專利名稱：具有免疫激活作用的pUCpGs質(zhì)粒及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有免疫激活作用的質(zhì)粒，具體涉及一系列具有不同CpG基序的質(zhì)粒pUCpGs，還涉及其制備方法及在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在人類和動(dòng)物與疾病抗?fàn)幹?，機(jī)體免疫系統(tǒng)，無論是天然免疫還是獲得性免疫都發(fā)揮著重要作用。反之，如機(jī)體因某種原因，如先天性或獲得性免疫缺陷病，免疫力低下時(shí)，機(jī)體就可能罹患各種感染性疾病和癌癥發(fā)生等。疫苗是人類發(fā)明的用于預(yù)先激活機(jī)體對(duì)某些特定致病因子適應(yīng)性免疫反應(yīng)的方法，已為人類消滅了天花的肆虐及即將消滅小兒麻痹癥等。但對(duì)于免疫力低下的個(gè)體，疫苗接種也往往不能獲得預(yù)期的效果。因此，一種能有效地激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)的制劑是人們一直所期盼和致力研究的。這無論對(duì)預(yù)防疾病發(fā)生或在輔助疫苗接種上，都可能起到事半功倍的效用。
能起到免疫增強(qiáng)或作為疫苗免疫佐劑作用的制劑已有很多，但還存在著諸多問題。如弗氏完全佐劑雖在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得滿意的結(jié)果，但由于其毒性較大，尚難作為人用免疫佐劑；而目前唯一已用作人用疫苗佐劑的鋁凝膠制劑，雖在以往細(xì)胞外病原微生物疫苗中發(fā)揮了重要作用，但其主要以激活機(jī)體TH2免疫和抗體分泌為主，對(duì)以激發(fā)機(jī)體CTL活性為要旨的當(dāng)前大多數(shù)疫苗(如HIV，HCV)的研究無能為力，甚至?xí)鸬较喾吹淖饔?。因此，這是目前亟待解決的一個(gè)熱點(diǎn)問題，也是本專利試圖解決的問題。
早在1890年人們就觀察到給癌癥患者注射細(xì)菌粗提制劑可使腫瘤明顯消退，但當(dāng)時(shí)并不知道其作用機(jī)制。直到上世紀(jì)80年代，在希望提取卡介苗(BCG)中的有效抗癌組分時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌體中真正起作用的是核酸。且進(jìn)一步用核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶降解研究表明，這種作用是來自菌體中的脫氧核糖核酸DNA(Tokunaga T，Yamamoto H，Shimada S，et al.Antitumoractivity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG.I.Isolation，physicochemical characterization，and antitumor activity.J Natl CancerInst，1984；72(4)，955-962)。研究還發(fā)現(xiàn)微生物基因序列的片段或按其序列合成的寡脫氧核苷酸(Tokunaga T，Yamamoto S，Namba K.A syntheticsinglestranded DNA，Poli(dG，dC)，induces interferon-alpha/beta and gamma，augments natural killer activity，and suppresses tumor growth.Jpn J Cancer Res，1988，79(6)682-686)也具有免疫調(diào)節(jié)活性。深入研究發(fā)現(xiàn)，凡具免疫激活作用的寡核苷酸中都存在未甲基化的-CG-二核苷酸。這種二核苷酸序列廣泛存在于細(xì)菌等微生物的基因組中，而在哺乳動(dòng)物基因組中卻很少出現(xiàn)，或即使出現(xiàn)而其中的胞嘧啶核苷(C)也常已被甲基化(Tokunaga T，Yano O，KuramotoE，et al.Synthetic oligonucleotides with particular base sequences from the cDNAencoding proteins of Mycobacterium bovis BCG induce intefereon and activatenatural killer cells.Microbiol Immunol.1992，36(1)55-66)。象CpG這類病原生物所特有的分子結(jié)構(gòu)，稱為病原相關(guān)分子模式(PAMP)。與此相適應(yīng)，動(dòng)物機(jī)體在長期進(jìn)化過程中也已發(fā)展了一種專門識(shí)別這種特定分子的受體，稱為模式識(shí)別受體(PRR)。病原生物一旦入侵并為這種固有的受體識(shí)別，就可在第一時(shí)間很快激發(fā)機(jī)體的天然免疫答應(yīng)；與此同時(shí)，這種天然免疫反應(yīng)也為進(jìn)一步的適應(yīng)性(或獲得性)免疫應(yīng)答，即T細(xì)胞和B細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)作好了準(zhǔn)備。
有關(guān)CpG的作用目前已有很多研究，現(xiàn)就其作用特點(diǎn)介紹如下1、CpG的結(jié)構(gòu)與分類所謂具有免疫活性的CpG，應(yīng)是具有未甲基化-CG-二核苷酸序列的一段寡脫氧核苷酸(CpG ODN)。其最基本的結(jié)構(gòu)除了-CG-二核苷酸序列外，在其兩側(cè)還應(yīng)有各兩個(gè)核苷酸，其通式為“X1-X2-C-G-Y1-Y2”，其中X1可為兩個(gè)嘌呤堿核苷酸中任何一個(gè)(A或G)，X2可為A、G或T，而其中Y1和Y2可為兩個(gè)嘧啶堿核苷酸中任何一個(gè)(C或T)。這樣應(yīng)可有24種不同的六核苷酸序列。此外，在六核苷酸序列兩側(cè)翼的序列對(duì)CpG的活性也有影響。為了延長CpG ODN的生物半衰期和活性，在人工合成的ODN中常摻入硫代堿基和寡聚“G”序列等，因此CpG ODN的種類是多種多樣的。目前根據(jù)CpG ODN結(jié)構(gòu)和對(duì)免疫系統(tǒng)作用的差異，一般可分為A、B、C三類CpG-A主要為合成的ODN，序列中含有硫代堿基，兩側(cè)翼具有寡聚G，主要可激活pDC和NK細(xì)胞使分泌IFN-alpha；CpG-B是B細(xì)胞的強(qiáng)烈激動(dòng)劑；而CpG-C則間于二者之間，對(duì)pDC和B細(xì)胞均有一定的激活作用(BoothJS，Nichani AK，Benjamin P，et al.Innate immune responses induced by classesof CpG oligodeoxy-nucleotides in ovine lymph node and blood mononuclear cells.Vet Immunol Immunopathol.2007 Jan 15；115(1-2)24-34)。
2、CpG的種、個(gè)體和組織器官差異性目前已知，CpG不但在不同種類的哺乳動(dòng)物具有免疫激活作用，而且在禽類(Nichani AK，Mena A，KaushikRS，et al.Stimulation of innate immune responses by CpG oligodeoxynucleotidein newborn lambs can reduce bovine herpesvirus-1 shedding.Oligonucleotides.2006 Spring；16(1)58-67.)、甚至魚類(Shen KY，Hogstrand C，Davies DH.Anewly identified CpG oligodeoxynucleotide motif that stimulates rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)immune cells to produce immunomodulatory factors.DevComp Immunol.2006；30(3)311-24.Epub 2005 Jun 15.)也具有免疫激活作用。研究還表明，不同物種具有免疫激活作用的最適CpG ODN基序是不盡相同的。而且在同一物種，個(gè)體之間也是存在差異的，有人用篩選獲得具有強(qiáng)免疫活性的11種不同CpG對(duì)來自100個(gè)正常人的外周血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沒有一個(gè)人的PBMC可以對(duì)所有的11種CpG都發(fā)生反應(yīng)，也沒有一種CpG可以對(duì)所有人的PBMC起激活作用。另外，即使對(duì)同一個(gè)體，不同的給藥途徑，可能作用于不同的細(xì)胞，CpG所起的免疫激活作用也是不同的，如Wingender G等發(fā)現(xiàn)局部注射富含CpG的DNA可以激發(fā)免疫反應(yīng)，而改用系統(tǒng)給藥則反而引起免疫抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)給藥時(shí)可在脾細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生吲哚胺二氧化酶(IDO)，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的免疫活性(Wingender G，Garbi N，Schumak B，et al.Systemic application of CpG-richDNA suppresses adaptive T cell immunity via induction of IDO.Eur J Immunol.2006 Jan；36(1)12-20.)。
3、CpG的受體及其作用機(jī)制目前已明確CpG ODN的受體是TLR9(Tolllike receptor-9)，這是定位于細(xì)胞內(nèi)體囊膜的受體。因此CpG要起作用首先必須要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的區(qū)間。就天然感染而言，入侵組織的病原微生物首先為組織細(xì)胞(特別是樹突狀細(xì)胞DCs)吞噬，在內(nèi)體酸性環(huán)境和酶的作用下，微生物降解并釋放出基因DNA及其含有CpG基序的ODN片段，這樣才能和定位于內(nèi)體囊膜上的TLR9結(jié)合，再通過細(xì)胞內(nèi)MyD88依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，激活核轉(zhuǎn)錄因子(NFKB)，進(jìn)而使細(xì)胞激活分泌一系列的免疫相關(guān)細(xì)胞因子(IFN-alpha，IL-12等)，以及表達(dá)MHC I、II類分子和免疫輔助因子(CD80，CD86)等。細(xì)胞因子可對(duì)微生物直接作用，MHC及輔助因子表達(dá)為特異性免疫反應(yīng)創(chuàng)造了條件。能促進(jìn)免疫活性細(xì)胞向組織遷移、促進(jìn)CpG ODN進(jìn)入組織細(xì)胞的各種因素，以及能增加細(xì)胞TLR9表達(dá)的因素，也都可以增強(qiáng)CpG的免疫活性作用。
4、寡核苷酸的體內(nèi)不穩(wěn)定性O(shè)DN在體內(nèi)極不穩(wěn)定，半衰期大約只有5分鐘。因此，合成的小片段CpG在和受體結(jié)合前，就可能已被完全降解。目前在合成CpG研究中，常引入硫代堿基以避免脫氧核酸酶的攻擊，能延長半衰期至30-60分鐘，在序列兩側(cè)增加寡聚“G”以增加細(xì)胞的攝取(Farman CA，Kornbrust DJ.Oligodeoxynucleotide studies in primatesantisense and immunestimulatory indications，Toxicol Pathol.2003，31(suppl)119-122)。這雖可增加合成CpG的活性，但這種非天然堿基的引入，也增加了其對(duì)機(jī)體作用的復(fù)雜性。最近有人工合成含有5個(gè)相同CpG(-AGCGTG-)基序的合成寡脫氧核苷酸，將其插入pBluescript II KS(-)質(zhì)粒，并重復(fù)插入至最多達(dá)20個(gè)相同CpG(-AGCGTG-)基序的質(zhì)粒。以這種重組質(zhì)粒作為DNA疫苗的佐劑，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒中的CpG同樣具有免疫佐劑作用(Kojima Y，Xin KQ，Ooki T，etal.Adjuvant effect of multi-CpG motifs on an HIV-1 DNA vaccine.Vaccine.2002Jul 26；20(23-24)2857-65.)，且隨著插入的CpG基序增加，免疫促進(jìn)作用也增強(qiáng)?？梢姡珻pG的質(zhì)粒不失為一種有應(yīng)用前景的好方法。但該項(xiàng)研究中只具有一種CpG(-AGCGTG-)基序，這顯然還不能滿足生物及CpG種類多樣性的問題。
5、CpG免疫激活的作用特點(diǎn)和應(yīng)用大量研究已表明，CpG起著良性免疫調(diào)節(jié)作用，主要在于激發(fā)機(jī)體的Th1細(xì)胞因子分泌和CTL免疫活性，而且可以使原先以TH2為主的免疫反應(yīng)向TH1為主的方向轉(zhuǎn)化。這正可彌補(bǔ)目前人用佐劑(鋁凝膠)以激發(fā)TH2為主的不足。已有研究證明CpG和鋁凝膠佐劑合用，可以起到協(xié)同作用和使TH1/TH2免疫反應(yīng)平衡(Rankin R，Pontarollo R，Gomis S，et al.CpG-containing oligodeoxynucleotides augment andswitch the immune responses of cattle to bovine herpesvirus-1 glycoprotein D.Vaccine.2002，26；20(23-24)3014-22.)。除了用作疫苗的免疫佐劑，CpG的這一作用特點(diǎn)，近年來已有很多直接用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療方面的研究。如Nichani等用新生羊羔實(shí)驗(yàn)證明，CpG激發(fā)的天然免疫反應(yīng)，對(duì)牛型皰疹病毒的感染有保護(hù)作用(Nichani AK，Mena A，Kaushik RS，et al.Stimulation ofinnate immune responses by CpG oligodeoxynucleotide in newborn lambs canreduce bovine herpesvirus-1 shedding. Oligonucleotides. 2006Spring；16(1)58-67.)。CpG可以保護(hù)正常獼猴，甚至還可以保護(hù)SIV感染獼猴，免受利什曼原蟲的致命性感染(Verthelyi D，Gursel M，Kenney RT，et al.CpG oligodeoxynucleotides protect normal and SIV-infected macaques fromLeishmania infection.J Immunol.2003，170(9)4717-4723)。此外，CpG的這種作用還可用以抗過敏性反應(yīng)(Lee SY，Cho JY，Miller M，et al.Immunostimulatory DNA inhibits allergen-induced peribronchial angiogenesis inmice.J Allergy Clin Immunol.2006 Mar；117(3)597-603)。因?yàn)槟苣孓D(zhuǎn)Th2免疫反應(yīng)，可以抑制IL-4，IL-10等的分泌，進(jìn)而抑制IgE的分泌和過敏性反應(yīng)，因此，已有用于研究哮喘等動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)性治療研究。
此外，合成CPG7079等已有多篇用于臨床研究的報(bào)道，均證明CpG ODN對(duì)人類是安全的，并未發(fā)現(xiàn)人類不能耐受的副作用(Cooper CL，Davis HL，Morris ML，et al.CPG 7909，an immunostimulatory TLR9 agonistoligodeoxynucleotide，as adjuvant to Engerix-B HBV vaccine in healthy adultsadouble-blind phase I/II study.J Clin Immunol.2004 Nov；24(6)693-701.)。再則，DNA用作基因治療、反義核酸和核酸疫苗等研究也已有較長的歷史和較多臨床研究報(bào)道。所以用DNA，無論是人工合成的ODN，還是重組的DNA質(zhì)粒，在人體應(yīng)用都不應(yīng)該存在不可逾越的障礙。
根據(jù)以上分析我們可以知道CpG ODN是一類非常有效的免疫調(diào)節(jié)劑，既可用作疫苗的免疫佐劑，同時(shí)又可通過免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)感染性疾病、過敏性疾病以及癌癥患者的預(yù)防和免疫治療，有著廣闊的應(yīng)用前景。然而CpGODN的體內(nèi)不穩(wěn)定性，CpG序列的多樣性，再有其作用具有物種和個(gè)體差異性等特點(diǎn)，又嚴(yán)重影響了對(duì)其的深入研究和進(jìn)一步的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述問題，本發(fā)明公開的具有免疫激活作用的質(zhì)粒pUCpGs，是在pUC19的基礎(chǔ)上，插入一個(gè)或多個(gè)免疫激活單位DNA序列Multi-CpG，Multi-CpG的序列如序列表中序列12所示。免疫激活單位DNA序列Multi-CpG是由經(jīng)篩選的11個(gè)CpG ODN片段首尾相連而成，各CpG ODN片段的DNA序列如序列表中序列1-11所示。
本發(fā)明具有免疫激活作用的質(zhì)粒pUCpGs，是通過以下方法制備的1、CpG ODN的篩選查閱了大量有關(guān)CpG ODN實(shí)驗(yàn)研究的文獻(xiàn)資料，尤其用人和人免疫活性細(xì)胞進(jìn)行的研究，以及用靈長類動(dòng)物為模型的研究資料，從中選擇免疫激活作用較為確切的11個(gè)CpG ODN片段，如序列表中序列1-序列11所示序列1TCGTCGAACGTTCGAGATGAT序列2ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACG
序列3ACCGATGTCGTTGCGGTGACG序列4TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG序列5TGACTGTGAACGTTCGAGA序列6TCGTTTTGTCGTT序列7ACCGATAACGTCGCCGGTGACGGCACCACG序列8AGCAGCGTTCGTGTCGGCCT序列9CTGGCGTAGCGCCTCGGGCCT序列10TGACTCGTTCGTGTCGCATG序列11ATCGACTCTCGAGCGTTCTC在這11個(gè)片段中，每個(gè)片段中均含有2個(gè)或2個(gè)以上的-CG-二核苷酸序列(總-CG-二核苷酸達(dá)40余處，見序列中有下劃線部分)。
2、序列連接和合成把所選的CpG ODNs首尾相連成一個(gè)含有237 bp的脫氧核糖核酸序列，在這里命名為Multi-CpG，如序列表中序列12所示。
根據(jù)Multi-CpG的序列，可以設(shè)計(jì)引物并在Multi-CpG序列的5’和3’端分別引入核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(5’端EcoR I，3’端Xba I)便于和載體連接。序列交由有關(guān)生物公司合成。用PCR擴(kuò)增法合成兩端帶有酶切點(diǎn)的雙鏈Multi-CpG。
3、質(zhì)粒pUCpGs的構(gòu)建選擇市售高拷貝質(zhì)粒載體pUC19為克隆載體。合成Multi-CpG片段和pUC19進(jìn)行雙酶切(EcoR I和Xba I)連接?？梢垣@得含有一個(gè)Multi-CpG序列的質(zhì)粒pUCpGs01。
為了極大限度地增加在質(zhì)粒中CpG ODN的含量，設(shè)計(jì)了正向(GF)反向(GR)兩條通用引物，引入酶切位點(diǎn)Spe I和Hind III，二引物分別和Multi-CpG序列的5’端序列，以及pUC19中Hind III酶切點(diǎn)處的序列相匹配，它們是GFGC ACTAGT TCGTCGAACGTTCGA，見序列表中序列13GRGC AAGCTT GCATGCCTGCAGGTC，見序列表中序列14這樣的引物可以從新構(gòu)建的質(zhì)粒pUCpGs01中擴(kuò)增出序列兩端含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的，并含有全部Multi-CpG序列及質(zhì)粒載體中(從Xba I至于HindIII)之間序列的片段，這里命名為Multi-CpG+。由于Spe I酶切點(diǎn)和Xba I酶切點(diǎn)具有相同粘性末端-CTAG-，因此，經(jīng)兩端酶(Spe I和Hind III)消化后，可以和pUCpGs01質(zhì)粒經(jīng)Xba I和Hind III雙切后的質(zhì)粒連接，形成含有兩個(gè)Multi-CpG的質(zhì)粒pUCpGs02。由于Xba I和Spe I酶切位點(diǎn)間相連后不能再為這兩個(gè)酶切割，所以新獲得的pUCpGs02還可以按上法酶切后再與Multi-CpG+片段連接，形成含有3個(gè)Multi-CpG的質(zhì)粒pUCpGs03。以此類推，可以構(gòu)建一系列含不同個(gè)數(shù)Multi-CpG序列的pUCpGs質(zhì)粒。
質(zhì)粒pUC系列為高拷貝質(zhì)粒，因此，很容易通過轉(zhuǎn)化受體菌，再通過大量細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒抽提，大量制備質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究其免疫活性奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明公開了具有多個(gè)不同CpG ODN序列的重組質(zhì)粒，將不同的CpGODN串連在一起，以克服CpG多樣性和個(gè)體差異性帶來的問題。同時(shí)，質(zhì)粒在體內(nèi)可有較高的穩(wěn)定性，也可增加組織細(xì)胞對(duì)其攝取以增加其和受體結(jié)合并激活免疫活性細(xì)胞的機(jī)會(huì)，以使CpG能最大限度地發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明的質(zhì)?？捎糜谝呙缑庖咦魟部捎糜诟腥?、癌癥和過敏性疾病的免疫治療。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地描述

圖1重組pUCpGs01質(zhì)粒構(gòu)建示意2重組pUCpGs01質(zhì)粒鑒定圖a.PCR鑒定圖圖中1、2、3、4、5、6、7、8、9為挑取的菌落編號(hào)b.重組pUCpGs01質(zhì)粒測(cè)序鑒定3重組pUCpGs系列質(zhì)粒構(gòu)建示意4多拷貝Multi-CpG系列重組質(zhì)粒電泳鑒定a不同拷貝數(shù)Multi-CpG質(zhì)粒的電泳鑒定圖b不同拷貝數(shù)Multi-CpG質(zhì)粒PCR酶切鑒定圖(EcoR I，Hind III)(圖中數(shù)字為相應(yīng)泳道的Multi-CpG的拷貝數(shù))圖5重組pUCpGs系列質(zhì)粒示意6重組pUCpGs10質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例只是用于解釋本發(fā)明，而不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1pUCpGsx的構(gòu)建的材料與方法材料1.質(zhì)粒、菌株克隆載體PUC19載體購自大連寶生物公司；大腸桿菌DH5α為本室保存。
2.工具酶與試劑盒DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、DL5000購自大連寶生物公司；T4DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品；普通Taq DNA聚合酶試劑盒為上海生工生物公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自博大泰克生物公司。
3.試劑與抗體DNA電泳用瓊脂糖購自Promega公司；氨芐青霉素針劑為華北制藥有限公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
方法1.CPG ODN序列的選擇查閱了大量有關(guān)CpG ODN實(shí)驗(yàn)研究的文獻(xiàn)資料，尤其用人和人免疫活性細(xì)胞進(jìn)行的研究，以及用靈長類動(dòng)物為模型的研究報(bào)道資料，選擇免疫激活作用較為確切的11個(gè)CpG ODN片段，如序列表中序列1-11所示。把所選的CpG ODNs首尾相連成一個(gè)含有237bp的脫氧核糖核酸序列，命名為Multi-CpG，具體序列如序列表中序列12所示。
2.Multi-CpG合成2.1DNA片段合成引物的設(shè)計(jì)根據(jù)序列表中序列12所示(237bp)，分兩段(1～138和100～237)分別設(shè)計(jì)前、后片段合成所需引物，見序列表中序列15-26序列aF3 GCGAATTCTCGTCGAACGTTCGAGATGATACCGATG，序列15aF2AGATGATACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGA，序列16aF1TGACGGCACCACGACCGATGTCGTTGCGGTGACGTCGT，序列17aR1CAGTCACGGAGCGCTTCGAAAACGACGACGTCACCGCA，序列18aR2CGACAAAACGATCTCGAACGTTCACAGTCACGGAGCGC，序列19aR3 GACGTTATCGGTAACGACAAAACGATCT，序列20abF3 GTGAACGTTCGAGATCGTTTTGTCGTTA，序列21bF2TCGTTTTGTCGTTACCGATAACGTCGCCGGTGACGGCA，序列22bF1CGCCGGTGACGGCACCACGAGCAGCGTTCGTGTCGGCC，序列23bR1CAAGGCCCGAGGCGCTACGCCAGAGGCCGACACGAACG，序列24bR2GTCGATCATGCGACACGAACGAGTCAAGGCCCGAGGCG，序列25bR3 GCTCTAGAGAGAACGCACGAGAGTCGATCATGCGAC，序列26b其中a為前片段(5’端)序列合成引物，b為后片段(3’端)序列合成引物(a、b兩組引物中斜體字型部分為引入的酶切位點(diǎn)，下劃線部分為上下引物重疊或互補(bǔ)的部分)，a、b均由三組正(F)反(R)向引物組成，并在前片段的5’端引入酶切位點(diǎn)EcoR I(GAATTC)，后片段的3’端引入XbaI(TCTAGA)，便于插入克隆載體pUC19。基因片段序列設(shè)計(jì)后均委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。
2.2 PCR法獲得Multi-CpG前后片段采用中心模板法分三步PCR合成目的片段(前后片段同時(shí)進(jìn)行)第一步在PCR擴(kuò)增管中，依次加入H2O 40μl，10×PCR Buffer 5μl，分別加入兩組基因合成的一對(duì)基因片段(20pmole/μl)F1、R1各1μl，10mmol/L4dNTP 1μl，2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl，混勻，1000rpm離心30秒，然后放入PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp PCR System 2400)中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃ 1分鐘，94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，5個(gè)循環(huán)后再72℃延伸1分鐘。
第二步以第一步的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。即在PCR擴(kuò)增管中，依次加入H2O 40μl，10×PCR Buffer 5μl，兩組20pmole/μl引物F2、R2各1μl，第一步PCR產(chǎn)物1μl，10mmol/L 4 dNTP 1μl，2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl，混勻，1000rpm離心30秒，然后放入PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃ 1分后，94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分，30個(gè)循環(huán)后再72℃延伸5分鐘。
第三步以第二步的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。即在PCR擴(kuò)增管中，依次加入H2O 40μl，10×PCR Buffer 5μl，兩組20pmole/μl引物F3、R3各1μl，第二步PCR產(chǎn)物1μl，10mmol/L 4 dNTP 1μl，2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl，混勻，1000rpm離心30秒，然后放入PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃1分鐘，94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分，30個(gè)循環(huán)后再72℃延伸5分鐘。
2.3前后相連合成兩端帶有酶切點(diǎn)的Multi-CpG以第三步的PCR產(chǎn)物5’端(前片段)序列合成引物經(jīng)PCR擴(kuò)增延伸后獲得的序列(如序列表中序列27所示)和3’端(后片段)序列合成引物經(jīng)PCR擴(kuò)增延伸后獲得的序列(如序列表中序列28所示)互為模板(引物)進(jìn)行擴(kuò)增延伸。即在PCR擴(kuò)增管中，依次加入H2O 40μl，10×PCR Buffer 5μl，混合第三步所得的兩組PCR產(chǎn)物各1μl，10mmol/L 4 dNTP 1μl，2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl，混勻，1000rpm離心30秒，然后放入PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃ 1分鐘，94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，5個(gè)循環(huán)后再72℃延伸1分鐘。
取出上步的PCR擴(kuò)增管，在其中加入第一組的正向引物aF3，第二組的反向引物bR3，混勻，1000rpm離心30秒，然后放入PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃ 1分后，94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1分，30個(gè)循環(huán)后再72℃延伸5分鐘，獲得兩端帶有酶切點(diǎn)的Multi-CpG序列，如序列表中序列29所示。
2.4 PCR產(chǎn)物的純化與回收按照北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”說明書將上述2.3步的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作步驟如下PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下目的條帶所在的膠塊，按100μg/650μl溶膠液比例加入溶膠液，55℃溶膠；a溶解的膠液全量移入吸附柱，12000rpm，離心1min；b棄去回收管中廢液，加入500μl漂洗液，12000rpm，離心1min；
c重復(fù)步驟c一次后，棄去回收管中廢液，12000rpm，離心2min徹底棄除廢液；d將吸附柱放入一干凈的離心管中，在吸附膜的中央加入30μl洗脫液，室溫靜置5min；12000rpm，離心1min，收集洗脫液，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 3. pUCpGs01質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化pUCpGs01質(zhì)粒構(gòu)建方法如示意圖(圖1)進(jìn)行，具體操作分以下三步3.1 PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒載體PUC19雙酶切取以上純化的PCR產(chǎn)物及PUC19質(zhì)粒載體各30μl分別放于Eeppendorf離心管中，各加入10×buffer(H)4μl、EcoR I(10u/μl)和Xba I(10u/μl)各1μl，加滅菌蒸餾水至40μl，置37℃水浴酶切過夜。
酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳純化和回收酶切過夜的PCR產(chǎn)物及載體PUC19純化回收，操作按照北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”說明書進(jìn)行，具體操作步驟參見2.4。
3.2連接于滅菌Eeppendorf離心管中加入上述純化回收后的酶切載體PUC19及PCR產(chǎn)物(Multi-CpG)各1μl、10×T4 DNA Ligase buffer 1μl、T4 DNALigase(12u/μl)1μl，加滅菌蒸餾水至10μl，置16℃過夜。
3.3轉(zhuǎn)化在超凈工作臺(tái)中，用無菌吸頭取100μl感受態(tài)細(xì)胞(E.coli DH5α)(感受態(tài)細(xì)胞按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第三版)的方法進(jìn)行)懸液于Eppendorfl中，加入上述連接物5μl，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30分鐘。立即轉(zhuǎn)移到42℃水浴中放置2分鐘，冰浴2分鐘。每管加入0.5ml LB培養(yǎng)基(不加抗生素)，30℃水浴搖床培養(yǎng)60分鐘后，各取0.2ml分別涂于LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上(含抗生素)，室溫晾干后，置37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜，待轉(zhuǎn)化菌生長。
4 pUCpGs01質(zhì)粒的篩選與鑒定4.1菌落PCR鑒定為了能從構(gòu)建的質(zhì)粒上擴(kuò)增出帶有Multi-CpG全長和部分pUC 19序列的片段，進(jìn)行質(zhì)粒的PCR鑒定和后系列質(zhì)粒的構(gòu)建，設(shè)計(jì)了兩條通用引物1)GFGCACTAGTTCGTCGAACGTTCGA引入酶切位點(diǎn)Spe I，和Multi-CpG序列的5’端匹配，如序列表中序列13所示。
2)GRGCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTC引入酶切位點(diǎn)Hind III并和質(zhì)粒pUC19 Hind III酶切點(diǎn)及其附近序列匹配，如序列表中序列14所示。在上述LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上，用無菌牙簽挑取9個(gè)白色單克隆菌落，分別接種于含3ml LB(Amp+)試管中，37℃搖床培養(yǎng)8小時(shí)后，取1μl做模板，加入通用引物各1μl，10×PCR緩沖液2.5μl，4×dNTPs 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，反應(yīng)體系為25μl，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件同前。在1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2a所示。由圖可以看出，其中菌落1、2、5、7、9中均可以擴(kuò)增出約340bp左右片段，說明質(zhì)粒pUCpGs01質(zhì)粒構(gòu)建成功并已轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中。
4.2 DNA序列鑒定挑取經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的單克隆菌，提取質(zhì)粒DNA，用pUC19通用引物在ABI PRISMTM 377XL DNA全自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序，測(cè)序工作由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司承擔(dān)。測(cè)序結(jié)果見圖2b，如序列表中序列12所示，證明插入序列和設(shè)計(jì)序列一致。
4.3質(zhì)粒的提取測(cè)序正確的pUCpGs01菌液過夜培養(yǎng)，按照北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司的質(zhì)粒快速提取試劑盒產(chǎn)品說明書提取質(zhì)粒，具體操作步驟如下a.收集1.5ml過夜培養(yǎng)的菌液沉淀，加入100μl溶液1，振蕩至徹底懸浮；b.加入150μl溶液2，輕輕顛倒混勻，使菌體充分裂解；c.加入150μl溶液3，輕輕顛倒混勻，室溫放置5分鐘；4℃/12,000rpm離心12min；d.將上清與420μl結(jié)合緩沖液混勻，共同移入吸附柱，室溫/12,000rpm離心1min；e.倒掉廢液，加入750μl漂洗液，12,000rpm離心1min，重復(fù)一次；f.再次12,000rpm離心2min，盡量去除漂洗液；g.將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中央加入50μl無菌水，室溫靜置2-5min；12,000rpm離心2min，收集洗脫液，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 5.PUCpGs系列質(zhì)粒的構(gòu)建PUCpGs系列質(zhì)粒是在已構(gòu)建的質(zhì)粒pUCpGs01的基礎(chǔ)上進(jìn)行，簡言之是以上述設(shè)計(jì)的通用引物(GF，GR)，從pUCpGs01中擴(kuò)增出Multi-CpG+片段，此片段經(jīng)Spe I和Hind III酶切后，可以反復(fù)地插入經(jīng)Xba I和Hind III酶切后的質(zhì)粒pUCpGs01，及其后續(xù)質(zhì)粒中pUCpGs02、pUCpGs03......中，如圖3所示，具體方法如下5.1 Multi-CpG+的PCR擴(kuò)增在PCR擴(kuò)增管中，依次加入H2O 40μl，10×PCR Buffer 5μl，分別加入上述設(shè)計(jì)的GF、GR通用引物(20pmole/μl)各1μl，10mmol/L 4dNTP 1μl，模板pUCpGs01質(zhì)粒0.5μl，2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl，混勻，1000rpm離心30秒，然后放入PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp PCR System 2400)中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為95℃5分鐘，95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)后再72℃延伸5分鐘。
PCR產(chǎn)物的純化與回收按照北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”說明書將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作步驟如下PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下目的條帶所在的膠塊，按100μg/650μl溶膠液比例加入溶膠液，55℃溶膠；溶解的膠液全量移入吸附柱，12000rpm，離心1min；棄去回收管中廢液，加入500μl漂洗液，12000rpm，離心1min；重復(fù)步驟上述步驟一次后，棄去回收管中廢液，12000rpm，離心2min徹底棄除廢液；將吸附柱放入一干凈的離心管中，在吸附膜的中央加入30μl洗脫液，室溫靜置5min；12000rpm，離心1min，收集洗脫液，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 5.2酶切純化的PCR產(chǎn)物Multi-CpG+和測(cè)序正確的pUCpGs01重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，37℃水浴過夜，反應(yīng)體系如下取純化的PCR產(chǎn)物Multi-CpG+30ul放于Eeppendorf離心管中，加入10×buffer(H)5μl、Spe I(10u/μl)和Hind III(10u/μl)各1μl，加滅菌蒸餾水至50μl，置37℃水浴酶切過夜。
取測(cè)序正確的pUCpGs01重組質(zhì)粒30μl放于Eeppendorf離心管中，加入10×buffer(H)5μl、Xba I(10u/μl)和Hind III(10u/μl)各1μl，加滅菌蒸餾水至50μl，置37℃水浴酶切過夜。
5.3酶切產(chǎn)物的回收、連接和轉(zhuǎn)化回收酶切過夜的Multi-CpG+和pUCpGs01回收純化，操作按照北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司的“PCR片斷快速膠回收試劑盒”說明書進(jìn)行，具體操作步驟參見2.4。
連接于滅菌Eeppendorf離心管中加入上述酶切后的Multi-CpG+6μl，pUCpGs01 2μl、10×T4 DNA Ligase buffer 1μl、T4 DNA Ligase(12u/μl)2μl，加滅菌蒸餾水至20μl，置16℃過夜。
轉(zhuǎn)化在超凈工作臺(tái)中，用無菌吸頭取100μl感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)細(xì)胞按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第三版)的方法進(jìn)行)懸液于Eppendorfl中，加入上述連接物5μl，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30分鐘。立即轉(zhuǎn)移到42℃水浴中放置2分鐘，冰浴2分鐘。每管加入0.5ml LB培養(yǎng)基(不加抗生素)，30℃水浴搖床培養(yǎng)60分鐘后，各取0.2ml分別涂于LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上(含抗生素)，室溫晾干后，置37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜。
5.4 pUCpGs02質(zhì)粒的鑒定篩選陽性克隆可以使用酶切鑒定用無菌牙簽挑取數(shù)個(gè)白色單克隆菌落，分別接種于含3ml LB(Amp+)試管中，37℃搖床培養(yǎng)8小時(shí)后，按照北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司的質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖挟a(chǎn)品說明書提取重組質(zhì)粒后，分別用EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切，37℃水浴過夜，反應(yīng)體系為取pUCpGs02質(zhì)粒10μl放于Eeppendorf離心管中，加入10×buffer(H)2μl、EcoR I(10u/μl)和Hind III(10u/μl)各1μl，加滅菌蒸餾水至20μl，置37℃水浴酶切過夜。1.2％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)片段大小確定Multi-CpG+是否插入。
5.5經(jīng)檢定正確的pUCpGs02質(zhì)粒，按5.2方法酶切后，又可以和上述經(jīng)酶切過的Multi-CpG+片段連接，完成質(zhì)粒pUCpGs03的構(gòu)建。以此類推，可以構(gòu)建完成pUCpGs04，pUCpGs05，……直至pUCpGs10或更多拷貝數(shù)的質(zhì)粒。該系列質(zhì)粒經(jīng)電泳和酶切鑒定，可獲得和片段理論值一致的不同bp的條帶(圖4a，4b)。完整pUCpGs系列質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖及多克隆位點(diǎn)處的序列如圖5所示。質(zhì)粒pUCpGs01為2902bp，而pUCpGs10為5089bp(每增加一個(gè)Multi-CpG，連同6bp的酶切位點(diǎn)接頭，應(yīng)增加243bp)，完整的pUCpGs10質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖如圖6所示。
實(shí)施例2重組質(zhì)粒pUCpGs10免疫佐劑活性為測(cè)定pUCpGs系列質(zhì)粒是否有免疫佐劑活性及活性與質(zhì)粒中Multi-CpG拷貝數(shù)的關(guān)系，我們分別較大量地培養(yǎng)了空載質(zhì)粒、pUCpGs01和pUCpGs10質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌，并提取質(zhì)粒，然后分別和多型別HCV E1-N重組抗原混合后免疫動(dòng)物，并以動(dòng)物產(chǎn)生抗HCV E1-N抗體水平，觀察其免疫佐劑的作用。
材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與抗原Balb/c小鼠，雌性，6周齡，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。多型別HCV-E1重組抗原蛋白為本實(shí)驗(yàn)室制備。
2.佐劑弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自中山公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒購自博大泰克生物公司。
方法1.免疫用質(zhì)粒DNA的大量提取與純化參照北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司“B型超純質(zhì)粒大量快速提取試劑盒”說明書大量制備質(zhì)粒DNA(pUCpGs10)。
a.200ml重組菌37℃培養(yǎng)12小時(shí)后收集菌體，加入7ml溶液1，振蕩至徹底懸浮；
b.加入10.5ml溶液2，輕輕顛倒混勻，使菌體充分裂解，隨后冰上放置5分鐘；c.加入10.5ml溶液3，輕輕顛倒混勻，室溫放置10分鐘，4℃/12,000rpm離心15min；d.將上清與0.6倍體積的異丙醇混勻后，4℃/10,000rpm離心20min；e.收集沉淀，溶于2ml雙蒸水中并加入80μl 10mg/ml RNase A，37℃保溫30分鐘；f.加入等體積的結(jié)合緩沖液，混勻后移入吸附柱，室溫/12,000rpm離心1min；g.倒掉廢液，加入500μl去內(nèi)毒素緩沖液，室溫/12,000rpm離心1min，重復(fù)一次后，再次于室溫/12,000rpm離心3min；盡量去除去內(nèi)毒素緩沖液；h.倒掉廢液，加入800μl漂洗緩沖液，靜置1分鐘后12,000rpm離心1min，重復(fù)兩次后，再次12,000rpm離心2min，盡量去除漂洗緩沖液；I.將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中央加入50μl無菌水，室溫靜置2-5min；12,000rpm離心2min，收集洗脫液，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 收集洗脫液即為提純的質(zhì)粒DNA，加入10×PBS使質(zhì)粒DNA溶于PBS溶液。紫外分光光度法測(cè)定DNA含量和純度，-20℃保存。
2.動(dòng)物的分組與免疫將5周齡雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為9組，第1-6組每組10只，第7、8每組3只，第9組4只，共免疫3次，分別于第1、5、9周進(jìn)行。動(dòng)物分組及各組免疫方案如下。
第1組為空白對(duì)照組；第2組為蛋白抗原加弗氏不完全佐劑對(duì)照組；第3組為蛋白抗原加弗氏完全佐劑組；第4組為蛋白抗原(50μg/只)加弗氏不完全佐劑再加空載體質(zhì)粒PUC19(20μg/只)組；第5組為蛋白抗原(50μg/只)加弗氏不完全佐劑再加重組質(zhì)粒pUCpGs10(20μg/只)組；第6組為蛋白抗原(50μg/只)加弗氏不完全佐劑再加重組質(zhì)粒pUCpGs01(20μg/只)組；第7組為蛋白抗原(50μg/只)加重組質(zhì)粒pUCpGs10(20μg/只)組；第8組為蛋白抗原(50μg/只)加重組質(zhì)粒pUCpGs10(40μg/只)組；第9組為蛋白抗原(50μg/只)加重組質(zhì)粒pUCpGs10(100μg/只)組。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組一覽表

每組小鼠于每次免疫后3周經(jīng)尾靜脈取血，分離血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)抗體滴度，檢測(cè)抗原的體液免疫反應(yīng)。
3.血清抗體的ELISA檢測(cè)小鼠尾靜脈取血，室溫放置3h，3000r/min離心10min，吸出血清，采用ELISA法檢測(cè)血清中的抗體滴度。
將純化的蛋白用pH9.6的包被液稀釋至終濃度為4μg/ml，包被ELISA板，4℃過夜，甩棄孔中液體，PBST洗滌1次，2％酪蛋白室溫封閉4h，棄去封閉液，拍干ELISA板。將免疫鼠血清用PBS倍比稀釋后，加入各孔，100μl/孔，37℃30min，PBST洗滌，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37℃反應(yīng)20min，PBST洗滌，TMB顯色10min，2M硫酸終止反應(yīng)。同時(shí)設(shè)立正常鼠血清的陰性對(duì)照和PBS空白對(duì)照，于SPECTRAIII酶聯(lián)儀檢測(cè)450nm的A值。結(jié)果判定，以待測(cè)樣品的A值與陰性對(duì)照的A值之比大于或等于2.1(P/N≥2.1)為陽性，顯示陽性結(jié)果的最大抗體稀釋度為免疫小鼠的血清抗體效價(jià)。
血清抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果(表中數(shù)據(jù)為抗體稀釋度)

4.結(jié)果討論從上表結(jié)果可以看出，1)蛋白質(zhì)抗原加弗氏完全佐劑的免疫方案是目前最常用于動(dòng)物免疫的佐劑，確有較好的免疫激活作用。2)pUC19載體，也有不定的佐劑作用，可能和在空載體中也存在CpG基序有關(guān)，但作用甚微。3)pUCpGs01質(zhì)粒具有比pUC19載體更好的活性，顯然和其中含有一個(gè)高CpG的Multi-CpG序列有關(guān)；但其佐劑作用還不夠滿意(不如弗氏完全佐劑)。5)pUCpGs10具有很好的免疫佐劑活性，據(jù)文獻(xiàn)記載，CpG和其他佐劑合用可以提高佐劑活性，但據(jù)我們結(jié)果，pUCpGs10單用即可起到和完全佐劑相同的作用。這可能和在載體中含有較多的CpG基序，且在一個(gè)質(zhì)粒載體中，已不再需要其他佐劑的幫助。6)在我們目前實(shí)驗(yàn)中，不同pUCpGs10的用量(20，40，100μg)沒有明顯差別，是否使用更低劑量即可達(dá)到免疫佐劑的作用，還有待研究。
<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所河北大安制藥有限公司<120>具有免疫激活作用的pUCpGs質(zhì)粒及其制備方法與應(yīng)用<130>
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<400>10tgactcgttc gtgtcgcatg 20<210>11<211>20<212>DNA<213>
<400>11atcgactctc gagcgttctc 20<210>12<211>237<212>DNA<213>
<400>12tcgtcgaacg ttcgagatga taccgatgac gtcgccggtg acggcaccac gaccgatgtc 60gttgcggtga cgtcgtcgtt ttcgaagcgc tccgtgactg tgaacgttcg agatcgtttt120gtcgttaccg ataacgtcgc cggtgacggc accacgagca gcgttcgtgt cggcctctgg180cgtagcgcct cgggccttga ctcgttcgtg tcgcatgatc gactctcgag cgttctc 237<210>13<211>23<212>DNA<213>
<400>13gcactagttc gtcgaacgtt cga 23<210>14<211>23<212>DNA<213>
<400>14gcaagcttgc atgcctgcag gtc 23<210>15<211>36<212>DNA<213>
<400>15gcgaattctc gtcgaacgtt cgagatgata ccgatg36<210>16<211>38<212>DNA<213>
<400>16agatgatacc gatgacgtcg ccggtgacgg caccacga 38<210>17<211>38<212>DNA<213>
<400>17tgacggcacc acgaccgatg tcgttgcggt gacgtcgt 38<210>18<211>38<212>DNA<213>
<400>18cagtcacgga gcgcttcgaa aacgacgacg tcaccgca38<210>19<211>38<212>DNA<213>
<400>19cgacaaaacg atctcgaacg ttcacagtca cggagcgc38<210>20<211>28<212>DNA<213>
<400>20gacgttatcg gtaacgacaa aacgatct 28<210>21<211>28<212>DNA<213>
<400>21gtgaacgttc gagatcgttt tgtcgtta 28<210>22<211>38<212>DNA<213>
<400>22tcgttttgtc gttaccgata acgtcgccgg tgacggca38<210>23<211>38<212>DNA
<213>
<400>23cgccggtgac ggcaccacga gcagcgttcg tgtcggcc38<210>24<211>38<212>DNA<213>
<400>24caaggcccga ggcgctacgc cagaggccga cacgaacg38<210>25<211>38<212>DNA<213>
<400>25gtcgatcatg cgacacgaac gagtcaaggc ccgaggcg38<210>26<211>36<212>DNA<213>
<400>26gctctagaga gaacgcacga gagtcgatca tgcgac 36<210>27<211>146<212>DNA<213>
<400>27gcgaattctc gtcgaacgtt cgagatgata ccgatgacgt cgccggtgac ggcaccacga60ccgatgtcgt tgcggtgacg tcgtcgtttt cgaagcgctc cgtgactgtg aacgttcgag 120atcgttttgt cgttaccgat aacgtc146
<210>28<211>146<212>DNA<213>
<400>28gtgaacgttc gagatcgttt tgtcgttacc gataacgtcg ccggtgacgg caccacgagc 60agcgttcgtg tcggcctctg gcgtagcgcc tcgggccttg actcgttcgt gtcgcatgat120cgactctcga gcgttctcag atctcg 146<210>29<211>253<212>DNA<213>
<400>29gcgaattctc gtcgaacgtt cgagatgata ccgatgacgt cgccggtgac ggcaccacga 60ccgatgtcgt tgcggtgacg tcgtcgtttt cgaagcgctc cgtgactgtg aacgttcgag120atcgttttgt cgttaccgat aacgtcgccg gtgacggcac cacgagcagc gttcgtgtcg180gcctctggcg tagcgcctcg ggccttgact cgttcgtgtc gcatgatcga ctctcgagcg240ttctcagatc tcg 25權(quán)利要求
1.具有免疫激活作用的質(zhì)粒pUCpGs，其特征在于在pUC19的基礎(chǔ)上，插入一個(gè)或多個(gè)免疫激活單位DNA序列Multi-CpG，Multi-CpG的序列如序列表中序列12所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有免疫激活作用的質(zhì)粒pUCpGs，其中Multi-CpG是由11個(gè)CpG ODN片段首尾相而連成，各CpG ODN片段的DNA序列如序列表中序列1-11所示。
3.權(quán)利要求1所述具有免疫激活作用的質(zhì)粒pUCpGs的制備方法，包括以下步驟1)根據(jù)序列表中序列12所示序列，設(shè)計(jì)引物，在其5’和3’端分別引入不同內(nèi)切酶位點(diǎn)，化學(xué)合成引物，以PCR方法合成雙鏈Multi-CpG序列；2)用雙酶切法插入高拷貝質(zhì)粒pUC19，獲得含有一個(gè)Multi-CpG序列的質(zhì)粒pUCpGs01；3)設(shè)計(jì)通用引物，從質(zhì)粒pUCpGs01中擴(kuò)增出含有酶切位點(diǎn)Spe I，Hind III和一小段PUC19質(zhì)粒中序列的Multi-CpG+序列；4)雙酶切Multi-CpG+序列，使之與用Xba I和BamH I雙酶切的質(zhì)粒pUCpGs01相連，獲得含有兩個(gè)Multi-CpG的質(zhì)粒pUCpGs02；5)以上述4)方法，將雙酶切后的Multi-CpG+序列插入經(jīng)酶切后的質(zhì)粒pUCpGs02中，獲得含有3個(gè)Multi-CpG的pUCpGs質(zhì)粒pUCpGs03；同樣可以獲得pUCpGs04、pUCpGs05……。
4.權(quán)利要求1所述具有免疫激活作用的質(zhì)粒pUCpGs在制備微生物感染和癌癥預(yù)防及輔助免疫治療藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述具有免疫激活作用的質(zhì)粒pUCpGs在制備免疫缺陷和過敏性體質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述具有免疫激活作用的質(zhì)粒pUCpGs在制備人或動(dòng)物疫苗免疫佐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一系列具有免疫激活作用的pUCpGs質(zhì)粒，根據(jù)該質(zhì)粒中所含有Multi－CpG激活單位的多少，分別命名為pUCpGs01，02，03……。本發(fā)明還公開了該系列質(zhì)粒的制備方法，以及該系列質(zhì)粒用在制備人和動(dòng)物免疫缺陷或過敏性疾病時(shí)的免疫調(diào)節(jié)制劑、在癌癥和感染性疾病時(shí)的輔助治療制劑、以及用于疫苗研究的免疫佐劑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101092635SQ20071011046
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日
發(fā)明者凌世淦, 賀鋒 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 河北大安制藥有限公司