系白血 病相關(guān)新基因(FAMLF)配體結(jié)合的能力下調(diào)細(xì)胞表面上家族性急性髓系白血病相關(guān)新基 因(FAMLF)多肽表達(dá)的能力；抑制或破壞家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)介導(dǎo) 的生物學(xué)活性的能力。任選地，本發(fā)明抗體與本文具體提及的至少一種抗體結(jié)合相同的表 位。該表位結(jié)合可以使用本領(lǐng)域已知的測(cè)定法確定。本發(fā)明還提供中和家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體(包括含有 其抗體片段或變體或由它們組成的分子)，所述抗體包含本發(fā)明抗體VH或VL域的部分(例 如 VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDRUVL CDR2、和 / 或 VL CDR3)、或由其組成。例如，“中 和家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)或其片段或變體”的抗體可以是減小或徹底 破壞家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)或其片段或變體結(jié)合其配體的能力的抗 體；和/或徹底破壞或抑制家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)的抗 體。中和家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VH域或 其片段或變體以及本發(fā)明抗體VL域或其片段或變體的氨基酸序列的多肽，或由其組成。中 和家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體，包含具有本發(fā)明單一抗體(或scFv 或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或變體的氨基酸序列的多膚，或由其組成。中和家 族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF))的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VH域或其片段或 變體的氨基酸序列的多肽，或由其組成。中和家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF) 的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VL域或其片段或變體的氨基酸序列的多肽，或由其組成。中 和家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)或其片段或變體的抗體，包含具有本發(fā)明抗 體VH CDR域或其片段或變體的氨基酸序列的多肽，或由其組成。中和家族性急性髓系白血 病相關(guān)新基因(FAMLF)或其片段或變體的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VH CDR3域或其片段 或變體的氨基酸序列的多肽，或由其組成。中和家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF) 或其片段或變體的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VLCDR域或其片段或變體的氨基酸序列的多 肽，或由其組成。中和家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)或其片段或變體的抗體， 包含具有本發(fā)明抗體VL CDR3域或其片段或變體的氨基酸序列的多肽，或由其組成。編碼
13這些抗體的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明還提供下調(diào)家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的細(xì)胞表面表達(dá) (通過本領(lǐng)域任何已知方法測(cè)定，例如FACS分析測(cè)定法)的抗體(包括含有其抗體片段或 變體或由其組成的分子)。作為一種非限制性假設(shè)，該下調(diào)可能是抗體誘導(dǎo)的家族性急性髓 系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)內(nèi)化的結(jié)果。所述抗體包含具有本發(fā)明抗體的氨基酸序列的 VH或VL域或其片段或變體的部分(例如VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、 VLCDR3)、或由其組成。下調(diào)家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的細(xì)胞表面表達(dá)的 抗體，包含具有本發(fā)明抗體VH域或其片段或變體和本發(fā)明抗體VL域或其片段或變體的氨 基酸序列的多肽、或由其組成。下調(diào)家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的細(xì)胞表面表達(dá)的抗體，包含具 有來(lái)自本發(fā)明單一抗體(或scFv或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或變體的氨基酸序 列的多肽、或由其組成。下調(diào)家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的細(xì)胞表面表達(dá) 的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VH域或其片段或變體的氨基酸序列的多肽、或由其組成。下 調(diào)家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的細(xì)胞表面表達(dá)的抗體，包含具有本發(fā)明抗 體VL域或其片段或變體的氨基酸序列的多肽、或由其組成。下調(diào)家族性急性髓系白血病相 關(guān)新基因(FAMLF)的細(xì)胞表面表達(dá)的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VH CDR3或其片段或變體 的氨基酸序列的多肽、或由其組成。下調(diào)家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的細(xì) 胞表面表達(dá)的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VLCDR3或其片段或變體的氨基酸序列的多肽、或 由其組成。編碼這些抗體的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明還提供增加G蛋白趨化因子受體(CCR5)活性的抗體(包括含有其抗體片 段或變體或由其組成的分子)，所述抗體包含具有本發(fā)明抗體的VH或VL域或其片段或變體 的部分(例如 VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)、或由其組成。增 加家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)活性的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VH域或其 片段或變體和本發(fā)明抗體VL域或其片段或變體的氨基酸序列的多肽、或由其組成。增加家 族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)活性的抗體，包含具有來(lái)自本發(fā)明單一抗體(或 scFv或Fab片段)的VH域和VL域或其片段或變體的氨基酸序列的多肽、或由其組成。增 加家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)活性的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VH域或 其片段或變體的氨基酸序列的多肽、或由其組成。增加家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因 (FAMLF)活性的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VL域或其片段或變體的氨基酸序列的多肽、或 由其組成。增加家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)活性的抗體，包含具有VH⑶R 域或其片段或變體的氨基酸序列的多肽、或由其組成。增加家族性急性髓系白血病相關(guān)新 基因(FAMLF)活性的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VH CDR3或其片段或變體的氨基酸序列的 多肽、或由其組成。增加家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)活性的抗體，包含具有 本發(fā)明抗體VL CDR城或其片段或變體的氨基酸序列的多肽、或由其組成。增加家族性急性 髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)活性的抗體，包含具有本發(fā)明抗體VL CDR3或其片段或變 體的氨基酸序列的多肽、或由其組成。編碼這些抗體的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明還提供包含免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF) 的抗體(包括含有其抗體片段或變體)和異源多肽或由其組成的融合蛋白。優(yōu)選地，與抗體 融合的異源蛋白是對(duì)于功能有用的或?qū)τ诎邢蚣易逍约毙运柘蛋籽∠嚓P(guān)新基因(FAMLF)表達(dá)細(xì)胞有用的。本發(fā)明融合蛋白包含如下多肽或其片段或變體和異源多肽序列或由它們 組成，所述多肽具有本發(fā)明抗體任意一個(gè)或多個(gè)VH域的氨基酸序列或本發(fā)明抗體任意一 個(gè)或多個(gè)VL域的氨基酸序列。本發(fā)明融合蛋白包含如下多肽或其片段或變體和異源多肽 序列，所述多肽具有本發(fā)明抗體的任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)VH CDR的氨基酸序列、或 本發(fā)明抗體的任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)VL CDR的氨基酸序列。該融合蛋白包含如下多 肽或其片段或變體和異源多肽序列，其中所述多肽具有本發(fā)明抗體VH CDR3的氨基酸序列， 而該融合蛋白可以免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)。融合蛋 白包含如下多肽或其片段或變體和異源多肽序列，其中所述多肽具有本發(fā)明抗體至少一個(gè) VH域的氨基酸序列和本發(fā)明抗體至少一個(gè)VL域的氨基酸序列。優(yōu)選地，融合蛋白的VH和 VL域相應(yīng)于本發(fā)明的單一抗體(或scFv或Fab片段)。本發(fā)明融合蛋白包含如下多肽或 其片段或變體和異源多肽序列或由它們組成，所述多肽具有本發(fā)明抗體的任意一個(gè)、兩個(gè)、 三個(gè)或更多個(gè)VH CDR的氨基酸序列和本發(fā)明抗體的任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)VL CDR 的氨基酸序列。優(yōu)選地，這些VH⑶R或VL⑶R中的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或更多個(gè) 相應(yīng)于本發(fā)明的單一抗體(或scFv或Fab片段)。編碼這些融合蛋白的核酸分子也包括在 本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明抗體可以用于例如但不限于純化、檢測(cè)和靶向本發(fā)明多肽，包括體外和體 內(nèi)的診斷和治療方法。例如，可以將這些抗體用于免疫測(cè)定以定量和定性地測(cè)量生物學(xué)樣 品中本發(fā)明多肽的水平。本發(fā)明抗體可以以被動(dòng)免疫的方式給予個(gè)體?；蛘撸梢允褂帽景l(fā)明多肽進(jìn)行表 位作圖以鑒定該抗體所結(jié)合的表位。以此方式鑒定的表位又可以例如用作疫苗候選物，即 用于免疫個(gè)體引起針對(duì)天然形式的家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)。正如以下更詳細(xì)描述的，本發(fā)明抗體可以單獨(dú)使用或與其它組合物組合使用。還 可以通過重組方式使這些抗體域異源多肽在N或C端融合，或通過化學(xué)方式使這些抗體與 多肽或其它組合物綴合(包括共價(jià)和非共價(jià)綴合)。例如，本發(fā)明抗體可以通過重組方式與 在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中用作標(biāo)記的分子以及效應(yīng)分子如異源多肽、藥物、放射性核素或毒素融合或綴合。本發(fā)明抗體包括例如通過使該抗體共價(jià)結(jié)合任何類型分子而修飾的衍生物。例 如，但不構(gòu)成限制，該抗體衍生物包括經(jīng)過修飾的抗體，所述修飾的例子有糖基化、乙酰化、 PEG化(pegylation)、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)進(jìn)行的衍生化、蛋白水解 切割、與細(xì)胞配體或其它蛋白連接等。許多化學(xué)修飾都可以通過已知技術(shù)進(jìn)行，包括但不限 于特異化學(xué)切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代謝合成等。此外，該衍生物還可以含有一個(gè)或 多個(gè)非經(jīng)典氨基酸。本發(fā)明抗體可以通過本領(lǐng)域任何適當(dāng)?shù)囊阎椒óa(chǎn)生。針對(duì)目的抗原的多克隆抗 體可以通過本領(lǐng)域熟知的多種方法制備。例如，可以將本發(fā)明多肽施用于多種宿主動(dòng)物，包 括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以誘導(dǎo)含有特異針對(duì)該抗原的多克隆抗體的血清產(chǎn)生。根據(jù) 宿主物種，可以使用多種佐劑增強(qiáng)此免疫應(yīng)答，這些佐劑包括但不限于弗氏佐劑(完全的 和不完全的)、礦物膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油性 乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚、和潛在有用的人類佐劑如BCG(卡介苗)和小型棒狀桿菌 (Corynebacterium parvum)。這些佐劑是本領(lǐng)域熟知的。
單克隆抗體可以使用本領(lǐng)域已知的廣泛多種技術(shù)來(lái)制備，這些技術(shù)包括使用雜交 瘤、重組、噬菌體展示技術(shù)、或它們的組合。例如，可以使用雜交瘤技術(shù)，包括本領(lǐng)域已知 的和如 Harlow 等，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2 版， 1988) ；Hammerling等，單克隆抗體和T細(xì)胞雜交瘤563-581 (Elsevier，N.Y. 1981)(所述參 考文獻(xiàn)完整地并入本文作為參考)中教導(dǎo)的雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗 體”是指來(lái)源于單一克隆，包括真核、原核、或噬茵體克隆的抗體，而非指其制備方法。使用雜交瘤技術(shù)制備和篩選特異抗體的方法是常規(guī)的和本領(lǐng)域熟知的?？梢允褂?本發(fā)明多肽或表達(dá)該肽的細(xì)胞免疫小鼠。一旦檢測(cè)到免疫應(yīng)答，即在小鼠的血清中檢測(cè)到 特異針對(duì)該抗原的抗體后，收獲小鼠的脾臟并分離脾細(xì)胞。然后通過熟知技術(shù)將這些脾細(xì) 胞和任何適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞融合。通過有限稀釋篩選并克隆雜交瘤。然后通過本領(lǐng)域已知 的方法分析雜交瘤細(xì)胞，以尋找分泌能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體的細(xì)胞?？梢酝ㄟ^使用陽(yáng) 性雜交瘤克隆免疫小鼠產(chǎn)生一般含有高水平抗體的腹水。因此，本發(fā)明提供制備單克隆抗體的方法以及通過該方法產(chǎn)生的抗體，所述方法 包括培養(yǎng)分泌本發(fā)明抗體的雜交瘤細(xì)胞，其中優(yōu)選地該雜交瘤是通過將分離自使用本發(fā)明 抗原免疫的小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生，然后篩選融合產(chǎn)生的雜交瘤以尋找分泌 能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體的雜交瘤克隆。制備多克隆和單克隆人類B細(xì)胞系的另一熟知方法是使用埃_巴二氏病毒(EBV) 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。制備EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系的操作方法是本領(lǐng)域通常已知的，例如Current Protocols inlmmunology (Coligan 等編，1994，John Wiley & Sons，NY)(特此完整地并入 本文作為參考)第7. 22章所給操作方法。用于轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞的來(lái)源通常是人外周血，但用 于轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞也可以來(lái)源于其它來(lái)源，包括但不限于淋巴結(jié)、扁桃體、脾、腫瘤組織和感 染的組織。一般在EBV轉(zhuǎn)化前將組織制成單細(xì)胞懸浮液。此外，可以采取步驟以物理除去 或失活含B細(xì)胞的樣品中的T細(xì)胞，因?yàn)閬?lái)自抗EBV抗體血清陽(yáng)性個(gè)體的T細(xì)胞會(huì)抑制EBV 造成的B細(xì)胞永生化。一般，用EBV接種含有人類B細(xì)胞的樣品，并培養(yǎng)3-4周。EBV的典 型來(lái)源是B95-8細(xì)胞系的培養(yǎng)物上清液。一般可以在3-4周培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)觀察到EVB轉(zhuǎn)化 的物理征兆。通過相差顯微鏡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以表現(xiàn)為大、明亮、多毛并傾向聚集為緊密的細(xì) 胞簇。最初，EBV系一般是多克隆的。然而，經(jīng)過長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)，EBV系可以由于特定B細(xì) 胞克隆的選擇性快速生長(zhǎng)而變位單克隆的或多克隆的?；蛘?，可以將多克隆EBV轉(zhuǎn)化系亞 克隆(例如通過有限稀釋培養(yǎng))或使之與適當(dāng)?shù)娜诤匣锇槿诤喜⒂邢尴♂屼伆逡垣@得單克 隆B細(xì)胞系。對(duì)于EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，適當(dāng)?shù)娜诤匣锇榘ㄐ∈蠊撬枇黾?xì)胞系(例如SP2/0、 X63-Ag8. 653)、異源雜交瘤細(xì)胞系(人X小鼠例如SPAM_8、SBC_H20和CB-F7)、和人細(xì)胞 系(例如GM 1500、SK0-007、RPMI8826和KR-4)。因此，本發(fā)明還提供制備針對(duì)本發(fā)明多肽 或其片段的多克隆或單克隆人抗體的方法，該方法包括EBV轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞。識(shí)剮特異表位的抗體片段可以通過已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，本發(fā)明Fab和F(ab’ )2 片段可以通過使用酶例如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab’)2片段) 蛋白水解免疫球蛋白分子產(chǎn)生。F(ab’)2片段含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CHI區(qū)。例如，本發(fā)明抗體也可以使用本領(lǐng)域已知的多種噬茵體展示文庫(kù)產(chǎn)生。在噬茵 體展示方法中，功能性抗體域被展示在帶有編碼其的多核苷酸序列的噬茵體顆粒的表面。 該噬茵體可以用于展示從所有組成成分或組合抗體文庫(kù)(例如人或鼠)表達(dá)的抗原結(jié)合域。可以使用抗原，例如使用標(biāo)記的抗原或與固體表面或珠結(jié)合或被其捕獲的抗原，選擇 或鑒定表達(dá)結(jié)合目的抗原的抗原結(jié)合域的噬茵體。用于這些方法的噬茵體典型地是絲 狀噬菌體，包括fd和M13，噬菌體表達(dá)的結(jié)合域有重組方式與噬菌體的基因III或基因 VIII蛋白融合的Fab、Fv或二硫鍵穩(wěn)定的Fv抗體域?？梢杂糜谥苽浔景l(fā)明抗體的噬菌體 展示方法的例子包括公開在如下文獻(xiàn)中的那些Brinkman等，J. Immunol. Methods 182 41-50(1995) ；Ames 等，J. Immunol. Methods 184 177-186 (1995) ；Kettleborough 等，Eur. J. Immunol. 24 952-958 (1994) ；Persic Gene 187:9—18(1997) ；BurtonAdvances in Immunology57 191-280 (1994) ；PCT 申請(qǐng) PCT/GB9I/01134 ；PCT 公開文本 W090/02809 ；WO 91/10737 ；WO 92/01047 :W0 92/18169 ；WO 93/11236 :W0 95/15982 :2095/20401 ；和美國(guó) 專利 5，698，426 ；5，223，409 ；5，403，484 ；5，580，717 ；5，427，908 ；5，750，753 ；5，821，047 ； 5，571，698 ；5，427，908 ；5，516，637 ；5，780，225 ；5，658，727 ；5，733，743 和 5，969，108 ；所有 均完整地并入本文作為參考。完全的人抗體尤其適合于治療人類患者。人抗體可以通過本領(lǐng)域已知的多種方 法制備，包括使用來(lái)源于人免疫球蛋白序列的抗體文庫(kù)進(jìn)行的上述噬茵體展示方法。見 例如美國(guó)專利 4，444，887 和 4，716，111 ；和 PCT 公開文本 WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096, WO 96/33735，和 WO 91/10741 ；所有均完整地并入 本文作為參考。還可以使用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫棗蛋白但可表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基 因小鼠制備人抗體。例如，可以隨機(jī)地或通過同源重組向小鼠胚胎干細(xì)胞中引入人重鏈和 輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合物?；蛘撸梢韵蛐∈笈咛ジ杉?xì)胞中引入人可變區(qū)、恒定區(qū)和多變 區(qū)以及人重鏈和輕鏈基因?？梢詥为?dú)地或在通過同源重組引入人免疫球蛋白位點(diǎn)的同時(shí)造 成小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因的功能喪失。尤其是，JH區(qū)的純合缺失可以阻止內(nèi)源性 抗體產(chǎn)生。擴(kuò)增該修飾的胚胎干細(xì)胞并將其注射至胚泡中以產(chǎn)生嵌合小鼠。然后飼養(yǎng)嵌合 小鼠以產(chǎn)生表達(dá)人抗體的純合后代。以正常方式使用所選抗原，例如本發(fā)明多肽的全部或 部分免疫該轉(zhuǎn)基因小鼠。使用常規(guī)雜交瘤技術(shù)可以從該免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得針對(duì)該抗 原的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠包含的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化過程中重排，并隨 后經(jīng)過類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。由此，使用該技術(shù)可以制備治療上有用的IgG、IgA、IgM和 IgE抗體。關(guān)于制備人抗體的該技術(shù)的綜述，見Lonberg和Huszar，Int. Rev. ImmunO 1. 13 65-93(1995)。
對(duì)于制備人抗體和人單克隆抗體的此技術(shù)的詳細(xì)討論和制備這些抗體的操作 方法，參見例如PCT公開文本W(wǎng)O 98/24893 :W0 92/01047 ；W096/33735 ；歐洲專利0 598 877 ；美國(guó)專利 5，413，923 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，569，825 ；5，661，016 ；5，545，806 ； 5，814，318 ；5，885，793 ；5，916，771 ；5，939，598 ；6，075，181 ；和 6，114，598，所有均完整地 并入本文作為參考。此外，可以雇用公司例如Abgenix公司(Fremont，CA)和Genpharm(San Jose, CA)使用類似于上述方法的技術(shù)提供針對(duì)所選抗原的人抗體。識(shí)別所選表位的完全的人抗體可以使用稱作“導(dǎo)向選擇(guided selection) ”的 技術(shù)產(chǎn)生。在此分中所選非人單克隆抗體即小鼠抗體用于指導(dǎo)選擇識(shí)別相同表位的完全人 抗體。(Jespers 等，Bio/technology 12 :899_903 (1988))。而且，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，又可以使用本發(fā)明多肽的抗體制備“模擬，，本發(fā)明多肽的抗獨(dú)特型抗體。(見例如Greenspan&Bona，F(xiàn)ASEB J. 7 (5) =437-444(1989) 和Nissinoff，J. Immunol. 147(8) =2429-2438 (1991)) 例如，結(jié)合并競(jìng)爭(zhēng)抑制本發(fā)明多肽 的多肽多聚化和/或與配體的結(jié)合的抗體可以用于制備“模擬”多肽多聚化和/或結(jié)合域 的抗獨(dú)特型抗體，并由此用于結(jié)合并中和多肽和/或其配體。該中和抗獨(dú)特型抗體或該抗 獨(dú)特型的Fab片段可以用于治療法以中和多肽配體。例如，可以使用該抗獨(dú)特型抗體結(jié)合 本發(fā)明多肽和/或結(jié)合其配體/受體，并由此激活或封閉其生物學(xué)活性。intrabody是自重組核酸分子表達(dá)的并經(jīng)改造被滯留在細(xì)胞內(nèi)(例如被滯留在細(xì) 胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或周質(zhì))的抗體，常常是scFv。Intrabody可以用于例如破壞該intrabody 結(jié)合的蛋白質(zhì)的功能。intrabody的表達(dá)還可以通過在包含該intrabody的核酸表達(dá) 裁體中使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)節(jié)。本發(fā)明intrabody可以使用本領(lǐng)域已知方法制備， 例如公開并綜述在下列文獻(xiàn)中的那些方法Chen等，Hum. Gene Ther. 5 =595-601(1994)； Marasco, W. A. GeneTher. 4 :11_15(1997) ；Rondon 禾口 Marasco, Annu. Rev. Microbiol. 51 ； 257-283(1997) ；Proba 等，J. Mol. BiOl. 275 245-253 (1998) ；Cohen 等，Oncogene 17: 2445-2456(1998) ；Ohage 和 Steipe，J. Mol. Biol. 291 :1119_1128 (1999) ；Ohage 等，J. Mol. Biol. 291:1 129-1134(1999) =Wirtz 和 Steipe, Protein Sci. 8 2245-2250(1999) :Zhu 等，J. Immunol. Methods 231:207-222(1999)；和其中所引用文獻(xiàn)。XenoMouse技術(shù)根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選通過利用如下轉(zhuǎn)基因小鼠制備，所述轉(zhuǎn) 基因小鼠插入了人抗體產(chǎn)生基因的實(shí)質(zhì)性部分但在內(nèi)源性鼠源抗體的產(chǎn)生上具有缺陷 (例如可以從Abgenix Inc.，F(xiàn)remont，CA獲得的XenoMouse系)。然后，這些小鼠能夠產(chǎn)生 人免疫球蛋白分子和抗體并無(wú)法產(chǎn)生鼠源免疫球蛋白分子和抗體。用于實(shí)現(xiàn)此目的的技術(shù) 公開在本文公開的專利、申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)中。在YAC中克隆和重構(gòu)兆堿基大小的人類位點(diǎn)和將其引入小鼠生殖系的能力提供 了強(qiáng)有力的工具，以闡明極大或粗略作圖的位點(diǎn)的功能性成分以及產(chǎn)生有用的人類疾病模 型。而且，用人類等價(jià)物取代小鼠位點(diǎn)的該技術(shù)的應(yīng)用也可以提供關(guān)于發(fā)育期間人類基因 產(chǎn)物的表達(dá)和調(diào)節(jié)、它們與其它系統(tǒng)的通訊、和它們參與的疾病誘導(dǎo)和進(jìn)程的獨(dú)特看法。該策略的一個(gè)重要實(shí)際應(yīng)用是小鼠的體液免疫系統(tǒng)“人源化”。將人免疫球蛋白 (Ig)位點(diǎn)引入內(nèi)源性Ig基因已失活的小鼠中，為研究抗體程序化表達(dá)和組裝的機(jī)制以及 它們?cè)贐細(xì)胞發(fā)育中的作用提供了機(jī)會(huì)。而且，該策略可以為制備全人單克隆抗體(Mab) 提高了理想的來(lái)源，這是朝向?qū)崿F(xiàn)抗體治療人類疾病希望的一個(gè)重要里程碑。預(yù)期全人抗體可以最小化免疫應(yīng)答和過敏反應(yīng)，這些是小鼠或小鼠衍生的單克隆 抗體所固有的，從而由此增加所施用抗體的效率和完全性。可以預(yù)期全人抗體在要求重復(fù) 施用抗體的慢性和復(fù)發(fā)性人類疾病(例如癌癥)的治療中能夠提供實(shí)質(zhì)性的優(yōu)點(diǎn)。達(dá)到此目的的一種方法是使用大片段的人Ig位點(diǎn)改造在小鼠抗體制備方面有缺 陷的小鼠，預(yù)期此小鼠將產(chǎn)生大量的人抗體所有組成成分而缺少小鼠抗體。大的人Ig片段 將保存大可變基因的多樣性以及適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)抗體的產(chǎn)生和表達(dá)。通過利用小鼠機(jī)器使抗體 多樣化和進(jìn)行篩選以及缺乏對(duì)人類蛋白的耐受性，在這些小鼠中復(fù)制的人抗體所有組成成 分應(yīng)產(chǎn)生針對(duì)任何目的抗原(包括人抗原)的高親和性抗體。使用雜交瘤技術(shù)，可以容易 地制備和選擇具有期望特異性的抗原特異性人單克隆抗體。此一般策略聯(lián)系1994公開的第一只XenoMouse 系的制備進(jìn)行了闡明。見Green等，Nature Genetics 7 13-21 (1994)。該 XenoMouse 系是利用酵母人工染色體(YACS)改 造的，所述YACS分別含有245kb和10190kb大小的人重鏈位點(diǎn)和κ輕鏈座位的生殖系構(gòu) 象片段，其含有核心可變區(qū)和恒定區(qū)的序列。對(duì)于抗體的重排和表達(dá)而言含有人Ig的YAC 證明與小鼠系統(tǒng)相容，并能夠替代失活的小鼠Ig基因。這由其誘導(dǎo)B細(xì)胞發(fā)育、產(chǎn)生全人 抗體的成熟樣人所有組成成分、以及產(chǎn)生抗原特異性人單克隆抗體的能力得到證實(shí)。這些 結(jié)果還提示，含有較大數(shù)量的V基因、附加的調(diào)節(jié)元件和人Ig恒定區(qū)的較大部分人Ig座位 的引入可以基本上概括對(duì)感染和免疫的人體液應(yīng)答特征性的所有組成成分。近來(lái)，Green 等的工作擴(kuò)展到通過分別引入人重鏈座位和κ輕鏈座位的兆堿基大小生殖系構(gòu)象YAC片 段而導(dǎo)入約80%以上人抗體所有組成成分以產(chǎn)生XenoMouse 小鼠.見Mendez等Nature Genetics 15 146-156(1997)，Green 和 Jakobovits J. Exp. Med. 188 :483_495(1998)， Green，Journal of Immunological Methods 231 :11-23 (1999)和 1996 年 12 月 3 日提交的 美國(guó)專利申請(qǐng)08/759，620，所有這些的公開均特此并入作為參考。人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答導(dǎo)致制備嵌合或人源化抗體的工業(yè)。盡管嵌合抗體具 有人恒定區(qū)和鼠可變區(qū)，但預(yù)期會(huì)觀察到某些人抗嵌舍抗體(HACA)應(yīng)答，尤其是在長(zhǎng)期或 多劑量使用抗體時(shí)。因此，可能期望提供針對(duì)家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF) 多肽的完全人類抗體，以便降低HAMA或HACA應(yīng)答的影響和/或效果。特異針對(duì)家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽的單克隆抗體是使用雜交瘤技術(shù)制備的。(Kohler 等，Nature 256 495(1975) =Kohler 等，Eur. J. Immunol. 6 511(1976) ；Kohler 等，Eur. J. Immunol. 6 :292 (1976) ；Hammerling 等，《單克隆抗體和 T 細(xì) 胞雜交瘤》，Elsevier, N. Y.第571-681頁(yè)(1981))。簡(jiǎn)而言之，用家族性急性髓系白血病 相關(guān)新基因(FAMLF)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞免疫XenoMOuse 小鼠。免疫后，提取該小鼠的 脾細(xì)胞并將其與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞系融合。任何適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞系均可以用于本發(fā)明。 融合后，所獲雜交瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基上選擇性地維持，然后通過有效稀釋進(jìn)行克隆，參見 Wands等的描述(Gastroenterology 80:225-232(1981))。然后對(duì)通過該選擇獲得的雜交 瘤細(xì)胞進(jìn)行分析以鑒定分泌能夠結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽的 抗體的克隆。本發(fā)明涉及免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽 的完全人類抗體，一般是分離的?；旧鲜牵眉易逍约毙运柘蛋籽∠嚓P(guān)新基因(FAMLF) 表達(dá)細(xì)胞免疫來(lái)自Abgenix，Inc. (Fremont, CA)表達(dá)人抗體的XenMouse小鼠系(免疫操作 方法的詳情)；從具有高滴度抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)抗體的小鼠回 收脾和/或淋巴結(jié)細(xì)胞(含有B細(xì)胞)；并將此回收細(xì)胞與髓樣細(xì)胞系融合以制備永生化 雜交瘤細(xì)胞系。篩選雜交瘤細(xì)胞系以選擇和鑒定產(chǎn)生特異針對(duì)免疫原的抗體的雜交瘤細(xì)胞 系。本發(fā)明包括免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽 或其片段、變體或融合蛋白的抗體(包括含有其抗體片段或變體或由其組成的分子)。家族 性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽包括但不限于的家族性急性髓系白血病相關(guān) 新基因(FAMLF)多肽或的DNA編碼的多肽；家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)可 以通過重組表達(dá)編碼的多肽的核酸來(lái)制備。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)或其片段或變體的抗體包含具有至少一種細(xì)胞系表達(dá)的任意一條重鏈和/或至少一種細(xì)胞系表達(dá)的任意 一條輕鏈的氨基酸序列的多肽。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因 (FAMLF)或其片段或變體的抗體，包含具有至少一種細(xì)胞系表達(dá)的任意一個(gè)重鏈VH域和/ 或至少一種細(xì)胞系表達(dá)的任意一個(gè)輕鏈VL域的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明抗體包含選自 細(xì)胞系的相同細(xì)胞系表達(dá)的VH域和VL域的氨基酸序列。本發(fā)明抗體包含來(lái)自的不同細(xì)胞 系的VH域和VL域的氨基酸序列。包含至少一種細(xì)胞系表達(dá)的VH和/或VL域的抗體片段 或變體的或由它們組成的、免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF) 的分子也包括在本發(fā)明內(nèi)，編碼這些VH和VL域、分子、片段、和/或變體的核酸分子也包括 在內(nèi)。本發(fā)明還提供免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多 肽、或多肽片段或變體的抗體，其中所述抗體包含如下多肽或由其組成，所述多肽具有一種 或多種細(xì)胞系表達(dá)的重鏈中所含的任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)VH CDR的氨基酸序列。尤 其是，本發(fā)明提供免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)并包含如 下多肽或由其組成的抗體，所述多肽具有一種或多種細(xì)胞系表達(dá)的重鏈中所含的VH⑶Rl 的氨基酸序列。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體包含 如下多 肽或由其組成，所述多肽具有一種或多種細(xì)胞系表達(dá)的重鏈所含的VH CDR2的氨基 酸序列。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體包含如下多 肽或由其組成，所述多肽具有一種或多種細(xì)胞系表達(dá)的重鏈所含的VH⑶R3的氨基酸序列。 包含這些抗體或其抗體片段或變體或由它們組成的、免疫特異性結(jié)合家族性急性髓系白血 病相關(guān)新基因(FAMLF)或家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)片段或其變體的分子 也包括在本發(fā)明內(nèi)，同樣編碼這些抗體、分子、片段和/或變體的核酸分子也包括在內(nèi)。本發(fā)明還提供免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多 肽、或多肽片段或變體的抗體，其中所述抗體包含如下多肽或由其組成，所述多肽具有一種 或多種細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈中任意一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、或更多個(gè)VL CDR的氨基酸序列。尤其是， 本發(fā)明提供免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)、并包含如下多 肽或由其組成的抗體，所述多肽具有一種或多種細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈中VL CDRl的氨基酸序 列。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體包含如下多肽或 由其組成，所述多肽具有一種或多種細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈中VL CDR2的氨基酸序列。免疫特 異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的抗體包含如下多肽或由其組成， 所述多肽具有一種或多種細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈所含的VL⑶R3的氨基酸序列。包含這些抗體 或其抗體片段或變體或由它們組成的、免疫特異性結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因 (FAMLF)或家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)片段或變體的分子也包括在本發(fā)明 內(nèi)，同樣編碼這些抗體、分子、片段和/或變體的核酸分子也包括在內(nèi)。本發(fā)明還提供免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多 肽或家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的多肽片段或變體的抗體(包括含有抗體 片段或其變體或由其組成的分子)，其中所述抗體包含一種或多種細(xì)胞系表達(dá)的重鏈或輕 鏈中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)VH⑶R和一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)VL⑶R，或由它們組 成。尤其是，本發(fā)明提供免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多 肽或多肽片段或變體的抗體，其中所述抗體包含一種或多種細(xì)胞系表達(dá)的重鏈或輕鏈中VHCDR 禾口 VL CDR 的 VH CDRl 禾口 VL CDRUVH CDRl 禾口 VL CDR2、VH CDRl 禾口 VL CDR3、VH CDR2 和 VLCDRU VH CDR2 禾口 VL CDR2、VHCDR2 和 VL CDR3、VH CDR3 禾口 VH CDRUVH CDR3 禾口 VL CDR2、 VH⑶R3和VL⑶R3、或它們的任何組合，或所述抗體由它們組成。編碼相應(yīng)于Xenomouse系來(lái)源抗體的抗家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因 (FAMLF)抗體的核酸分子本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明抗體(包括含有其抗體片段或變體或由其組成的分子) 的核酸分子，其一般是分離的。本發(fā)明核酸分子編碼如下抗體(包括含有其抗體片段或變 體或由其組成的分子)，所述抗體包含具有至少一種細(xì)胞系所表達(dá)的重鏈的任一個(gè)VH域的 氨基酸序列的VII域和具有至少一種表2所示細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈的氨基酸的VL域，或由它 們組成。本發(fā)明核酸分子編碼如下抗體(包括含有其抗體片段或變體或由其組成的分子)， 所述抗體包含具有至少一種細(xì)胞系所表達(dá)重鏈的任一個(gè)VH域的氨基酸序列的VH域或具有 至少一種表2所示細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈的氨基酸的VL域，或由它們組成。本發(fā)明還提供包含本文所述抗體分子(例如VH域和/或VL域)的變體(包括衍 生物)或由其組成的抗體，其中該抗體免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基 因(FAMLF)或其片段或變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以用于將突變引入編碼本 發(fā)明分子的核苷酸序列中，包括例如導(dǎo)致氨基酸替代的定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選 地，變體(包括衍生物)編碼少于50個(gè)氨基酸替代、少于40個(gè)氨基酸替代、少于30個(gè)氨基 酸替代、少于25個(gè)氨基酸替代、少于20個(gè)氨基酸替代、少于15個(gè)氨基酸替代、少于10個(gè)氨 基酸替代、少于5個(gè)氨基酸替代、少于4個(gè)氨基酸替代、少于3個(gè)氨基酸替代、或少于2個(gè)氨 基酸替代(相對(duì)于參考 VH 域，即 VH CDRl、VH CDR2、VH CDR3, VL 域，即 VL CDRl、VL CDR2 或VL CDR3而言)?！氨Ｊ匕被崽娲笔侵笇被釟埢娲鸀榫哂袔嗨齐姾傻膫?cè)鏈的 氨基酸殘基。具有帶相似電荷的側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在現(xiàn)有技術(shù)中已有定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬 氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、 酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、甲硫氨酸、色氨酸)、D分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如 酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸.或者，可以沿著全部或部分的編碼序列，例 如通過飽和誘變，隨機(jī)地引入突變，并可以就生物學(xué)活性篩選所獲突變體以鑒定保留活性 (例如結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的能力)的突變體。 免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽或其片段或 變體的本發(fā)明抗體(包括含有其抗體片段或變體或由其組成的分子)，包含如下核苷酸序 列編碼的氨基酸序列或由其組成，所述核苷酸序列可與互補(bǔ)于一種或多種細(xì)胞系表達(dá)的一 種VH或VL域的編碼序列的核苷酸序列雜交，所述雜交的條件是嚴(yán)緊條件，例如與濾膜結(jié) 合的DNA在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45°C下雜交，之后在0. 2XSSC/0. SDS 中于約50-65°C下作一或多次洗滌；高度嚴(yán)緊條件，例如與濾膜結(jié)合的核酸在6XSSC中約 45°C下雜交，之后在0. 1XSSC/0. 2% SDS中于約68°C下作一或多次洗滌；或本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的其它嚴(yán)緊雜交條件(參見例如Ausubel，F(xiàn). M.等編，1989，Current Protocols in MolecularBiology,第 1 卷，Green Publishing Associates, Inc.,禾口 John Wiley&Sons, Inc.，紐約，第6. 3. 1-6. 3. 6和2. 10. 3頁(yè))。編碼這些抗體的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)。
正如本領(lǐng)域熟知的，具有相似氨基酸序列的多肽、或其片段或變體常常具有相似 的結(jié)構(gòu)和許多相同的生物學(xué)活性。因此，免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新 基因(FAMLF)多肽或家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽片段或變體的抗體 (包括含有其抗體片段或變體或由它們組成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VH域或 由其組成，所述氨基酸序列與表2所列至少一種細(xì)胞系所表達(dá)的重鏈的VH域的氨基酸序列 有至少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、 至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的一致性。免疫特異性地結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽或家族性急 性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽的片段或變體的抗體(包括含有其抗體片段或變體 或由它們組成的分子)，包含具有如下氨基酸序列的VL域或由其組成，所述氨基酸序列與 至少一種細(xì)胞系所表達(dá)的輕鏈的VL域的氨基酸序列有至少35%、至少40%、至少45%、至 少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%或至少99%的一致性。編碼抗體的多核苷酸本發(fā)明抗體(包括抗體片段或變體)可以通過本領(lǐng)域任何已知方法制備。例如， 應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)本發(fā)明的抗體可以在非雜交瘤細(xì)胞系的細(xì)胞系中表達(dá)。例如，可以使用編碼 特定抗體的cDNA或基因組克隆的序列轉(zhuǎn)化適當(dāng)哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物宿主細(xì) 胞或制備噬 菌體展示文庫(kù)。此外，本發(fā)明多肽抗體可以通過化學(xué)方法合成或通過使用重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn) 生。制備本發(fā)明抗體的一個(gè)途徑是克隆任何一種或多種雜交瘤細(xì)胞系表達(dá)的VH和/ 或VL域。為了從這些雜交瘤細(xì)胞系分離VH和VL域，可以使用包括VH或VL核苷酸序列的 PCR引物從分離自雜交瘤細(xì)胞系的總RNA中擴(kuò)增表達(dá)的VH和VL序列。然后可以使用載體， 例如具有由5’和3’單個(gè)T核苷酸突出端組成的PCR產(chǎn)物克隆位點(diǎn)的載體(該突變端可以 與用于PCR反應(yīng)的許多DNA聚合酶添加在PCR產(chǎn)物5’和3’末端的單個(gè)腺嘌呤核苷酸突變 端互補(bǔ))，克隆PCR產(chǎn)物。然后可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法對(duì)此VH和VL域測(cè)序?？梢詫⒖寺〉腣H和VL基因置于一種或多種適當(dāng)表達(dá)載體中。作為非限制性例 子，可以使用包括VH或VL核苷酸序列、限制性位點(diǎn)、和保護(hù)限制性位點(diǎn)的側(cè)翼序列的PCR 引物擴(kuò)增該VH或VL域。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的克隆技術(shù)，可以將此PCR擴(kuò)增的VH 域克隆至表達(dá)適當(dāng)免疫球蛋白恒定區(qū)(例如分別地用于VH域的人IgGl或IgG4恒定區(qū)， 和用于κ和XVL域的人κ或λ恒定區(qū))的載體中。優(yōu)選地，表達(dá) 該VH或VL域的載體 包含適合指導(dǎo)該重鏈和輕鏈在所選表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的啟動(dòng)子；分泌信號(hào)；用于免疫球蛋白 可變區(qū)、免疫球蛋白恒定區(qū)的克隆位點(diǎn)；和選擇標(biāo)記如新霉素。還可以將該VH和VL域克 隆至表達(dá)必要恒定區(qū)的單一載體中。然后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(見例如Guo 等，J. Clin. Endoctinol. Metab. 82 :925_31 (1997)，禾口 Ames 等，J. Immunol. Methods 184 177-86 (1995)，將它們完整地并入本文作為參考)，將重鏈轉(zhuǎn)換載體(conversion vector) 和輕鏈轉(zhuǎn)換載體共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞系中以產(chǎn)生表達(dá)全長(zhǎng)抗體如IgG的穩(wěn)定或瞬時(shí)細(xì)胞系。本發(fā)明還提供包含編碼本發(fā)明多肽和其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明還 包括在嚴(yán)緊或較低嚴(yán)緊雜交條件下(例如上文所定義的)與編碼如下抗體的多核苷酸雜交 的多核苷酸，其中優(yōu)選地所述抗體是特異地結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體、優(yōu)選地是結(jié)合具有序列〈二〉的氨基酸序列的多肽或保藏克隆編碼的多肽的抗體。該多核苷酸的獲得和該多核苷酸的核苷酸序列的確定可以通過本領(lǐng)域任何已知 方法實(shí)現(xiàn)。例如，如果抗體的核苷酸序列已知，則可以從化學(xué)合成的寡核苷酸組裝編碼該抗 體的多核苷酸(例如，Kutmeier等，BioTechniques 17 242 (1994)描述的方法)，筒而言 之，這包括合成含有編碼該抗體的序列的部分的重疊寡核苷酸，將這些寡核苷酸退火并連 接，然后通過PCR擴(kuò)增連接的寡核苷酸。或者，可以從適當(dāng)來(lái)源的核酸制備編碼抗體的多核苷酸。如果不能得到含有編碼 特定抗體的核酸的克隆，但該抗體分子的序列是已知的，則編碼免疫球蛋白的核酸可以化 學(xué)合成、或使用可與該序列3’和5’末端雜交的合成引物通過PCR擴(kuò)增從適當(dāng)來(lái)源(例如 從產(chǎn)生自或分離自表達(dá)該抗體的任何組織或細(xì)胞，如經(jīng)選擇表達(dá)本發(fā)明抗體的雜交瘤細(xì)胞 的抗體cDNA文庫(kù)或cDNA文庫(kù)或核酸、優(yōu)選poly A+RNA)獲得，或通過使用特異針對(duì)特定基 因序列的寡核苷酸探針，例如從cDNA文庫(kù)鑒定編碼該抗體的cDNA克隆來(lái)進(jìn)行克隆。然后， 使用本領(lǐng)域任何熟知的方法將通過PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸克隆至可復(fù)制克隆載體中。一旦測(cè)定了該抗體的核苷酸序列和相應(yīng)氨基酸序列，即可以使用本領(lǐng)域用于操 作核苷酸序列的熟知方法，如重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)誘變、PCR等操作該抗體的核苷酸序列 (見例如描述在以下文獻(xiàn)中的技術(shù)=Sambrook等，1990，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning, Alaboratory Manual)第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，NY 禾口 Ausubel 等編，1998，Current Pro 'tocols in MOlecular BiOlOgy, John wiley &sons, NY，兩者均完整地并入本文作為參考)，以制備具有不同氨基酸序列的抗體， 例如產(chǎn)生氨基酸替代、缺失和/或插入。可以通過本領(lǐng)域熟知方法，例如通過與其它重鏈和輕鏈可變區(qū)的已知氨基酸序 列比較以確定序列高變區(qū)，檢查重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列來(lái)鑒定互補(bǔ)決定區(qū) (OTR)的序列。使用常規(guī)重組DNA技術(shù)，可以將一個(gè)或多個(gè)⑶R插入構(gòu)架區(qū)內(nèi)，例如插入人 構(gòu)架區(qū)中以人源化非人抗體，參見以上描述。構(gòu)架區(qū)可以是天然存在的或共有構(gòu)架區(qū)，優(yōu)選 人構(gòu)架區(qū)(參見例如Claothia等，J. Mol. Biol. 278 :457-479 (1998)列出的人構(gòu)架區(qū))。優(yōu) 選通過組合構(gòu)架區(qū)和CDR制備的多核苷酸編碼特異結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體。優(yōu)選地，正如 以上討論的，可以在構(gòu)架區(qū)中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，而且優(yōu)選氨基酸替代提高抗體 與其抗原的結(jié)合。此外，可以使用這些方法造成參與鏈內(nèi)二硫鍵的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)半胱 氨酸殘基的氨基酸替代或缺失，以產(chǎn)生缺失一個(gè)或多個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。對(duì)該多核 苷酸的其它改變也包括在本發(fā)明內(nèi)并屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍。對(duì)于一些應(yīng)用，例如本發(fā)明抗體的體外親和力成熟，可能有用的是將一種或多種 本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈VH和VL域在噬菌體展示文庫(kù)中表達(dá)為單鏈抗體或Fab片段。例 如，可以使用噬菌體展示文庫(kù)，將編碼一種或多種本發(fā)明抗體的VH和VL域的cDNA以所有 可能的組合進(jìn)行表達(dá)，從而允許選擇以優(yōu)選的結(jié)合特征(例如提高的親和性或提高的關(guān)閉 速率)結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽的VH/VL組合。此外，尤其是， VH和VL區(qū)段——本發(fā)明一種或多種抗體的VH和VL域的CDR區(qū)，可以在體外進(jìn)行突變。 具有“突變”的⑶R的VH和VL域在噬菌體展示文庫(kù)中的表達(dá)使得可以選擇出以優(yōu)選的結(jié) 合特征(例如提高的親和性或提高的關(guān)閉速率)結(jié)合家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因 (FAMLF)多肽的VH/VL組合。
在噬菌體展示方法中，功能性抗體域展示在帶有編碼它們的多核苷酸序列的噬菌 體顆粒的表面。具體地，從動(dòng)物cDNA文庫(kù)(例如人或鼠淋巴樣組織的cDNA文庫(kù))或合成 的cDNA文庫(kù)擴(kuò)增編碼VH和VL域的DNA序列。通過PCR經(jīng)scFv接頭將編碼VH和VL域 的DNA連接起來(lái)并將其克隆至噬菌粒載體(例如PCANTAB 6或pComb 3HSS)中。通過電穿 孔使用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并用輔助噬菌體感染該大腸桿菌。用于這些方法的噬菌體典 型地是絲狀噬菌體如fd和M13。該VH和VL域通常與噬菌體基因III或基因VIII重組融 合?？梢允褂每乖鐦?biāo)記的抗原或與固體表面或珠結(jié)合或被其捕獲的抗原，篩選或鑒定 表達(dá)結(jié)合目的抗原(例如家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)多肽或其片段)的抗 原結(jié)合域的噬菌體?？梢杂糜谥苽浔景l(fā)明抗體的噬菌體展示方法的例子包括但不限于公開 在如下文獻(xiàn)中的那些=Brinkman 等，J. Immunol. Methods 182:41-50(1995) ；Ames 等。
可以使用通過將具有適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與具有適當(dāng)生物學(xué) 活性的人抗體分子的基因拼接在一起而開發(fā)用于制備“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等， Proc. Natl. Acad. Sci. 81 851-855 (1984) ；Neuberger 等，Nature 312:604-608(1984)； Takeda等，Nature 314:452-454(1985))。正如以上討論的，嵌合抗體是具有來(lái)源于不同動(dòng) 物物種的不同部分的分子，例如具有來(lái)源于鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些 抗體，如人源化抗體。或者，可以采用描述用于制備單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4，946，778 ；Bird, Science242 423-42 (1988) ；Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)； 和Ward等，Nature 334 =544-54(1989))以制備單鏈抗體。通過將重鏈和輕鏈的Fv區(qū)片段 經(jīng)氨基酸橋連接導(dǎo)致單鏈多肽而形成單鏈抗體。也可以使用在大腸桿茵中組裝功能性Fv 片段的技術(shù)(Skerra 等，Science 242:1038-1041(1988))。提供FAMLF特異性單克隆抗體的制備方法，本發(fā)明抗體可以通過本領(lǐng)域已知用于 合成抗體的任何方法制備，尤其是化學(xué)合成、細(xì)胞內(nèi)免疫(即intrabody技術(shù))、或優(yōu)選地重 組表達(dá)技術(shù)。制備抗體的方法包括但不限于雜交瘤技術(shù)、EBV轉(zhuǎn)化、和本文討論的其它方法 以及重組DNA技術(shù)的使用，本發(fā)明抗體或其片段、衍生物、見如下討論。一旦通過動(dòng)物、化學(xué) 合成、或重組表達(dá)產(chǎn)生了本發(fā)明抗體分子后，可以通過本領(lǐng)域已知用于純化免疫球蛋白的 任何方法對(duì)其進(jìn)行純化，這些方法的例子有層析(例如離子交換、親和、尤其是用于純化蛋 白質(zhì)A之后的特異抗原的親和層析，和大小排阻柱層析)、離心、差異溶解、或任何其它用于 純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。此外，本發(fā)明抗體或其片段可以和本文描述的或本領(lǐng)域已知的異 源多肽序列融合以利于純化。本發(fā)明提供的FAMLF特異性抗體可以用于免疫學(xué)相關(guān)分析、 治療技術(shù)。這些技術(shù)包括但不局限于Western Bloting分析、免疫比濁法、酶聯(lián)免疫吸附 分析(ELISA)、免疫組化、流式細(xì)胞分析術(shù)、激光共聚焦免疫分析，免疫共沉淀分析。本發(fā)明還涉及FAMLF特異性單克隆抗體的變體或類似物(例如本發(fā)明抗體的重鏈 或輕鏈或本發(fā)明單鏈抗體)的重組表達(dá)要求構(gòu)建含有編碼該抗體的多核苷酸的表達(dá)載體。 一旦獲得了編碼本發(fā)明抗體分子或抗體重鏈或輕鏈、或它們的部分(優(yōu)選地含有重鏈或輕 鏈可變區(qū))的多核苷酸后，則可以通過重組DNA技術(shù)使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備用于產(chǎn)生 該抗體分子的載體。因此，本文描述了通過表達(dá)含有編碼抗體的核苷酸序列的多核苷酸制 備蛋白質(zhì)的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可以用于構(gòu)建含有抗體編碼序列和適當(dāng)轉(zhuǎn)錄 和翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、和體內(nèi)遺傳重組。因此，本發(fā)明提供包含與啟動(dòng)子可操作地連接的、編碼本發(fā)明抗體分子、或其重鏈或輕鏈、或重鏈或輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列的可復(fù)制載體。這些載體可以包括編碼抗體分子恒定區(qū)的核苷酸序列，并且可以將抗體的可變區(qū)克隆至該載體中用于表達(dá)完整的重鏈或輕鏈。本發(fā)明包括通過重組方式融合或通過化學(xué)方式綴合(包括共價(jià)和非共價(jià)綴合)了 本發(fā)明多肽(或其部分，優(yōu)選該多肽的至少10、20、30、40、50、60、70或80個(gè)氨基酸)產(chǎn)生 融合蛋白的抗體。該融合不一定是直接的，也可以通過接頭序列進(jìn)行?？贵w可以特異針對(duì) 非本發(fā)明多肽(或其部分，優(yōu)選該多肽的至少10、20、30、40.50、60、70或80個(gè)氨基酸)的 抗原。例如，可以通過將本發(fā)明多肽和特異針對(duì)特定細(xì)胞表面受體的抗體融合或綴合，而使 用該抗體體內(nèi)或體外將本發(fā)明多肽靶向特定細(xì)胞系。本發(fā)明多肽和/或抗體(包括其片段 或變體)可以和異源蛋白(例如免疫球蛋白Fc多肽或人血清白蛋白多肽)的N或C末端 融合。本發(fā)明抗體還可以和白蛋白(包括但不限于重組人血清白蛋白)融合，獲得嵌合多 肽。編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些融合蛋白可以例如有利于純 化并可以增加體內(nèi)半衰期。與本發(fā)明多肽融合或綴合的抗體也可以采用本領(lǐng)域已知的方法 用于體外免疫測(cè)定和純化方法中。本發(fā)明還包括包含與非可變區(qū)的抗體域融合或綴合的本發(fā)明多肽的組合物。例 如，本發(fā)明多肽可以與抗體Fc區(qū)或其部分融合或綴合。與本發(fā)明多肽融合的抗體部分可以 包含恒定區(qū)、鉸鏈區(qū)、CHl域、CH2域和CH3域、或所有域或其部分的任意組合。這些多肽還 可以與上述抗體部分融合或綴合形成多聚體。例如，與本發(fā)明多肽融合的Fc部分可以通過 兩個(gè)Fc部分之間的二硫鍵形成二聚體。更高的多聚體形式可以通過將該多肽與IgA和IgM 的部分融合來(lái)制備。使本發(fā)明多肽與抗體部分融合或綴合的方法是本領(lǐng)域已知的。正如以上所討論的，相應(yīng)于保藏克隆編碼多肽的多肽、多肽片段、或變體的多肽可 以通過使用本領(lǐng)域已知方法和上述抗體部分融合或綴合以增加該多肽的體內(nèi)半衰期或用 于免疫測(cè)定。而且，相應(yīng)于保藏克隆所編碼多肽的多肽可以和上述抗體部分融合或綴合以 利于純化。與具有二硫鍵連接的二體結(jié)構(gòu)(由于IgG)的抗體融合或綴合的本發(fā)明多肽也 可以比單純的單體分泌蛋白或蛋白片段在結(jié)合和中和其它分子方面更有效。在許多情況 下，融合蛋白中的Fc部分在治療和診斷中是有益的，因此可以導(dǎo)致例如提高的藥物動(dòng)力學(xué) 性質(zhì)。或者，在融合蛋白質(zhì)表達(dá)、檢測(cè)和純化后可能期望除去該Fc部分。例如，當(dāng)融合蛋白 用作免疫抗原時(shí)，該Fc部分可能阻礙治療和診斷。在藥物發(fā)現(xiàn)上，例如為了高通量地篩選 分析以鑒定hIL-5的拮抗劑，將人蛋白質(zhì)hIL-5與Fc部分融合。而且，可以將本發(fā)明抗體或其片段與標(biāo)記序列如利于純化的肽融合。該標(biāo)記氨基 酸序列是六組氨酸肽，例如 PQE 載體(QIAGEN, Inc.，9259Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)中提供的該標(biāo)簽，尤其是它們中許多已可商業(yè)購(gòu)買獲得。六組氨酸使得可以方便地 純化融合蛋白。對(duì)于純化有用的其它肽標(biāo)簽包括但不限于“HA”標(biāo)簽，其相應(yīng)于流感血凝素 蛋白的表位(Wilson 等，Cell 37 :767 (1984))，和 “flag” 標(biāo)簽。本發(fā)明還包括域診斷或治療劑綴合的抗體或其片段。這些抗體可以在診斷上用 于例如監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生或進(jìn)展而作為臨床測(cè)試程序的一部分，例如以確定給定治療法的效 率。可以通過將該抗體與可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)有利檢測(cè)?？蓹z測(cè)物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、 熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射活性物質(zhì)、使用多種正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)的正電子發(fā)射金屬、和非放射活性順磁金屬離子?？蓹z測(cè)物質(zhì)可以直接地與抗體(或其片段) 或間接地通過中間體(例如本領(lǐng)域已知的接頭)使用本領(lǐng)域技術(shù)與抗體偶聯(lián)或綴合。適當(dāng) 的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、D半乳糖苷酶、或乙酰膽堿酯酶；適當(dāng)?shù)妮o 基復(fù)合物的例子包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；適當(dāng)熒光物質(zhì)的例子包括傘 形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺酰氯或藻紅素；發(fā)光物 質(zhì)的例子包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括螢光素酶、螢光素、水母發(fā)光蛋白；適當(dāng)?shù)?放射活性物質(zhì)的例子包括碘、碳(14C)、硫等。本發(fā)明家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)和/或家族性急性髓系白血 病相關(guān)新基因(FAMLF) SV多肽與對(duì)于使多肽偶聯(lián)放射金屬離子(包括但不限于111Iru177Liu 9°Y、153Sm、166Ho)有用的大環(huán)螯合劑連接。該大環(huán)螯合劑是1，4，7，10_四氮雜環(huán)十二烷-N， N，，N”，N，” -四乙酸(DOTA)。DOTA與本發(fā)明FAMLF和/或FAMLF SV多肽通過接頭分子 連接。用于將DOTA和多肽偶聯(lián)的接頭分子的例子是本領(lǐng)域通常已知的。此外，美國(guó)專利 5，652，361和5，756，065公開了可以和抗體綴合的螯合劑和它們的制備和使用方法，特此 將它們完整地并入作為參考。盡管美國(guó)專利5，652，361和5，756，065集中于使螯合劑與抗 體綴合，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地改動(dòng)其中所公開的方法使螯合劑與其它多肽綴合。本發(fā)明抗體綴合物可以用于修飾指定的生物學(xué)反應(yīng)，治療劑或藥物部分不應(yīng)理解 為限制于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有期望生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。 這些蛋白質(zhì)包括例如毒素如相思豆毒蛋白、篦麻毒素Α、假單胞茵外毒素或白喉毒素；蛋白 質(zhì)例如腫瘤壞死因子、α干擾素、β干擾素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、組織纖 溶酶原激活物、細(xì)胞凋亡劑如 TNF-q、TNF-β、ΑΙΜ I, AIM II、Fas 配體，VEGI、thromobotic 劑或抗血管生成劑如制管張素或endostatin ；或生物反應(yīng)修飾劑例如淋巴因子、白介素 1( “IL-I”)、白介素2( “IL-2”)、白介素6( “ IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)、或其它生長(zhǎng)因子。還可以使抗體與固體支持物連接，這對(duì)于免疫測(cè)定或純化靶抗原尤其有用。該固 體支持物包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚丙乙烯、聚乙烯氯或聚丙烯。 將這些治療部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是熟知的，見例如Arnon等，“癌癥治療中用 于藥物的免疫打靶的單克隆抗體”，《單克隆抗體和癌癥治療》(Monoclonal Antiboides andCancer Therapy), Reisfeld 等(編)，pp243_56 (Alan R. Liss, Inc. 1985) ；Hellstrom 等，“用于藥物遞送的抗體”，《受控的藥物遞送》(Controlled Drug Delivery)(第2版)， Robinson 等(編)pp623_53 (Marcel Dekker, Inc. 1987) ；Thorpe，“癌癥治療中細(xì)胞毒性劑 的抗體載體綜述”，《單克隆抗體，84 生物學(xué)和臨床應(yīng)用》(MonoclonalAntibodies，84 Biological and Clinical Applications), Pinchera 等(編)，ρρ 475-506 (1985)“癌 癥治療中放射標(biāo)記抗體治療用途的分析、結(jié)果、和前景”，《用于癌癥檢測(cè)和治療的單克隆抗 體》(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection andTherapy)，Baldwin 等(編)， PP 303-16 (Academic Press 1985)，和Thorpe等，“抗體-毒素綴合物的削備和細(xì)胞毒性”， Immunol. Rev. 62 119—58(1982)。或者，可以將抗體與二抗綴合形成抗體雜綴合物(heteroconjugate)，參見Segal 的美國(guó)專利4，676，980，其完整地并入作為參考。與治療部分偶聯(lián)或未偶聯(lián)的抗體用作治療劑時(shí)可以單獨(dú)使用或聯(lián)合細(xì)胞毒性因子和/或細(xì)胞因子一起使用。本發(fā)明抗體可以用于對(duì)細(xì)胞系和生物樣品進(jìn)行免疫表型分型。本發(fā)明基因的翻譯 產(chǎn)物可以用作細(xì)胞特異標(biāo)記，或更具體地用作差異表達(dá)在特定細(xì)胞類型發(fā)育和/或成熟不 同階段時(shí)的細(xì)胞標(biāo)記。指向特定表位、或表住的組合的單克隆抗體將允許篩選表達(dá)該標(biāo)記 的細(xì)胞群。在使用單克隆抗體篩選表達(dá)該標(biāo)記的細(xì)胞群時(shí)，多種技術(shù)可以使用，包括使用抗 體包被的磁珠進(jìn)行的磁性分離、使用與固體基質(zhì)(即板)附著的抗體進(jìn)行的“淘選”、和流式 細(xì)胞技術(shù)(見例如美國(guó)專利 5，985，660 ；和 Morrison 等，Cell，96 :737_49 (1999))。 這些技術(shù)使得可以選擇特定細(xì)胞群體，例如可以在血液惡性腫瘤(例如急性白血 病患者的最小殘余疾病(minimal residual disease) (MRD))中發(fā)現(xiàn)的那些，和移植物中的 “非自體”細(xì)胞以防止移植物抗宿主疾病(GVHD)?；蛘?，這些技術(shù)允許篩選能夠經(jīng)歷增殖和 /或分化的造血干細(xì)胞和祖先細(xì)胞，例如可以在人臍帶血中找到的那些。本發(fā)明抗體可以通過本領(lǐng)域任何已知方法分析其免疫特異性的結(jié)合?？梢允褂玫?免疫測(cè)定法包括但不限于使用如下技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性分析系統(tǒng)，所述技術(shù)的例子有 BIAcore分析、FACS(熒光激活細(xì)胞分揀術(shù))分析、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)法、western印 跡、放射免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、“夾心”免疫測(cè)定法、免疫沉淀法、沉淀素反 應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散分析、凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫放射分析、熒光免 疫測(cè)定、蛋白質(zhì)A免疫測(cè)定，但這僅是舉出的幾個(gè)例子。這些測(cè)定是常規(guī)的并是本領(lǐng)域熟知 的(見例如 Ausubel 等編 1994，Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1，John ffiley&Sons, Inc.，紐約，其完整地并入本文作為參考)。示例性免疫測(cè)定法簡(jiǎn)要地描述如 下(但并不旨在構(gòu)成限制)。免疫沉淀操作方法一般包括在補(bǔ)加蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如， EDTA，PMSF，抑酶肽、釩酸鈉)的裂解緩沖液如RIPA緩沖液(1 % NP-40或Triton X-100,1% 脫氧膽酸鈉，0. 1%SDS,0. 15M NaCl，0. OlM磷酸鈉(pH 7. 2), 1 % Trasylol)中裂解細(xì)胞群， 向細(xì)胞裂解物加入目的抗體，于4°C孵育一段時(shí)間(例如1-4小時(shí))，向細(xì)胞裂解物加入蛋 白A和/或蛋白G Sepharose珠，4°C孵育約1小時(shí)或更長(zhǎng)，在裂解緩沖液中洗滌這些珠，并 將這些珠重現(xiàn)懸浮在SDS/樣品緩沖液中。目的抗體免疫沉淀特定抗原的能力可以通過例 如Western印跡分析評(píng)價(jià)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)指導(dǎo)可以經(jīng)修飾增加抗體與抗原的結(jié)合并降 低背景的參數(shù)(例如用wpharose珠預(yù)先清潔細(xì)胞裂解物)。對(duì)于免疫沉淀操作方法的進(jìn) 一步討論,參見例如 Ausubel 等，1994，Current Protocols in Molecular Biology, VOl. 1, Johnffiley&Sons, Inc.，紐約，10. 16. 1。Western印跡分析一般包括制備蛋白樣品，在聚丙烯酰胺凝膠(例如根據(jù)抗原的 分子量的8% -20% SDS-PAGE)上電泳此蛋白樣品，將蛋白樣品從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移至 膜如硝酸纖維素、PVDF或尼龍膜上，在封閉緩沖液(例如具有3% BSA或脫脂奶的PBS)中封 閉膜，在洗滌緩沖液(例如PBS-Tween 20)中洗滌膜，使用稀釋在封閉緩沖液中的一抗(目 的抗體)封閉膜，在洗滌緩沖液中洗滌膜，使用與酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸 酶)或放射活性分子(例如32P或125I)綴合的二抗(識(shí)別一抗的抗體，如抗人抗體)封閉 膜，在洗滌緩沖液中洗滌膜，并檢測(cè)抗原的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員將指導(dǎo)可以改變以增加檢 測(cè)信號(hào)并降低背景噪音的參數(shù)。對(duì)于western印跡操作方法的進(jìn)一步討論，見例如Ausubel 等(編)1994,Current Protocols in Mulecular Biology,VOl. !,John Wiley&Sons,Inc.,紐約，10. 8. 1。ELISA包括制備抗原，用該抗原包被96孔微量滴定板的孔，孔中加入與可檢測(cè)化 合物如酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)綴合的目的抗體并孵育一段時(shí)間，檢 測(cè)抗原的存在。在ELISA中，目的抗體不必與可檢測(cè)化合物綴合；相反，可以向孔中加入與 可檢測(cè)化合物偶聯(lián)的二抗(識(shí)別目的抗體)。而且，替代用抗原包被孔，可以用抗體包被孔。 在此情況下，可以在向包被孔中加入目的抗原后加入與可檢測(cè)化合物綴合的二抗。本領(lǐng)域 技術(shù)人員將指導(dǎo)可以改變以增加檢測(cè)信號(hào)的參數(shù)以及本領(lǐng)域已知的ELISA的其它變體。對(duì) 于 ELISA 的進(jìn)一步討論，參見 Ausubel 等(編)1"4，Current Protocols in Molecular Biology, VOl. 1，Jolln ffiley&Sons, Inc.，紐約，11. 2. 1?？贵w與抗原的結(jié)合親和性和抗體-抗原相互作用的關(guān)閉速率可以通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié) 合分析測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析的一個(gè)例子是放射免疫測(cè)定，其包括在存在增加量的未標(biāo)記 抗原下使標(biāo)記抗原(例如3H或125I)和目的抗體孵育，并檢測(cè)與標(biāo)記抗原結(jié)合的抗體。目的 抗體對(duì)家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)的親和性以及結(jié)合關(guān)閉速率可以從斯 卡查德作圖分析的數(shù)據(jù)確定。也可以使用放射免疫測(cè)定確定與二抗的競(jìng)爭(zhēng)。在此情況下， 將家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)與偶聯(lián)了標(biāo)記化合物(例如3H或125I標(biāo)記的 化合物)的目的抗體在增加量的未標(biāo)記二抗存在下孵育。兩種抗體間的此類競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定也 可以用于確定兩種抗體是結(jié)合相同還是不同表位。BIAcore動(dòng)力學(xué)分析被用于確定抗體(包括抗體片段或其變體)與家族性急性髓 系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)或家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因(FAMLF)片段的結(jié)合開 啟和關(guān)閉速率。BIAcore動(dòng)力學(xué)分析包括分析抗體與表面固定了家族性急性髓系白血病相 關(guān)新基因(FAMLF)的芯片結(jié)合和解離。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明FAMLF基因全長(zhǎng)cDNA序列、完整開放讀碼框的發(fā)現(xiàn)， FAMLF基因全長(zhǎng)cDNA的克隆、FAMLF基因差異表達(dá)分析引物及FAMLF蛋白特異性抗體的發(fā) 明，所有這些工作為今后白血病特異性基因診斷抗體、蛋白芯片、基因芯片、基因藥物的研 發(fā)奠定基礎(chǔ)。該項(xiàng)目研究對(duì)于開發(fā)研制抗白血病新藥，提高白血病診斷準(zhǔn)確率與治療效果， 提高福建省白血病的治愈率有重要的作用，有潛在重大的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明有助于 深入闡述白血病發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，為白血病及其他惡性腫瘤的基因診斷和基因 治療奠定基礎(chǔ)。本研究具有如下優(yōu)點(diǎn)1、新穎性目前國(guó)內(nèi)外尚未見發(fā)病率這么高、規(guī)模這么大的急性髓系白血病家系 (見圖20)的報(bào)道，國(guó)內(nèi)尚未見家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因克隆的報(bào)告。2、創(chuàng)造性克隆出家族性急性髓系白血病相關(guān)新基因的cDNA全長(zhǎng)，成功預(yù)測(cè)出該 新基因的開放讀碼框，發(fā)明出該基因差異表達(dá)引物，發(fā)明出針對(duì)該新基因的特異性單克隆 性抗體，并通過Western Bloting驗(yàn)證該基因表達(dá)所用的開放讀碼框與預(yù)測(cè)的開放讀碼框 是一致的，應(yīng)用一步法RT-PCR和Western Bloting發(fā)現(xiàn)該基因在白血病患者中高表達(dá)在正 常人中低表達(dá)。3、實(shí)用性在克隆出該新基因全長(zhǎng)cDNA序列、確定好開放讀碼框并發(fā)明出該基因 差異表達(dá)分析引物、蛋白質(zhì)特異性抗體的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步設(shè)計(jì)出急性髓系白血病基因治療的靶位點(diǎn)，研制出包含該基因的基因診斷試劑盒、基因芯片、蛋白芯片，并推廣該基因 所表達(dá)的蛋白質(zhì)特異性抗體在臨床上的應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明FAMLF基因的cDNA序列表圖。圖2為本發(fā)明FAMLF基因FAMLF的編碼蛋白序列表圖。 圖3為本發(fā)明EST zywB-87 (GenBank注冊(cè)號(hào)CV973101) PCR檢測(cè)電泳圖。IEST zywB-87PCR檢測(cè)結(jié)果2陰性對(duì)照可見在500_750bp之間有一清晰單一條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶圖4為本發(fā)明的第一輪5' RACE PCR電泳圖。M DNAMarker 20001 第一輪 5' RACE PCR 2 陰性對(duì)照?qǐng)D5為本發(fā)明的第二輪巢式5' RACE PCR電泳圖。M DNAMarker 20001 第二輪巢式 5' RACE PCR 2 陰性對(duì)照?qǐng)D6為本發(fā)明的3 ‘ RACE PCR電泳圖。M DNA Marker 6000 1 3' RACE PCR 2 陰性對(duì)照?qǐng)D7為本發(fā)明ORF分析網(wǎng)絡(luò)界面圖。圖8為本發(fā)明NCBI/Blastn檢索圖。圖9為本發(fā)明FAMLF新基因電子染色體定位圖。圖10為本發(fā)明蛋白質(zhì)疏水性輪廓圖。圖11為本發(fā)明的蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一圖。圖12為本發(fā)明的蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果二圖。圖13為本發(fā)明的FAMLF基因在部分急性髓系白血病病人及正常人之間的表達(dá)電 泳圖。IDNA maker (DL2000) 2家系中急性髓系白血病患者3_5家系外急性髓系白血病病 人6-7家系中正常對(duì)照8-9家系外正常對(duì)照內(nèi)參片斷為251bp，目的片斷為175bp，結(jié)果顯示FAMLF基因在患者中的表達(dá)明顯 高于正常人圖14為本發(fā)明的FAMLF在U937、Raj及Ca46細(xì)胞株的表達(dá)電泳圖。M DNA Marker DL 20001U937 細(xì)胞株 2Raj 細(xì)胞株 3Ca46 細(xì)胞株4Shi_l 細(xì)胞株內(nèi)參片斷為251bp目的片斷為522bp結(jié)果顯示FAMLF在上述細(xì)胞株中均有較高 表達(dá)圖15為本發(fā)明的FAMLF在急性單核細(xì)胞白血病、黑色素瘤、肝癌、Hela細(xì)胞株的 表達(dá)電泳圖。M DNA Marker DL 20001 陽(yáng)性對(duì)照(患者 OneSt印 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果)2急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株3黑色素瘤細(xì)胞株4肝癌細(xì)胞株5Hela細(xì)胞株內(nèi)參片斷為251bp 目的片斷為522bp結(jié)果顯示FAMLF在急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株中表達(dá)，在黑色素、肝癌細(xì)胞株中 不表達(dá)
圖16為本發(fā)明的Western Bloting驗(yàn)證所制備的針對(duì)FAMLF的單克隆抗體圖。1是33-1-3R3 (PA)這個(gè)抗體，稀釋250倍2是33_1_3R3 X (PA)這個(gè)抗體，稀釋比 為50其中GAPDH抗體和Actin抗體作為陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D17為Western Bloting分析FAMLF在白血病NB4、U937、K562、骨髓瘤細(xì)胞系 U266、CEM、白血病H160細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞株CA46、Jurkat細(xì)胞株中的表達(dá)圖。圖18為Western Bloting分析FAMLF在白血病病人中的表達(dá)圖(5為陽(yáng)性對(duì)照， 1、2、3、4、6為臨床白血病病人)圖19為本發(fā)明的Western Bloting分析FAMLF在正常人中的表達(dá)圖。(1為陽(yáng)性 對(duì)照，2、3、4、5、6為正常人)圖20為本發(fā)明的福建省急性髓系白血病高發(fā)家系系譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例 中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件如sanlbrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè) (NewYork coId Spring Harbor Laboratory Pres s，1989)中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。實(shí)施例1 通過sMART-RACE技術(shù)克隆出FAMLF基因全長(zhǎng)序列1)EST zywB-87 (GenBank 注冊(cè)號(hào)CV973101)序列校對(duì)1. 1)將EST zywB-87與基因組比對(duì)聯(lián)網(wǎng) http//genome, ucsc. edu/cgi-bin/hgBlat ？ command = start 將 EST zywB-87與人類基因組序列進(jìn)行比對(duì)，得到如下結(jié)果Alignment of YourSeq and chrl 197136247-197173157Click on links in the frame to the left to navigate through the alignment. Matching bases in cDNA and genomic sequences are colored blue and capitalized.Light blue bases mark the boundaries of gaps in either sequence (often splicesites).cDNA YourSeqacgcggggAC AGGAGCAAGG GATGTCTGAG CACAAGTGGC TGAGTTCCGA 50GTGACTTTAT GAAGCACTTT CTACCTTCCT CTCCGGCATG AAAACAGGGA 100TTCTGCACCT GCATCATGGA CAGTCTGGCA AAAGCCTCTG CTCTGCCTCC 150GGGGACAAGA AACTAGAGCA AATAACCGcT TTGAAATTAG ATCCTGGCgA 200AATTACCcAC AATCAATGgt ggaaactgaa aggagaaTGA TTTAAATCTT 250CAATGACAGT TGT目的序列位于1號(hào)染色體197136247-197173157區(qū)段，其中大寫字母序列代表與
基因組正確匹配，小寫字母序列代表與基因組錯(cuò)配 1.2)根據(jù)基因組比對(duì)結(jié)果采用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 6. O設(shè)計(jì)校對(duì)上游引物F39， 校對(duì)下游引物R591 上游引物F39 5，AGTGGCACCAAGATGCTTA 3，，
下游引物R591 5，CCCTATGGATTGTTGAACTGG 3，，1. 3)用TaKaRa公司的PrimeSTAR HS DNA Polymerase試劑，具體操作按照該公 司的protocol進(jìn)行EST zywB-87的PCR檢測(cè)，并取5mlPCR產(chǎn)物，2%瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果 (結(jié)果見圖3的zywB-87基因的電泳圖)，可見在500_750bp之間有一清晰單一條帶，陰性 對(duì)照無(wú)條帶，其余45ul送Invitrogen公司直接測(cè)序。1.4) EST zywB_87PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)Invitrogen公司直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下1 CGAAGCGTCT CATGGAAGCC AGTCTCCTCT AATGTGTATT TTGGTGCCCT GTCTGCTGGT61 TCGCCTAAGT GATGTGGCAT ACATTTGATG AAAGGACAGT AAATGACATC AATTATAAAA121GACATCTACT AATGAGAGGA AGAAGAGGAA GAGAGAGAAA TTGAAAAAAA GAATAAGAAA181TTCTCTGAAA TGGAAACAGC AAAGCACTTT GATTGAACTA AAAGAAATGA CGTACCTTAA241TCATGCCCTA ATTTTAGGGT ACCACCAACC AAGCTACTCA CTCTTCTTTG GAAAGATGAC301GTGTTTCTTC AACTTCTGTA CAACTGTCAT TGAAGATTTA AATCAATCTC CCTTCAGTTT361CCATCATTGA TTGTTGGTAA TTTTGCCAGG ATCTCTGTAC AAAACAAAAC AAAAAGATAT421TATGTGAAAC TCAGGCCATG CTGAGCAAAT TAGCTGAAAT TTATTTTTAT CCTCTTATGG481GGATGTTTTC CAGTTCAACA ATCCATAGGG A1. 5)序列 EST zywB-87 校正結(jié)果將以上測(cè)序結(jié)果與基因組序列及EST zywB-87原始序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)EST zywB-87 原始序列測(cè)序有部分錯(cuò)誤，正確的序列如下1 ACAGGAGCAA GGGATGTCTG AGCACAAGTG GCTGAGTTCC GAGTGACTTT ATGAAGCACT61 TTCTACCTTC CTCTCCGGCA TGAAAACAGG GATTCTGCAC CTGCATCATG GACAGTCTGG121CAAAAGCCTC TGCTCTGCCT CCGGGGACAA GAAACTAGAG CAAATAACCG TTTTGAAATT181AGATCCTGGC AAAATTACCA ACAATCAATG ATGGAAACTG AAGGGAGATT GATTTAAATC241TTCAATGACA GTTGT2)利用Clontech的5 ‘端RACE試劑盒作FAMLF基因的5 ‘端RACE，并使用引物 設(shè)計(jì)軟件Olig0 6. O根據(jù)校正好的EST zywB-87序列設(shè)計(jì)5，RACE引物。2. 1)5' RACE 引物GSPl 5' AATCAATCTCCCTTCAGTTTCCATC 3’NGSP 1 :5，TCTCCCTTCAGTTTCCATCA 3，2.2)5' RACE PCR 電泳結(jié)果見圖 4、圖 52. 3)巢式5' RACE PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果巢式5' RACE PCR產(chǎn)物經(jīng)Invitrogen公司直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下1TTTCAAACGG TTATTTGCTC TAGTTTCTTG TCCCCGGAGG CAGAGCAGAG GCTTTTGCCA.........................................................................181 AGCTGTACTA TCTGCAGTTC TCCCCGCGTA CTCTGCGTTG ATACCACTGC TTGCCCTATA241 GTGAGTCGTA TTAGA3)利用Clontech的3 ‘端RACE試劑盒作FAMLF基因的3 ‘端RACE，并使用引物設(shè)計(jì)軟件Olig0 6. 0根據(jù)校正好的EST zywB-87序列設(shè)計(jì)3，RACE引物。3. 1)3' RACE 引物GSP2 :5，AAGCACTTTCTACCTTCCTCTC 3，3.2)3' RACE PCR 電泳結(jié)果見圖 63. 3)3' RACE PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果3' RACE PCR產(chǎn)物較長(zhǎng)，一個(gè)反應(yīng)不能測(cè)通，經(jīng)過4次連續(xù)Warlking測(cè)序，得到其 全長(zhǎng)序列如下1 ATGCATCATG GAAGTCTGGT AAAAGCCTCT GCTCTGCCTC CGGGGACAAG AAACTA GAGC61 AAATAACCGT TTTGAAATTA GATCCTGGCA AAATTACCAA CAATCAATGA TGGAAACTGA.......................................................................601 TAACCAAACA ACATACCTAT GAAAATAGAT CAGTAAGGCT TTGAGAAACA TTCTTAAGTA661 AAATCTGTAA AGCATCTTTG CATTTTTTTT CAAGAAAGAC CTCCAGGTAA ATGATGGCTT.......................................................................2041GTTCTGTAGT TTTAACCAGA ACAAAGGGAT TACCCAGAAG AAAAGAAGGT AAGCTATTTC2101ATCAGTTTTG GTGGAAATCA GAAGTTTTTT TTTCTATTAT TAGCTTTGTA TTCTTAAAAA2161AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA
4) cDNA全長(zhǎng)序列拼接結(jié)果根據(jù)校正的EST序列，5，-RACE序列，3，-RACE序列，采用DNAMAN軟件進(jìn)行cDNA 全長(zhǎng)序列拼接，拼接的cDNA序列全長(zhǎng)如下1 AGAACTGCAG ATAGTACAGC TTCCACAGGA GCAAGGGATG TCTGAGCACA AGTGGCTGAG61 TTCCGAGTGA CTTTATGAAG CACTTTCTAC CTTCCTCTCC GGCATGAAAA CAGGGATTCT121 GCACCTGCAT CATGGACAGT CTGGCAAAAG CCTCTGCTCT GCCTCCGGGG ACAAGAAACT......................................................................1201GGGAAGAAGA CACTTCTGCG TCTGACAGTG AATCAGGCTC CCAGTTTTGA AGATGTGCTG1261TAGGTAGTTC TCGCTGAATC CATTTCCCAG TTGGTTTCTA TTCCCCGCCC CATTCCTGTG......................................................................2161TCACAGTTCT GTAGTTTTAA CCAGAACAAA GGGATTACCC AGAAGAAAAG AAGGTAAGCT2221ATTTCATCAG TTTTGGTGGA AATCAGAAGT TTTTTTTTCT ATTATTAGCT TTGTATTCTT2281AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA5) FAMLF新基因注冊(cè)結(jié)果新基因經(jīng)過申請(qǐng)，通過美國(guó)國(guó)家生物信息學(xué)中心GenBank的工作人員審核， 獲得核酸注冊(cè)號(hào)EF413001，蛋白質(zhì)注冊(cè)號(hào)ABN58747，被正式命名為Homo sapiens familialacute myelogenous leukemia related factor(簡(jiǎn)禾爾 FAMLF)。實(shí)施例2 =FAMLF的生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測(cè)1)全長(zhǎng)cDNA分析結(jié)果應(yīng)用 NCBI/ORF Finder 程序(http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/Rorf/Rorf. html) 分析其ORF編碼框，結(jié)果見圖7。序列表代號(hào)為SEQ ID NO :1，F(xiàn)AMLF的cDNA的序列如下1 AGAACTGCAG ATAGTACAGC TTCCACAGGA GCAAGGGATG TCTGAGCACA AGTGGCTGAG 6061 TTCCGAGTGA CTTTATGAAG CACTTTCTAC CTTCCTCTCC GGCATGAAAA CAGGGATTCT 120
20mg，經(jīng)檢測(cè)其純度 92%，達(dá)到本實(shí)驗(yàn)的要求。2)將該多肽連接上匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)與牛血清白蛋白(BSA)，兩個(gè)標(biāo)志分別用 于后續(xù)抗體的免疫純化與ELISA監(jiān)測(cè)。
3)將上述KLH、BSA連接多肽分別免疫兩只紐西蘭白兔。4)將上述標(biāo)記多肽免疫紐西蘭白兔，并通過ELISA監(jiān)測(cè)抗血清的進(jìn)展直到其滴度 大于10，000時(shí)，把紐西蘭白兔的血液全部放出來(lái)用于抗體A的提取。5)通過親和提純法提取血清中的抗體A，得到濃度為1. 3mg/ml的抗體A 7ml。6)通過Western Bloting驗(yàn)證所提取的抗體A (結(jié)果見圖16)，圖16得出結(jié)論 1、33-1-3R3(PA)，針對(duì)該基因編碼的蛋白質(zhì)的第4到第16個(gè)氨基酸殘基所對(duì)應(yīng)的多肽片 段-CALWVSGIFVDEVI-NH2)，這個(gè)抗體，稀釋250倍；2、33_1_3R3X (PA)這個(gè)抗體，稀釋比為 50，其中GAPDH抗體和Actin抗體作為陽(yáng)性對(duì)照，Western Bloting的具體步驟見《分子克 隆》，結(jié)果顯示成功制備出針對(duì)FAMLF的抗體；3、首次證實(shí)FAMLF為編碼約8kD蛋白質(zhì)的人 類新基因。實(shí)施例4-2 人基因FAMLF特異性單克隆性抗體B的研制1)根據(jù)基因FAMLF的序列應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)并合成免疫表位多肽[此多肽位于該基 因編碼的蛋白質(zhì)的第17到第29個(gè)氨基酸殘基(CGMNFDRSRITNK-NH2)]20mg，經(jīng)檢測(cè)其純度 84%，達(dá)到本實(shí)驗(yàn)的要求。2)將該多肽連接上匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)與牛血清白蛋白(BSA)，兩個(gè)標(biāo)志分別用 于后續(xù)抗體的免疫純化與ELISA監(jiān)測(cè)。3)將上述KLH、BSA連接多肽分別免疫兩只紐西蘭白兔。4)將上述標(biāo)記多肽免疫紐西蘭白兔，并通過ELISA監(jiān)測(cè)抗血清的進(jìn)展直到其滴度 大于10，000時(shí)，把紐西蘭白兔的血液全部放出來(lái)用于抗體B的提取。5)通過親和提純法提取血清中的抗體B，得到濃度為0. lmg/ml的抗體B 4ml。6)同樣通過Western Bloting驗(yàn)證所提取的抗體B，結(jié)果顯示成功制備出針對(duì) FAMLF的抗體B。實(shí)施例4-3 人基因FAMLF特異性單克隆性抗體C的研制1)根據(jù)基因FAMLF的序列應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)并合成免疫表位多肽[此多肽位于該基因 編碼的蛋白質(zhì)的第61到第77個(gè)氨基酸殘基(C-RINRISELVESIETVYT-NH2)]20mg，經(jīng)檢測(cè)其 純度算83%，達(dá)到本實(shí)驗(yàn)的要求。2)將該多肽連接上匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)與牛血清白蛋白(BSA)，兩個(gè)標(biāo)志分別用 于后續(xù)抗體的免疫純化與ELISA監(jiān)測(cè)。3)將上述KLH、BSA連接多肽分別免疫兩只紐西蘭白兔。4)將上述標(biāo)記多肽免疫紐西蘭白兔，并通過ELISA監(jiān)測(cè)抗血清的進(jìn)展直到其滴度 大于10，000時(shí)，把紐西蘭白兔的血液全部放出來(lái)用于抗體C的提取。5)通過親和提純法提取血清中的抗體C，得到濃度為1. 7mg/ml的抗體C 7ml。6)同樣通過Western Bloting驗(yàn)證所提取的抗體C，結(jié)果顯示成功制備出針對(duì) FAMLF的抗體C。實(shí)施例5 人基因FAMLF特異性單克隆性抗體的應(yīng)用通過Western Blot在蛋白質(zhì)水平對(duì)人FAMLF基因的在細(xì)胞株、臨床白血病患者和 正常人中的表達(dá)進(jìn)行定量分析(結(jié)果見圖17、圖18、圖19)，得出結(jié)論1、抗體A，針對(duì)該基 因編碼的蛋白質(zhì)的第2到第16個(gè)氨基酸殘基所對(duì)應(yīng)的多肽片段(CALWVSGIFVDEVI-NH2)， 這個(gè)抗體用于通過Western Bloting檢測(cè)新基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)FAMLF ；2、通過WesternBloting技術(shù)發(fā)現(xiàn)結(jié)果顯示FAMLF新基因編碼的蛋白質(zhì)在諸多與白血病相關(guān)的細(xì) 胞株中高表達(dá)，在部分臨床白血病患者中高表達(dá)，在正常人中不表達(dá)，F(xiàn)AMLF是與人類白血 病相關(guān)的新基因；本發(fā)明通過通用技術(shù)制備了 FAMLF基因作為惡性腫瘤檢測(cè)的含有人類新 基因FAMLF的試劑盒，試劑盒采用通用方法檢測(cè)，結(jié)果表明在含有U937細(xì)胞株、Raj細(xì)胞株、 Ca46細(xì)胞株、Shi-1細(xì)胞株中均有較高表達(dá)，在白血病NB4、U937、K562、骨髓瘤細(xì)胞系U266、 白血病H160細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞株CA46中有較高表達(dá)，能檢測(cè)到含有急性單核細(xì)胞的白血病 細(xì)胞株和CA46。人類新基因所編碼的多肽和多核苷酸能在制備抗白血病細(xì)胞藥物中的應(yīng) 用。 通過大量試驗(yàn)，獲得如圖20所示的福建省急性髓系白血病高發(fā)家系系譜圖。
權(quán)利要求
一個(gè)人類新基因FAMLF的cDNA核苷酸序列為序列<一>序列表代號(hào)為SEQ ID NO1，F(xiàn)AMLF的cDNA的序列1 AGAACTGCAG ATAGTACAGC TTCCACAGGA GCAAGGGATG TCTGAGCACA AGTGGCTGAG 6061TTCCGAGTGA CTTTATGAAG CACTTTCTAC CTTCCTCTCC GGCATGAAAA CAGGGATTCT120121 GCACCTGCAT CATGGACAGT CTGGCAAAAG CCTCTGCTCT GCCTCCGGGG ACAAGAAACT180181 AGAGCAAATA ACCGTTTTGA AATTAGATCC TGGCAAAATT ACCAACAATC AATGATGGAA240241 ACTGAAGGGA GATTGATTTA AATCTTCAAT GACAGTTGTA CAGAAGTTGA AGAAACACGT300301 CATCTTTCCA AAGAAGAGTG AGTAGCTTGG TTGGTGGTAC CCTAAAATTA GGGCATGATT360361 AAGGTACGTC ATTTCTTTTA GTTCAATCGA AGTGCTTTGC TGTTTCCATT TCAGAGAATT420421 TCTTATTCTT TTTTTCAATT TCTCTCTCTT CCTCTTCTTC CTCTCATTAG TAGATGTCTT480481 TTATAATTGA TGTCATTTAC TGTCCTTTCA TCAAATGTAT GCCACATCAC TTAGGCGAAC540541 CAGCAGACAG GGCACCAAAA TACACATTAG AGGAGACTGG CTTCCATGAG ACGCTTCGAC600601 TGTCTCATCG GGGCACTTGT AATAAGCATC TTGGTGCCAC TGAATGCAAT GCTGTATTCA660661 AATAATAGCT TTCATCTTCA CTCTTTTTAA ATATAAAAGT AAACCTTGAA GCCCTTTGAA720721 GGACCTAACC AAACAACATA CCTATGAAAA TAGATCAGTA AGGCTTTGAG AAACATTCTT780781 AAGTAAAATC TGTAAAGCAT CTTTGCATTT TTTTTCAAGA AAGACCTCCA GGTAAATGAT840841 GGCTTTTAAT AAGACACATG ACAATCTCAA TTACAAGAAT CATTAGTGTG TGTCCTGTGC900901 GCCATTTTAT GTTCCCAGCA GGATATATCT TTTCTCGTCT AGGGTTTCCA GGGCTGTCTA960961 CTGTTCTCTA TGTGTAAAAC GTATTTAAGT GTTCCCCCAA TGCTGCACTA ATGTTGAAAC 10201021 AAAACAAAAC AAAAACGAAG AAACCTTTGT CAAGTGGTCA GACAGACTGG AACTAGAGGA 10801081 TTATAGGTAA GAGAGATAAA ATGAAGGGTT GAAAGCTATA ATTTCTATTT ATGTGGTGGC 11401141 AACCAAATCA GCTGTTGGAG TCAGGCAATT TAAAGATGTG GCTACTGGAG CTCAGAGTCT 12001201 GGGAAGAAGA CACTTCTGCG TCTGACAGTG AATCAGGCTC CCAGTTTTGA AGATGTGCTG 12601261 TAGGTAGTTC TCGCTGAATC CATTTCCCAG TTGGTTTCTA TTCCCCGCCC CATTCCTGTG 12601321 TCCCCACACT TTCCACTTGA TTTTACCTCT TTGACAATTC TATATTTTAC TTTCCTTCCT 13201381 CTCATTCCCC TTTTCCCACC CCCTTTTTTT ACTGTAGTTC TTGGCCTCTG ACTACTGTTC 13801441 CATGCTGGAT GTCCCCAGAA AATAGAGTAT GTTTAGAAAG GAGACAGTGC ATCTCAGAAG 14401501 GGCCTCCCCA GTCCACTAGT CCATTTTTTA ATGTGTTGTG CTCTATGGGT GTCAGGAATA 15601561 TTTGTAGATG AAGTAATTTG TGGCATGAAT TTTGATAGAA GCAGGATCAC CAACAAAATG 16201621 ATAAATGTAG GTACCTGTCT ACCTTGCATA ATATTCACTA TGATCTTGAG AATTTCAATG 16801681 TATAATTTGT CTTTATTCTT ATTTTTCATT AGAATTAACA GAATCTCAGA GCTGGTAGAA 17401741 AGTATAGAAA CTGTATATAC AACTCTCATA TTCAGATGAA GAAAATGATG CACAAAAAAT 18001801 CAACTGTCCT AAGCCATTTA GCTTGTCTAT AAGTGCTGTT GGCTTAATTA TAGTTTTGCA 18601861 TATATTTAGG CAAAGAAAAT ACTTTCTCAG AAACTGGTTA GGACTGTTTG AGAAGAAATA 19201921 TAATCATCAA AATATATACA CAGTAAAATG TAACCGTCCA TCATTCAACA TAGGCAAGAA 19801981 TATATATTGA ATTGCCTGAG TGTATTATTC GTATAGCAAA ACTTACTTGA ATTTCTAATA 20402041 AATCTTCTGA CCTCTGTATA TGTATAAAAT ATATAAACCA ACCAAATTCT GTACATAAAT 21002101 ATATTTTTGG ATACCAGTAC AATCCCTATT TCACTTTTGT GTATTCCAGT TATTTATTAC 21602161 TCACAGTTCT GTAGTTTTAA CCAGAACAAA GGGATTACCC AGAAGAAAAG AAGGTAAGCT 22202221 ATTTCATCAG TTTTGGTGGA AATCAGAAGT TTTTTTTTCT ATTATTAGCT TTGTATTCTT 22802281 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA2303。
2.權(quán)利要求1所述的人類新基因FAMLF的開放讀碼框的核苷酸序列為序列表代號(hào)為 SEQID NO 2 ；1 ATGTGTTGTG CTCTATGGGT GTCAGGAATA TTTGTAGATG AAGTAATTTG TGGCATGAAT 61 TTTGATAGAA GCAGGATCAC CAACAAAATG ATAAATGTAG GTACCTGTCT ACCTTGCATA 121 ATATTCACTA TGATCTTGAG AATTTCAATG TATAATTTGT CTTTATTCTT ATTTTTCATT 181 AGAATTAACA GAATCTCAGA GCTGGTAGAA AGTATAGAAA CTGTATATAC AACTCTCATA 241 TTCAGATGA。
3.權(quán)利要求1所述的人類新基因FAMLF的編碼蛋白所對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基序列為 1 Met Cys Cys Ala Leu Trp Val Ser Gly lie Phe Val Asp Glu Val 1516 lie Cys Gly Met Asn Phe Asp Arg Ser Arg lie Thr Asn Lys Met 30 31 lie Asn Val Gly Thr Cys Leu Pro Cys lie lie Phe Thr Met lie 45 46 Leu Arg lie Ser Met Tyr Asn Leu Ser Leu Phe Leu Phe Phe lie 60 61 Arg lie Asn Arg lie Ser Glu Leu Val Glu Ser lie Glu Thr Val 75 76 Tyr Thr Thr Leu lie Phe Arg 82。
4.權(quán)利要求1所述的人類新基因FAMLF的全長(zhǎng)cDNA克隆引物 序列 < 四>F82 :ACTTTCTACCTTCCTCTCCGGC R1974 :CCTATGTTGAATGATGGACGGTTAC。
5.權(quán)利要求1所述的人類新基因FAMLF的基因高效特異PCR擴(kuò)增的引物序列 < 五>Fl7 CAGCTTCCACAGGAGCAAGG R539 :TTCGCCTAAGTGATGTGGCAT。
6.權(quán)利要求1所述的人類新基因FAMLF的基因抗體研制所用的免疫多肽表位及針對(duì)該 表位的抗體為序列 < 六>C-ALWVSGIFVDEVI-NH2C-GMNFDRSRITNK-NH2C-RINRISELVESIETVYT-NH20
7.權(quán)利要求1所述的人類新基因FAMLF在基因重組中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的人類新基因FAMLF在惡性腫瘤基因檢測(cè)中的應(yīng)用，以及作為惡性 腫瘤檢測(cè)的含有人類新基因FAMLF的試劑盒。
9.權(quán)利要求1所述的人類新基因FAMLF在特異性單克隆抗體中的研制與應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的人類新基因FAMLF及其編碼的多肽和多核苷酸在制備抗白血病 細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，以及福建省急性髓系白血病高發(fā)家系系譜圖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人類新基因FAMLF在人基因重組、惡性腫瘤基因檢測(cè)、特異性單克隆抗體的研制與應(yīng)用，所述的人類新基因FAMLF是與家族性急性髓系白血病相關(guān)的新基因的cDNA及其完整開放讀碼框的多核苷酸序列，它包含一個(gè)cDNA全長(zhǎng)的序列，序列表代號(hào)為SEQ ID NO1，一個(gè)完整開放讀碼框的序列，序列表代號(hào)為SEQ ID NO2。為今后白血病特異性基因診斷抗體、蛋白芯片、基因芯片、基因藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。對(duì)于開發(fā)研制抗白血病新藥，提高白血病診斷準(zhǔn)確率與治療效果，提高福建省白血病的治愈率有重要的作用，有潛在重大的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明為白血病及其他惡性腫瘤的基因診斷和基因治療奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K7/08GK101838650SQ201010107579
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者葉美玲, 李景崗, 王少元, 許能文, 黃源茂 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院