專利名稱：：一種乙肝病毒雙表達質(zhì)粒及構建方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種乙肝病毒雙表達質(zhì)粒疫苗及構建方法和應用，具體是一種乙肝病毒前C-C(PreC-C)基因和前S-S(preS_S)基因雙表達質(zhì)粒及構建方法和應用，屬于HBVDNA疫苗的設計制造及免疫效果檢測的生物學領域。
背景技術：
：慢性乙型肝炎嚴重危害人類健康，目前尚無特效治療手段。乙肝病毒(HBV)感染人體后發(fā)生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特異性細胞免疫應答，不能清除體內(nèi)病毒。由于DNA疫苗在誘導機體特異性細胞免疫方面具有獨特優(yōu)勢，已作為針對慢性乙肝具有潛力的免疫治療手段被廣泛研究。目前乙肝DNA疫苗研究的焦點在于如何誘導足夠強的特異性細胞免疫，以達到抑制或消滅病毒、治療乙肝的目的。選擇合適的目的基因和載體體外連接構建重組質(zhì)粒，是研究治療型HBVDNA疫苗的關鍵基礎步驟。對所選目的基因的要求是能夠誘導機體產(chǎn)生較強的針對HBV抗原的特異性細胞免疫反應。HBV的基因組是一環(huán)狀的部分雙螺旋結(jié)構，長約3.2kb?；蚪M中已確定的開放讀框有4個，分別編碼病毒的核殼(C)和包膜(S)蛋白，病毒DNA聚合酶及X蛋白。目前學者們公認，S基因和C基因是HBVDNA疫苗常用的備選基因，它們都具有強免疫原性，但以往的疫苗都選用單一基因。因此，提供一種乙肝病毒雙表達質(zhì)?；蛞呙缇统蔀樵?br>技術領域：
急需要解決的技術問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種乙肝病毒雙表達質(zhì)?；蛞呙?，具體的說是以乙肝病毒前C-C基因、前S-S基因和自身復制調(diào)控元件增強子為目的基因構建的重組HBVDNA雙表達質(zhì)粒(VCS)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術方案一種乙肝病毒雙表達質(zhì)粒，其特征在于，其包括真核細胞表達載體VR1012上插入核苷酸序列的乙肝病毒前C-C基因和自身復制調(diào)控元件增強子II，以及含調(diào)控序列的乙肝病毒前S-S基因和自身復制調(diào)控元件增強子I。本發(fā)明的目的之二在于提供一種上述乙肝病毒雙表達質(zhì)粒的構建方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下兩種技術方案實現(xiàn)的一種乙肝病毒雙表達質(zhì)粒的構建方法，其步驟如下首先以血清中的HBVDNA為模板，用套式PCR分別擴增出乙肝病毒增強子11/前C-C基因和增強子I/前S-S基因，然后通過基因克隆連入真核表達載體VR1012，克隆篩選得到單表達質(zhì)粒VEC和VES；采用單引物二次PCR法突變VES，在調(diào)控表達單元下游插入酶切位點，PCR擴增VEC中完整的調(diào)控和表達單元并克隆到突變后的VES中，克隆篩選得到利用各自的啟動子分別表達前C-C和前S-S的雙表達質(zhì)粒。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的單引物二次PCR法為點突變的單引物二次PCR法，是改良的實現(xiàn)環(huán)狀質(zhì)粒點突變的方法，該方法的特征為將PCR分為兩步，先加入正向單引物擴增，引物只能與一條反向模板鏈結(jié)合，生成正向的環(huán)狀變異互補鏈，退火后，引物仍然只能與反向模板鏈結(jié)合，PCR擴增效率不高，但能夠得到少量確切的變異鏈；第二輪PCR中，加入反向單引物，此引物可能與正向變異鏈結(jié)合，也可能與正向原模板鏈、正向引物結(jié)合，但由于引物序列與正向變異鏈完全互補，正向引物又在第一輪PCR中消耗一部分，故引物與正向變異鏈結(jié)合機率較高；然后對PCR產(chǎn)物進行選擇性酶切，轉(zhuǎn)化細菌后克隆篩選得到突變VES基因。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的單引物二次PCR法突變VES包括首先合成1對引入插入突變的引物，并插入NheI、PacI、FseI和AgeI酶切位點，VR-正向和VR-反向；進行第一輪PCR:以VES質(zhì)粒為模板，加入正向引物VR-正向，PCR擴增；再進行第二輪PCR以第一輪PCR反應產(chǎn)物為模板，加入反向引物VR-反向，PCR擴增；然后對PCR產(chǎn)物進行選擇性酶切，轉(zhuǎn)化細菌后克隆篩選得到突變VES基因。一種優(yōu)選技術方案，其特征在于所述的PCR擴增VEC，為含NheI酶切位點的VR2012-PF為正向引物、含AgeI酶切位點的VR2012-PR為反向引物。一種乙肝病毒雙表達質(zhì)粒的構建方法，其步驟如下首先以血清中的HBVDNA為模板，用套式PCR分別擴增出乙肝病毒增強子11/前C-C基因和增強子I/前S-S基因，然后通過基因克隆連入真核表達載體VR1012，克隆篩選得到單表達質(zhì)粒VEC和VES；采用單引物二次PCR法突變VEC，在調(diào)控表達單元下游插入酶切位點，PCR擴增VES中完整的調(diào)控和表達單元并克隆到突變后的VEC中，克隆篩選得到利用各自的啟動子分別表達前C-C和前S-S的雙表達質(zhì)粒。本發(fā)明構建重組乙肝病毒前S-S基因疫苗VES后，在其完整的調(diào)控表達單元下游引入突變，插入AgeI和NheI酶切位點；同時構建重組乙肝病毒前C-C基因疫苗VEC，并高保真PCR擴增VEC的完整調(diào)控表達單元，利用AgeI和NheI插入到VES質(zhì)粒中，從而構建成前C-C基因和前S-S基因的雙表達質(zhì)粒，可以同時分別表達兩種抗原。本發(fā)明的目的之三在于提供上述乙肝病毒雙表達質(zhì)?；蛞呙缭陬A防和治療乙型肝炎中的應用。本發(fā)明構建的含乙肝病毒前C-C基因和增強子II、前S-S基因和增強子I的重組HBVDNA疫苗(VCS)，載體選用質(zhì)粒VR1012，為美國FDA已批準用于人體基因治療的真核細胞表達載體，我國FDA近期也批準其作為HIVDNA疫苗載體用于人體，其具有多克隆位點、CMV啟動子、卡那霉素抗性基因等。研究表明HBeAg與HBcAg在T細胞識別水平上有高度交叉反應性，HBeAg的胞內(nèi)前體與HBcAg同源性更強，既可以通過MHCI類抗原路徑被⑶8+CTL細胞識別，也可少量分泌通過MHC11類抗原路徑被⑶4+T細胞識別，從而可誘導較HBcAg更強的HBV特異性細胞免疫。有益效果為了克服傳統(tǒng)環(huán)狀誘變法引物互相結(jié)合問題，將傳統(tǒng)環(huán)狀誘變法的一次PCR改良為兩次，即先加入正向單引物擴增，引物只能與一條反向模板鏈結(jié)合，生成正向的環(huán)狀變異互補鏈，第二輪PCR中，加入反向單引物，此引物可能與正向變異鏈結(jié)合，也可能與正向原模板鏈、正向引物結(jié)合，但由于引物序列與正向變異鏈完全互補，正向引物又在第一輪PCR中消耗一部分，故引物與正向變異鏈結(jié)合幾率較高。雖然單引物二次PCR法擴增效率理論上偏低，但通過轉(zhuǎn)化細菌及克隆篩選后能得到變異成功的質(zhì)粒，變異成功率明顯提高，為質(zhì)粒點突變提供了確切高效的方法，不失為一種高效便捷的實驗方法。經(jīng)過上述實驗，得到了增強子11/前C-C基因和增強子I/前S-S基因構建的HBV雙表達質(zhì)粒，為進一步研究治療性HBVDNA的效果打下了基礎。將本發(fā)明獲得的乙肝病毒前C-C基因和前S-S基因疫苗VCS轉(zhuǎn)染入H印G2細胞，ELISA法檢測細胞裂解液和細胞培養(yǎng)液的HBsAg和HBeAg，結(jié)果顯示均有目的蛋白表達，明顯高于對照組質(zhì)粒。本發(fā)明的乙肝病毒前C-C基因和前S-S基因雙表達質(zhì)粒疫苗，即重組HBVDNA疫苗，能有效地表達乙肝表面抗原和核心抗原，可用于乙型肝炎的預防和治療。下面通過附圖和具體實施方式對本發(fā)明做進一步說明，但并不意味著對本發(fā)明保護范圍的限制。圖IHBVENHII-PreC-C基因PCR擴增相關引物位置示意圖；圖2HBVENHII-PreC-C基因PCR擴增片段電泳圖；圖3pGEM_TEasy/HBVENHIl-PreC-C片段重組質(zhì)粒酶切后電泳分析圖；圖4質(zhì)粒VEC酶切后電泳分析圖；圖5HBVPreS-S-ENHI基因PCR擴增相關引物位置示意圖；圖6重組質(zhì)粒VES酶切后電泳分析圖；圖7重組質(zhì)粒TA-C酶切后電泳分析圖；圖8重組質(zhì)粒VCS酶切后電泳分析圖；圖9為本發(fā)明乙肝病毒雙表達質(zhì)粒基因疫苗構建方法的流程示意圖。具體實施例方式菌株、細胞、試劑及實驗器材廠商限制性核酸內(nèi)切酶AgeI、NheI和DpnINewEnglandBiolabT4DNA連接酶NewEnglandBiolabpGEM-TEasyi式劑盒Promega公司X-gal鼎國公司IPTG鼎國公司高保真DNA聚合酶Pfu美國Stratagene公司RocheExpandLongTemplatePCRSystemRoche公司質(zhì)粒小量提取試劑盒Promega公司DNA純化試劑盒Promega公司質(zhì)粒大量提取試劑盒QIAGEN公司卡那霉素鼎國生物公司感受態(tài)DH5a菌全式金生物技術有限公司其余常用生化試劑(國產(chǎn)分析純)上海華美生物公司等HepG2細胞病毒研究室保存DMEM北京天潤善達公司高效真核轉(zhuǎn)染試劑VigoFect威格拉斯生物技術有限公司真核細胞蛋白裂解液博大泰克公司HBsAg和HBeAg檢測試劑盒北京科衛(wèi)試劑廠6孔細胞培養(yǎng)板BectonDickinsonLabwareIOml細胞培養(yǎng)瓶北京其余常用生化試劑為國產(chǎn)分析純上海華美公司等主要儀器MJMiniPCR擴增儀美國Bio-Rad公司LG15-W高速微量離心機北京低溫高速離心機日本HITACHI公司DYY-III型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一儀器廠THZ-C電熱恒溫搖床江蘇太倉儀器廠SmartSpecPlus分光光度計美國Bio-Rad公司C02恒溫孵箱德國Heraeus公司BHC-1360IIA2型超凈工作臺北京哈東聯(lián)儀器公司MS型酶標檢測儀芬蘭Labsystems公司實施例1乙肝病毒前C-C基因疫苗的構建1.套式PCR擴增ENHII-PreC-C基因選擇病毒性肝炎患者的血液，乙型慢性(中度)，HBVDNA、HBeAg陽性。提取血清HBVDNA后測序，分型為adr亞型。慢性乙型肝炎患者肝素抗凝血3ml，2000rpm離心3min，分離血清。使用QIAGEN試劑盒，提取HBVDNA步驟如下①血清200μ1與蛋白酶20μ1混勻，②加BufferAL200μ1，混勻，③加無水酒精200μ1，混勻，56°C孵育lOmin，④IOOOOrpm離心lmin，過柱，棄離心液，⑤加BufferAff1500μ1，IOOOOrpm離心Imin沖洗，棄離心液，⑥加BufferAW25001，14000rpm離心5min沖洗，棄離心液，⑦14000rpm再次離心lmin，棄離心液，⑧加無菌去離子水200μ1，12000rpm離心，洗脫HBVDNA。所得HBVDNA測序，確定為adr亞型；如圖1所示，以此為模板，以c5out(正向外引物，5‘-TTACGCGGTCTCCCCGTCTG)和c3out(反向外引物，3‘-AAAGTTTCCCACCTTATGAG)為引物進行PCR擴增模板Ιμ、弓丨物(25μΜ)各1μl、5mMdNTP2μ1U0XPCRBuffer5μ1、Taq酶1μ1、H2O39μ1，94°C變性3min—94°C變性lmin,52°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)一72°C延伸lOmin。以5μ1擴增產(chǎn)物為模板，再以c5in(正向內(nèi)引物，5‘-AAACTGCAGACCTCTGCACGTCGCATG)和c3in(反向內(nèi)引物，3'-CGCGGATCCTCCAAGGGATACTAACAT)為引物，采用前述PCR方法擴增，擴增產(chǎn)物即HBVENHII-PreC-C基因。經(jīng)提取CHB患者血清HBVDNA及套式PCR擴增，獲得PCR產(chǎn)物HBVENHII-PreC-C片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其大小為800900bp，符合預期長度，如圖2所示，左側(cè)為DNAMarker，右側(cè)為HBVENHII-PreC-C片段。2.重組質(zhì)粒VEC的構建(1)構建pGEM-TEasy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物3μl，pGEM_TEasy載體1μ1，2XBuffer5μ1,T4DNA連接酶1μ1，混勻后室溫(20°C-25°C，下述室溫均為此溫度)放置lh，4°C過夜。(2)pGEM-TEasy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌-60°C保存，取出后置冰浴中備用。上述連接產(chǎn)物共10μ1加入100μ1感受態(tài)細菌中(同時設陽性及陰性對照)輕輕混勻，冰浴20min，室溫lOmin，加LB400μ1，37°C250rpm搖床30min，取100μ1轉(zhuǎn)化菌涂于含氨芐青霉素(25μg/ml)、X-gal和IPTG的固體LB培養(yǎng)板，待表面液體晾干后，將培養(yǎng)板倒置于37°C孵箱中培養(yǎng)過夜(12-18h)。(3)pGEM-TEasy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)?？寺『Y選及擴增提取挑取培養(yǎng)板中白色陽性菌落，置于3ml含氨芐青霉素(25μg/ml)的LB中，37°C250rpm搖床過夜(12_18h)。取1.5ml菌液提取質(zhì)粒，使用Promega質(zhì)粒提取試劑盒，按說明書操作，步驟如下①8000rpm離心3min，棄上清。②力口ResuspensionSolution250μ1，吹打混勻重懸菌體。③加CellLysisSolution250μ1，顛倒混勻后靜置3min，加AlkalineProtezseSolution10μ1，顛倒混勻后靜置5min。④力口NeutrilizationSolution350μ1,顛倒混勾。⑤14000rpm離心lOmin，取上清過柱。⑥14000rpm離心柱lmin，棄離心液。⑦力口WashSolution750μ1,14000rpm離心lmin,棄離心液，再力口WashSolution250yl，14000rpm離心lmin，棄離心液后再離2min。⑧離心柱加100μ1無菌去離子水洗脫質(zhì)粒，室溫3min，14000rpm離心lmin。(4)pGEM-TEasy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切、回收目的片段用T7、SP6引物測序pGEM-TEasy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒，確認連接片段為所需目的基因后，PstI、BamHI雙酶切PstI2μ1+BamHI2μ1+BSA1μ1+質(zhì)粒30μ1+10XBuffer10μ1+Η2055μ1，37°C水浴2h。如圖3所示，pGEM-TEasy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒經(jīng)PstI、BamHI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析，左側(cè)為DNAMarker,右側(cè)為TEasy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切，上方條帶為載體pGEM-TEasy，下方條帶為HBVENHII-PreC-C片段，瓊脂糖凝膠電泳分析確認酶切片段長度約800900bp，與預期相符，使用PromegaDNA純化試劑盒純化回收，步驟如下①酶切產(chǎn)物100μ1加入瓊脂糖凝膠加樣孔中。②電壓80V，電泳15min。③紫外線燈下切膠，取酶切片段，稱重。④加等量(ml/mg)MembraneBindingSolution,60°C7jC浴lOmin。⑤過柱，14000rpm離心lmin，棄離心液。⑥離心柱力口700μIMembraneWashSolution,14000rpm離心lmin,棄離心液。⑦離心柱力口500μIMembraneWashSolution,14000rpm離心3min,棄離心液。⑧離心柱加無菌去離子水50μ1，室溫3min，14000rpm離心lmin，洗脫目的片段DNA。(5)構建重組質(zhì)粒VECPstI.BamHI雙酶切載體VR1012并純化(方法同前)，然后與步驟(4)中雙酶切后的目的片段連接T4DNA連接酶1μ1，10XBuffer1μ1，酶切片段+酶切載體共8μ1(根據(jù)電泳結(jié)果評估載體與酶切片段濃度，按片段載體31比例加樣)。10μ1連接產(chǎn)物16°C過夜后按前述方法轉(zhuǎn)染感受態(tài)DH5α菌，涂于含卡那霉素的半固體LB培養(yǎng)板上，12-18h后挑取陽性菌落擴增，按前述方法提取質(zhì)粒VEC、PstI和BamHI酶切鑒定。如圖4所示，載體VR1012插入基因片段為HBVENHII-PreC-C，經(jīng)限制性內(nèi)切酶PstI、BamHI雙切后，瓊脂糖凝膠電泳分析確認酶切片段大小約860bp，證實連接片段為所需目的基因，左側(cè)為DNAMarker；右側(cè)為重組質(zhì)粒VEC酶切，上方條帶為載體VR1012，下方條帶為HBVENHII-PreC-C片段。電泳分析確認酶切大小正確后測序，測序顯示插入片段HBVENHII-PreC-C的核酸及氨基酸序列結(jié)果與模板序列完全一致，其序列如SEQIDNO:1、2。實施例2乙肝病毒前S-S基因疫苗的構建1.套式PCR擴增PreS-S-ENHI基因以HBV質(zhì)粒G683-1為模板，以S2-5(正向，5‘-AAACTGCAGCATCCTCAGGCCATG,)禾口S3E(反向，5‘-GGATCCCTAGGAGTTCCGCAGTATGG)為引物，采用實施例1中第1部分中的PCR方法擴增，如圖5，模板1μ1、引物(25μΜ)各1μ1.5mMdNTP2y1U0XPCRBuffer5μ1、Taq酶1μ1、H2O39μ1，94°C變性3min—94°C變性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin,共35個循環(huán)一72°C延伸lOmin。擴增產(chǎn)物即HBVPreS-S-ENHI基因。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小約1.3kb，符合預期長度。2.重組質(zhì)粒VES的構建方法同實施例1中第2部分，將PCR產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌、挑取白色單克隆菌落，擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒、PstI和BamHI酶切后純化酶切片段，將其與同樣酶切純化的VR1012載體連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，挑取單克隆菌落、篩選出含插入片段的重組質(zhì)粒VES；如圖6所示，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶PstI、BamHI雙切后，瓊脂糖凝膠電泳分析確認酶切片段大小約1.3kb，與預期相符，證實連接片段為所需目的基因，左側(cè)為DNAMarker,右側(cè)為重組質(zhì)粒VES酶切產(chǎn)物，上方條帶為載體VR1012，下方條帶為PreS-S-ENHI片段。電泳分析確認酶切片段大小正確后測序，其核酸及氨基酸序列結(jié)果與預計序列完全一致。插入片段HBVPreS-S-ENHI的核苷酸和氨基酸序列如SEQIDNO:3和4。實施例3重組質(zhì)粒VES的插入突變單引物二次PCR法擴增實現(xiàn)VES質(zhì)粒的插入突變1.合成1對引入插入突變的引物，插入NheI、PacI、FseI和AgeI酶切位點VR-正向5，-GGTGCTGAAGAATTGCTAGCTTAATTAAGGCCGGCCACCGGTTCCTCCTGGG，序列如SEQIDNO5；VR-反向5，-TGGCCGGCCTTAATTAAGCTAG，序列如SEQIDNO6(斜體加粗為插入序列)2.第一輪PCR以VES質(zhì)粒為模板，加入正向引物VR-正向，PCR擴增，反應體積和條件如下模板(VES0.lyg/μ1)2μ1、引物VR-正向(25μΜ)2μ1、dNTP(5mM)2μ1、10XPCRBuffer2.5μ1、Pfu酶1μ1、Η2016·5μ1，反應條件94°C變性Imin—94°C變性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸12min，20個循環(huán)后72°C延伸lOmin。3.第二輪PCR以步驟2中PCR反應產(chǎn)物為模板，加入反向引物VR-反向，PCR法擴增，反應體積和條件如下模板2μ1、引物VR-反向(25μΜ)2μ1、dNTP(5mM)2μ1、10XPCRBuffer2.5μ1、Pfu酶1μ1、Η2016·5μ1，反應條件與第一輪PCR相同。4.PCR產(chǎn)物選擇性酶切第二輪PCR產(chǎn)物25μ1加入DpnI酶1μ1，10XBuffer2.5μ1，37°C水浴2h。5.突變質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化-70°C凍存的感受態(tài)DH5α菌100μ1置冰浴融化，將步驟3中PCR產(chǎn)物10μ1加入到感受態(tài)細菌中，輕輕混勻，冰浴25min，42°C40秒后置冰上3min，加LB300μ1，37°C搖床200rpm復蘇40min，取轉(zhuǎn)化菌液涂于含卡那霉素(50μg/ml)的固體LB培養(yǎng)板，待表面液體晾干后倒置于37°C孵箱中過夜。6.變異質(zhì)粒的擴增和提取挑取培養(yǎng)板中的陽性單菌落，置于5ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB中，370C200rpm搖床過夜(12_18h)。取1.5ml菌液提取質(zhì)粒，使用Promega質(zhì)粒提取試劑盒，按說明書操作，方法同前。取所提質(zhì)粒與模板質(zhì)粒電泳鑒定，條帶位置一致，測序證實在VES質(zhì)粒中成功插入酶切位點，得到突變質(zhì)粒VES-2。實施例4乙肝病毒前C-C基因疫苗VEC表達調(diào)控單元的擴增與克隆1.VEC表達調(diào)控單元的擴增RocheExpandLongTemplatePCRSystem擴增VEC表達調(diào)控單元，引物為VR2012-PF(正向，5，-AGTCGAGCTAGCGCCATGTTGACATTG,含NheI酶切位點，序列如SEQIDNO7)和VR2012-PR(反向，5，_TTAACCACCGGTAATTCTTCAGCACCTGG，含AgeI酶切位點，序列如SEQIDNO8)，PCR參數(shù)為94°C預變性2分鐘，94°C變性10秒、45°C復性30秒、68°C延伸3分鐘，10個循環(huán)后改為94°C變性15秒、45°C復性30秒、68°C延伸3分20秒，以后每隔2個循環(huán)延伸時間增加20秒，共28個循環(huán)，最后延伸7分；瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增出預期大小片段。2.VEC表達調(diào)控單元擴增產(chǎn)物的克隆及鑒定將3μ1PCR產(chǎn)物與ΙμpGEM-TEasyVector連接，室溫1小時后4°C過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5α，挑取單克隆菌擴增后提取質(zhì)粒TA-C，NheI和AgeI酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析；如圖7所示，右側(cè)為DNAMarker,左側(cè)為重組質(zhì)粒TA-C酶切，上方條帶為載體pGEM-TEasy，下方條帶為VEC表達調(diào)控單元片段，酶切片段大小約2.7kb，與預期相符，測序證實為目的基因。詳細方法同實施例1中第2部分。實施例5乙肝病毒雙表達質(zhì)粒VCS的構建l.NheI和AgeI酶切VEC表達調(diào)控單元克隆質(zhì)粒TA_C，純化回收約2.7kb的插入片段，詳細方法同實施例1中第2部分。2.構建雙表達質(zhì)粒VCSNheI和AgeI酶切突變后質(zhì)粒VES-2并純化，然后與步驟1中雙酶切純化后的目的片段連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌，挑取單克隆菌落，擴增后提取質(zhì)粒VCS，詳細方法同實施例1中第2部分。NheI和AgeI酶切質(zhì)粒VCS后瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖8所示，右側(cè)為DNAMarker；左側(cè)為重組質(zhì)粒VCS酶切產(chǎn)物，上方條帶為載體VES-2，下方條帶為VEC表達調(diào)控單元片段。電泳分析顯示載體約5.8kb，插入片段約2.7kb，與預計大小一致，測序證實序列正確。3.大量提取質(zhì)粒使用QIAGEN公司大量提取質(zhì)粒試劑盒提取雙表達質(zhì)粒VCS和對照空質(zhì)粒VR1012，按說明書操作，步驟簡述如下(1)挑取陽性菌落，放入含卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)液5ml中，37°C、250rpm搖振8h。(2)將上述菌液0.5ml轉(zhuǎn)入含卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)液500ml中，37°C搖床250rpm搖振16h。(3)取出500ml菌液，5000rpm4°C離心15min，棄上清。(4)加BufferP150ml重懸菌液，吹打混勻后加入BufferP250ml，顛倒數(shù)下混勻，室溫放置5min，再加BufferP350ml，顛倒數(shù)下混勻，冰浴30min。(5)16000rpm4°C離心30min，上清移入新離心管，再16000rpm4°C離心20min，將上清過柱(BufferQBT35ml預處理)。(6)BufferQC200ml洗柱。(7)BufferQF35ml過柱，洗脫DNA。(8)加入異丙醇24.5ml，混勻，14000rpm4°C離心30min，棄上清。(9)力卩70%乙醇7ml，混懸后14000rpm4°C離心15min，棄上清。(10)加500μ1生理鹽水溶解DNA，精密分光光度儀測濃度及260/280nm比值。實施例6HBV雙表達載體VCS的真核細胞轉(zhuǎn)染及表達產(chǎn)物檢測1.真核細胞轉(zhuǎn)染接種適量H印G2細胞于2塊六孔培養(yǎng)板，雙表達質(zhì)粒VCS和對照空質(zhì)粒VRlO12(陰性對照)各轉(zhuǎn)染5孔，另2孔作空白對照；每組檢測數(shù)值的均值作為該組的檢測數(shù)據(jù)。按轉(zhuǎn)染試劑VigoFect說明書操作，轉(zhuǎn)染過程簡述如下1)轉(zhuǎn)染前24小時，接種適量細胞，至轉(zhuǎn)染時細胞密度為40%-60%。2)轉(zhuǎn)染前1小時，更換新鮮的完全培養(yǎng)液2ml，置37°C，5%CO2培養(yǎng)。3)取5μgDNA，加入生理鹽水中至總體積為100μ1，輕輕混勻，室溫放置。4)取VigoFect2μ1，加入生理鹽水中至總體積為100μ1，輕輕混勻，室溫放置5分鐘。5)將稀釋的VigoFect逐滴加入稀釋的DNA溶液中，輕輕混勻，所得的轉(zhuǎn)染工作液在室溫放置15分鐘。6)將轉(zhuǎn)染工作液輕輕混勻，逐滴加入2ml培養(yǎng)液中，輕混勻培養(yǎng)液，置37°C，5%CO2培養(yǎng)。2.真核表達產(chǎn)物收集1)轉(zhuǎn)染48小時后，收集每孔的培養(yǎng)液，-20°C凍存，用于檢測。2)轉(zhuǎn)染48小時后，每孔用1毫升PBS洗細胞1次，然后加1毫升PBS，用細胞刮刀刮下細胞，吸入管中，5000rpm離心3分鐘，取沉淀，放冰上；每管加300微升真核細胞蛋白裂解液，用10微升槍頭吹打數(shù)次，以后每隔10分鐘吹打1回，共吹打6回后_20°C凍存，用于檢測。3.表達產(chǎn)物檢測利用ELISA試劑盒分別檢測細胞培養(yǎng)液和細胞裂解液，共10個樣本，按試劑盒步驟操作，簡述如下1)檢測外膜蛋白的表達雙抗體夾心法檢測HBsAg，S/N=雙表達質(zhì)粒A值組內(nèi)均值/空質(zhì)粒對照A值組內(nèi)均值a.取HBsAb包被板。b.細胞裂解液或培養(yǎng)液50μ1，陰性對照、陽性對照、空白孔各50μ1，每1樣本加2孔。c.加酶抗體復合物50μ1，混勻，37°C孵箱放置30min。d.洗板機洗滌，洗液350μ1/孔，洗5次。e.加顯色劑Α50μ1，顯色劑Β50μ1，混勻，37°C孵箱放置lOmin。f.加終止液50μ1。g.450nm波長分光光度計測A值，2孔均值為該標本檢測值。雙表達質(zhì)粒VCS轉(zhuǎn)染后的細胞裂解液及培養(yǎng)液均檢測到HBsAg，濃度高于VR1012載體對照組，以細胞培養(yǎng)液的更明顯，t檢驗顯示有顯著性差異，酶標儀測得反應表達強度的光密度如表1所示。表1、HBsAg的ELISA檢測結(jié)果分組細胞裂解液*_細胞培養(yǎng)液*__A值(χ士s)S/N_A值(x±s)S/N_VR10120.127±0.0520.010±0.003VCS_0.407±0.1153.2_0.715±0.26968.7_*P<0.Ol2)檢測核心蛋白的表達雙抗體夾心法檢測HBeAg，S/N=雙表達質(zhì)粒A值組內(nèi)均值/空質(zhì)粒對照A值組內(nèi)均值a.取HBeAb包被板。b.細胞裂解液或培養(yǎng)液50μ1，陰性對照、陽性對照、空白對照各50μ1，每1樣本加2孔。c.加酶抗體復合物50μ1，混勻，37°C孵箱放置30min。d.洗板機洗滌，洗液350μ1/孔，洗5次。e.加顯色劑Α50μ1，顯色劑Β50μ1，混勻，37°C孵箱放置lOmin。f.加終止液50μ1。g.450nm波長分光光度計測A值，2孔均值為該標本檢測值。雙表達質(zhì)粒VCS轉(zhuǎn)染后的細胞裂解液及培養(yǎng)液均檢測到HBeAg，濃度高于VR1012載體對照組，以細胞培養(yǎng)液的更明顯，t檢驗顯示有顯著性差異，酶標儀測得反應表達強度的光密度如表2所示。表2、HBeAg的ELISA檢測結(jié)果-<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*P<0.01本實施例將構建好的雙表達質(zhì)粒VCS轉(zhuǎn)染真核細胞，體外培養(yǎng)48h后采用ELISA法檢測細胞裂解液和培養(yǎng)液，結(jié)果顯示成功表達兩種目的蛋白，以細胞培養(yǎng)液中濃度較高。通過本實施例，驗證了雙表達質(zhì)粒VCS在真核細胞中能夠成功地同時表達2種預期蛋白，為HBVDNA疫苗的研究打下了基礎。本實施例動物實驗結(jié)果顯示雙表達質(zhì)粒VCS以肌注方式免疫Balb/c小鼠后，血清中均能夠產(chǎn)生抗HBc和抗HBe抗體。細胞免疫分析表明，VCS可使小鼠脾淋巴細胞中Y干擾素產(chǎn)生細胞數(shù)增多。上述結(jié)果表明雙表達質(zhì)粒VCS在誘導小鼠特異性細胞和體液免疫方面確實存在優(yōu)勢。上述實驗結(jié)果表明乙肝病毒前C-C基因和前S-S基因雙表達質(zhì)粒VCS在誘導小鼠特異性細胞和體液免疫方面均有優(yōu)勢，可用于乙型肝炎的免疫治療。序列表<110>中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院<120>一種乙肝病毒雙表達質(zhì)粒及構建方法和應用<130><160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>864<212>DNA<213>VEC插入片段HBVENHIl-PreC-C的核苷酸序列<400>1ctgcagacctctgcacgtcgcatggaaaccaccgtgaacgcccaccaggtcttgcccaag60gtcttacataagaggactcttggactcgcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatac120ttcaaaagactgtttatttaaggactgggaggagttgggggaggagattaggttaaaggt180ctttgtactaggaggctgtaggcataaattggtctgttcaccagcaccatgcaacttttt240cacctctgcctaatcatctcatgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgtgcctt300gggtggctttggggcatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagtta360ctctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgcgatctcctcgacaccgcctca420gctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactc480aggcaagctatcctgtgttggggtgagttgatgaatctggccacctgggtgggaagtaat540ttggaagacccagcatccagggaattagtagtcagctatgtcaatgttaatatgggccta600aaaatcagacaactattgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgtt660cttgagtatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccacca720aatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgacgaggcaggtcc780cctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaaga840tctcaatctcgggaatctcaatgt864<210>2<211>212<212>PRT<213>VEC插入片段HBVENHIl-PreC-C的氨基酸序列<400>2MetGlnLeuPheHisLeuCysLeulielieSerCysSerCysProThr151015ValGlnAlaSerLysLeuCysLeuGlyTrpLeuTrpGlyMetAsplie202530AspProTyrLysGluPheGlyAlaSerValGluLeuLeuSerPheLeu354045ProSerAspPhePheProSerlieArgAspLeuLeuAspThrAlaSer505560AlaLeuTyrArgGluAlaLeuGluSerProGluHisCysSerProHis65707580HisThrAlaLeuArgGlnAlalieLeuCysTrpGlyGluLeuMetAsn859095LeuAlaThrTrpValGlySerAsnLeuGluAspProAlaSerArgGlu100105110LeuValValSerTyrValAsnValAsnMetGlyLeuLyslieArgGln115120125LeuLeuTrpPheHisiIeSerCysLeuThrPheGlyArgGluThrVal130135140LeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrplieArgThrProProAla145150155160TyrArgProProAsnAlaProlieLeuSerThrLeuProGluThrThr165170175ValValArgArgArgGlyArgSerProArgArgArgThrProSerPro180185190ArgArgArgArgSerGlnSerProArgArgArgArgSerGlnSerArg195200205GluSerGlnCys210<210>3<211>1317LysGinTyrLeuAsnLeuTyrProValAlaArg385390395CysGinValPheAlaAspAlaThrProThrGly405410GlyHisArgArgLeuArgGlyThrPheValAla420425ThrAlaGluLeuLeuGlylie435<210>5<211>52<212>DNA<213>VR-正向5’引物的核苷酸序列<400>5ggtgctgaagaattgctagcttaattaaggccggccaccg<210>6<211>22<212>DNA<213>VR-反向5’引物的核苷酸序列<400>6tggccggccttaattaagctag<210>7<211>27<212>DNA<213>VR2012-PF正向引物的核苷酸序列<400>7agtcgagctagcgccatgttgacattg<210>8<211>29<212>DNA<213>VR2012反向引物的核苷酸序列<400>8ttaaccaccggtaattcttcagcacctggArgSerGlyLeu400GlyLeuAlalie415LeuProlieHis4302227291權利要求一種乙肝病毒雙表達質(zhì)粒，其特征在于，其包括真核細胞表達載體VR1012上插入核苷酸序列的乙肝病毒前C-C基因和自身復制調(diào)控元件增強子II以及含調(diào)控序列的乙肝病毒前S-S基因和自身復制調(diào)控元件增強子I。2.—種乙肝病毒雙表達質(zhì)粒的構建方法，其步驟如下首先以血清中的HBVDNA為模板，用套式PCR分別擴增出乙肝病毒增強子II/前C-C基因或增強子1/前S-S基因，然后通過基因克隆連入真核表達載體VR1012，克隆篩選得到單表達質(zhì)粒VEC和VES；采用單引物二次PCR法突變VES，在調(diào)控表達單元下游插入酶切位點，PCR擴增VEC中完整的調(diào)控和表達單元并克隆到突變后的VES中，克隆篩選得到利用各自的啟動子分別表達前C-C和前S-S的雙表達質(zhì)粒。3.根據(jù)權利要求2所述的乙肝病毒雙表達質(zhì)粒的構建方法，其特征在于所述的單引物二次PCR法為點突變，第一輪PCR，加入正向單引物擴增，得到少量變異鏈；第二輪PCR，加入反向單引物，反向單引物序列與正向變異鏈互補。4.根據(jù)權利要求2或3所述的乙肝病毒雙表達質(zhì)粒的構建方法，其特征在于所述的單引物二次PCR法突變VES，首先合成1對引入插入突變的引物，插入NheI、PacI、FseI和AgeI酶切位點，VR-正向和VR-反向；進行第一輪PCR:以VES質(zhì)粒為模板，加入正向引物VR-正向，PCR擴增；再進行第二輪PCR:以第一輪PCR反應產(chǎn)物為模板，加入反向引物VR-反向，PCR擴增；然后對PCR產(chǎn)物進行選擇性酶切，轉(zhuǎn)化細菌后克隆篩選得到突變VES基因。5.根據(jù)權利要求2所述的乙肝病毒雙表達質(zhì)粒的構建方法，其特征在于所述的PCR擴增VEC，以含NheI酶切位點的VR2012-PF為正向引物、含AgeI酶切位點的VR2012-PR為反向引物。6.一種乙肝病毒雙表達質(zhì)粒的構建方法，其步驟如下首先以血清中的HBVDNA為模板，用套式PCR分別擴增出乙肝病毒增強子II/前C-C基因和增強子1/前S-S基因，然后通過基因克隆連入真核表達載體VR1012，克隆篩選得到單表達質(zhì)粒VEC和VES；采用單引物二次PCR法突變VEC，在調(diào)控表達單元下游插入酶切位點，PCR擴增VES中完整的調(diào)控和表達單元并克隆到突變后的VEC中，克隆篩選得到利用各自的啟動子分別表達前C-C和前S-S的雙表達質(zhì)粒。7.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的乙肝病毒雙表達質(zhì)粒在預防和治療乙型肝炎基因疫苗中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種乙肝病毒雙表達質(zhì)粒及其構建方法，首先分別以乙肝病毒前C-C基因/自身復制調(diào)控元件增強子II、乙肝病毒前S-S基因/自身復制調(diào)控元件增強子I為目的基因，使用真核表達載體VR012，構建乙肝ENHII/前C-C基因疫苗重組質(zhì)粒VEC和ENHI/前S-S基因疫苗重組質(zhì)粒VES；然后采用單引物二次PCR法，突變VES重組質(zhì)粒，在表達調(diào)控單元下游插入酶切位點；最后利用插入的酶切位點，PCR擴增VEC重組質(zhì)粒的調(diào)控和表達單元，酶切重組到突變后的VES質(zhì)粒中，得到2個啟動子分別調(diào)控表達乙肝病毒前C-C基因和前S-S基因的雙表達質(zhì)粒做為DNA疫苗。該重組HBVDNA疫苗能有效地表達乙肝表面抗原和核心抗原，可用于乙型肝炎的預防和治療。文檔編號A61K39/29GK101824430SQ20091007930公開日2010年9月8日申請日期2009年3月5日優(yōu)先權日2009年3月5日發(fā)明者侯俊,張敏,欒翔玲,沈宏輝,王志杰,王福生,白冰珂,胡燕,貌盼勇,赫兢,辛紹杰申請人:中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院