(結(jié)果 見圖1E)，且其0ct4和Nanog啟動子區(qū)去甲基化（結(jié)果見圖1F)。體外分化實(shí)驗(yàn)顯示這兩 個克隆均能形成EB球，貼壁后形成3個胚層類型的細(xì)胞，對LQTL2-C2的EB球貼壁后形成 的細(xì)胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為c-DNA，qPCR檢測3個胚層標(biāo)記物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與未分化的iPSC 相比，三個胚層的標(biāo)記物中有6個標(biāo)記物的表達(dá)提高了 100倍以上（結(jié)果見圖1H)。
[0088] 9. 2LQTLliPSC 鑒定
[0089] 對于附著體質(zhì)粒誘導(dǎo)得來的LQTLliPSC，qPCR檢測LQTL1-C1，C2, C4, C5多能標(biāo)記 物內(nèi)源0ct4,內(nèi)源Sox2,內(nèi)源Lin28和內(nèi)源Nanog，表達(dá)量與人胚胎干細(xì)胞株H9相當(dāng)（結(jié) 果見圖2D)。因此，選擇C4和C5進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。進(jìn)一步核型檢測發(fā)現(xiàn)C4，C5核型正常 (結(jié)果見圖2F)，超過90 %的細(xì)胞群體表達(dá)人胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)記物Tra-1-60 (結(jié)果見 圖2E)，且其中0ct4和Nanog啟動子區(qū)去甲基化（結(jié)果見圖2G)。從C4P24和C5P8的細(xì) 胞中提取質(zhì)粒，PCR檢測附著體質(zhì)粒骨架上的外源基因0ct4、Klf4、Sox2、Lin28、Nanog、 SV40LT、L-MYC均為陰性，表示在這些細(xì)胞中用于重編程的附著體質(zhì)粒已經(jīng)完全丟失（結(jié)果 見圖 21) Jransgene 檢測 LQTL1C4 和 C5 外源基因 0ct4、Nanog、Klf4、SV40LT、Sox2、Lin28 和L-MYC，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中外源基因均較好沉默（結(jié)果見圖2J);基因組中沒有外源基因的整合 (結(jié)果見圖2K)。體外分化實(shí)驗(yàn)顯示這兩個克隆均能形成EB球，貼壁后形成3個胚層類型 的細(xì)胞，對C4的EB球貼壁后形成的細(xì)胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為c-DNA，qPCR檢測3個胚層標(biāo) 記物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與未分化的iPSC相比，三個胚層的標(biāo)記物中有6個標(biāo)記物的表達(dá)提高了 100倍以上（結(jié)果見圖2H)。
[0090] 實(shí)施例3iPSC分化為心肌細(xì)胞
[0091] 利用分散酶對實(shí)施例2中所得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行分散，按照2X105個細(xì) 胞/10平方厘米，將經(jīng)過分散的多能干細(xì)胞接種在包被基質(zhì)膠的含有mTeSRl培養(yǎng)基的 平板上，并培養(yǎng)至融合度為70~90 %融合度；在超慢貼附六孔板中，使用ACCUTASE細(xì)胞 消化液，將所得到的培養(yǎng)物消化為單細(xì)胞，并在含有Matrigel (40mg/mL)、BMP4(lng/mL ; 11^丨壯(^611)和1^〇激酶抑制劑〇?00()(1〇1111;1?&0)的11^651?1培養(yǎng)基中5%氧氣條件下 進(jìn)行培養(yǎng)24小時；）將所得的培養(yǎng)物進(jìn)行清洗，并更換為含有抗壞血酸（AA，50mg/mL ; Sigma)、2mM Gluta-MAX-l (Invitrogen)、BMP4 (10ng/mL)和人重組激活素 -A (1 Ong/mT,； Invitrogen)的StemPro34SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天；以及向所得到的培養(yǎng)物中添加 Wnt抑制 劑IWR_l(5mM;Enzo Life Sciences)后繼續(xù)培養(yǎng)4天，通過免疫焚光染色α-actinin和 β -myosin (心肌細(xì)胞的標(biāo)志物），可以證明通過誘導(dǎo)分化得到了心肌細(xì)胞。
[0092] 實(shí)施例4心肌細(xì)胞性能鑒定
[0093] 按照常規(guī)方法進(jìn)行檢測，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例3中所得到的心肌細(xì)胞同正常人相 比，動作電位時程明顯的延長，與LQT疾病的表現(xiàn)型相符。由此，可以通過利用該心肌細(xì) 胞作為疾病模型用于藥物篩選。另外，通過基因測序發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例3中所得到的心 肌細(xì)胞存在LQT相關(guān)突變基因與SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列相比具有c.605-2A>G/ c. 815G>A
[0094] 實(shí)施例5LQT藥物篩選
[0095] 將候選化合物與實(shí)施例3中所得到的心肌細(xì)胞接觸，并且檢測與候選化合物前 后，心肌細(xì)胞的動作電位時程的延長，如果接觸后動作電位時程明顯的延長得到明顯改善， 則說明該候選化合物可以可以用于治療LQT疾病。利用該方法，發(fā)明人驗(yàn)證了目前所使用 的exiletine滿足上述篩選要求。
[0096] 在本說明書的描述中，參考術(shù)語"一個實(shí)施例"、"一些實(shí)施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不 必須針對的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任 一個或多個實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技 術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié) 合和組合。
[0097] 盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例 性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述 實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種構(gòu)建LQT疾病模型的方法，其特征在于，包括： (1) 利用附著體載體，將重編程因子編碼基因引入攜帶LQT相關(guān)突變基因的體細(xì)胞中， 以便獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；以及 (2) 在適于所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的條件下，培養(yǎng)所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，以便獲得心 肌細(xì)胞，所述心肌細(xì)胞構(gòu)成所述LQT疾病模型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述攜帶LQT相關(guān)突變基因的體細(xì)胞為來 自LQT患者的尿液細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述LQT相關(guān)突變基因與SEQIDNO:1所 示的核苷酸序列相比具有c. 605-2A>G/c. 815G>A突變。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重編程因子包括：0CT4、S0X2、KLF4、 NANOG、SV40LT、L-MYC和LIN28。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述附著體載體包括： 第一附著體質(zhì)粒，所述第一附著體質(zhì)粒攜帶編碼0CT4的核苷酸序列、編碼S0X2的核苷 酸序列、編碼KLF4的核苷酸序列、編碼NANOG的核苷酸序列； 第二附著體質(zhì)粒，所述第二附著體質(zhì)粒攜帶編碼0CT4的核苷酸序列、編碼S0X2的核苷 酸序列、編碼KLF4的核苷酸序列、編碼SV40LT的核苷酸序列；以及 第三附著體質(zhì)粒，所述第三附著體質(zhì)粒攜帶編碼L-MYC的核苷酸序列、編碼LIN28的核 苷酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑴進(jìn)一步包括： (1-1)將所述附著體載體轉(zhuǎn)染所述攜帶LQT相關(guān)突變基因的體細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)染后的 體細(xì)胞； (1-2)于37°C、5%CO2條件下，利用無滋養(yǎng)層人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編程培養(yǎng)基培養(yǎng)所 述轉(zhuǎn)染后的體細(xì)胞； (1-3)在轉(zhuǎn)染后的第15天將培養(yǎng)基換成mTeSRl繼續(xù)培養(yǎng)； (1-4)在轉(zhuǎn)染后的第25天，選取具有典型人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形態(tài)的克隆進(jìn)行純化擴(kuò) 增，以便獲得所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于， 所述編碼0CT4的核苷酸序列具有如SEQIDNO:2所示的序列； 所述編碼S0X2的核苷酸序列具有如SEQIDNO:3所示的序列； 所述編碼NANOG的核苷酸序列具有如SEQIDNO:4所示的序列； 所述編碼SV40LT的核苷酸序列具有如SEQIDNO:5所示的序列； 所述編碼KLF4的核苷酸序列具有如SEQIDNO:6所示的序列； 所述編碼L-MYC的核苷酸序列具有如SEQIDNO:7所示的序列；以及 所述編碼LIN28的核苷酸序列具有如SEQIDNO:8所示的序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑵進(jìn)一步包括： (2-1)利用分散酶對步驟⑴中所得到的所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行分散， (2-2)按照2X105個細(xì)胞/10平方厘米，將所述多能干細(xì)胞接種在包被基質(zhì)膠的含有mTeSRl培養(yǎng)基的平板上，并培養(yǎng)至融合度為70~90%融合度； (2-3)在超慢貼附六孔板中，使用ACCUTASE細(xì)胞消化液，將步驟（2-2)中所得到的培養(yǎng) 物消化為單細(xì)胞，并在含有Matrigel、BMP4和Rho激酶抑制劑的mTeSRl培養(yǎng)基中5%氧氣 條件下進(jìn)行培養(yǎng)24小時； (2-4)將步驟（2-3)中所得的培養(yǎng)物進(jìn)行清洗，并更換為含有抗壞血酸、2mM Gluta-MAX-I、BMP4和人重組激活素-A的StemPro34SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天；以及 (2-5)向所得到的培養(yǎng)物中添加Wnt抑制劑IWR-I后繼續(xù)培養(yǎng)4天，以便獲得所述心肌 細(xì)胞。
9. 一種心肌細(xì)胞，其是通過權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建的。
10. 權(quán)利要求9所述的心肌細(xì)胞在篩選藥物中的用途，所述藥物用于治療LQT疾病，優(yōu) 選JLNS型LQT疾病。
【專利摘要】本發(fā)明提供了構(gòu)建LQT疾病模型的方法及其在篩選藥物中的應(yīng)用，該方法包括：(1)利用附著體載體，將重編程因子編碼基因引入攜帶LQTS相關(guān)突變基因的體細(xì)胞中，以便獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；以及(2)在適于所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的條件下，培養(yǎng)所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，以便獲得心肌細(xì)胞，所述心肌細(xì)胞構(gòu)成所述LQTS疾病模型。利用該方法，能夠快速有效地制備獲得LQTS疾病模型。
【IPC分類】C12N15-85, C12Q1-02, C12N5-10
【公開號】CN104726492
【申請?zhí)枴緾N201510028218
【發(fā)明人】李翠蘭, 楊佳銀, 王震, 劉雨晴, 周敏, 劉文玲, 胡大一, 楊波
【申請人】深圳市三啟生物技術(shù)有限公司, 北京大學(xué)人民醫(yī)院
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年1月20日