專利名稱：檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因的實時熒光pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食物過敏原基因的檢測，特別是涉及檢一種檢測水產(chǎn) 品食物過敏原基因的實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法，該方法 主要用于魚類小清蛋白(Par)和甲殼類原肌球蛋白'(TM)基因的實 時熒光PCR檢測。
背景技術(shù)：
食物過敏醫(yī)學(xué)上也稱變態(tài)反應(yīng)。引起食物過敏反應(yīng)的物質(zhì)叫做食 物過敏原，如魚、蝦、蟹、牛奶、蛋類等。其反應(yīng)機理為過敏原進入 機體以后，會導(dǎo)致機體發(fā)生正?；蜻^度免疫應(yīng)答，即超敏反應(yīng)。當再 次接觸相同過敏原時多個IgE分子和抗體結(jié)合，引起IgE的Fc端結(jié) 構(gòu)改變，導(dǎo)致細胞脫顆粒，釋放組胺、5-羥色胺、白三烯等生物呼吸 活性物質(zhì)并作用于效應(yīng)器官，表現(xiàn)為平滑肌收縮、毛細血管擴張、通 透性增加、皮膚過敏、呼吸道過敏、造血系統(tǒng)過敏甚至過敏性休克(趙 俊芳，等.食物過敏原檢測及其應(yīng)用前景.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2007， 8: 948-950)。
近年來食物過敏問題已引起廣大消費者、食品生產(chǎn)者和科學(xué)研究 者的普遍關(guān)注。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)査，全球約有2%-2. 5%的成人受到食 物過敏疾病的困擾，嬰幼兒的發(fā)病率更高，達到4%-6%，兒童約為 2%-3%。在聯(lián)合國糧農(nóng)組織公布的全球八大類過敏食物中，魚類和甲 殼類水產(chǎn)品是其中重要的兩大類，其主要過敏原分別為魚類小清蛋白 (Par)和甲殼類原肌球蛋白(TM) (Food and Agriculture Organization. Report of the FAO technical consultation on foodallergies. Rome, Italy. 1995.)。
對于食物過敏目前無特別的治療方法，嚴格避免接觸過敏食物是 最有效的方法。常用的檢測過敏原方法有體內(nèi)過敏原點刺試驗、體外 檢測特異性IgE (RAST抑制實驗和EAST抑制實驗)、雙盲食物激發(fā) 試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等。這些方法中，體內(nèi)過敏原點刺試驗易出 現(xiàn)假陽性；RAST抑制實驗和EAST抑制實驗的不足是對人體血清的依 賴性，血清是很難保證一致的，因此該方法難以標準化；雙盲食物激 發(fā)試驗易受其它因素影響，實踐中也不易操作，實驗劑量、安慰劑及 雙盲控制等環(huán)節(jié)還有待完善；酶聯(lián)免疫吸附試驗對于微量蛋白難以檢 測(趙俊芳，等.食物過敏原檢測及其應(yīng)用前景.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志， 2007， 8: 948-950)。
近年來基因檢測方法(如PCR、核酸雜交)以其敏感性高、特異 性好、操作簡便而倍受檢驗工作者的青睞。但是常用的PCR檢測技術(shù) 仍需經(jīng)歷一個對擴增產(chǎn)物進行電泳分析的過程，時間耗費在所難免， 而且電泳過程中所使用的溴化乙啶染料對人和環(huán)境都有不同程度的 危害 (Lee C Y, et aL Detection of pathogenic bacteria in shellfish using multiplex PCR followed by CovaLink NH microwell plate sandwich hybridization. Journal of Microbiology Methods, 2003， 53: 199-209)。實時熒光PCR的擴增與產(chǎn)物分析全過程均在 單管封閉條件下進行，并通過微機控制，實現(xiàn)了對PCR檢測進行實時 監(jiān)測和自動分析的目標，也從根本上解決了常規(guī)PCR可能發(fā)生的假陽 性污染問題。但目前尚無采用實時熒光PCR方法來檢測水產(chǎn)品食物過 敏原基因，因此，公眾迫切需要將水產(chǎn)品食物過敏原基因檢測方法應(yīng) 用于實踐
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可定量、快速、靈敏檢出水產(chǎn)品食物
過敏原的實時熒光PCR方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是提取樣品總RNA， 通過SYBR Green或TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)分別檢測水產(chǎn)品 食物過敏原基因Par和TM，以及內(nèi)標基因P-actin，依據(jù)擴增動力 學(xué)曲線和Ct值對檢樣進行結(jié)果分析。
本發(fā)明具體包括以下步驟-
(1) 設(shè)計合成用于檢測水產(chǎn)品食物過敏原的3組引物及探針。 Par基因的上游引物5， -ATGGCATTCGCTGGAATTCTG-3'， Par基因的下游引物5， -TGCCATTTATGCCTTGACCAG-3'，
Par基因的探針5， -FAM-AGGGCTGCCAAGCTGCTGACTCC-TAMRA-3，； TM基因的上游引物，TM-1: 5， -CGCATGGACGCCATCAAGAAGAAGATG -3，，
TM基因的上游引物5， -AGGTTMTAGCCAGACAGTTCGCT-3，， TM基因的探針5， -FAM-AGCAGCTGTCCGCCGCTAACACTAAG -TAMRA-3，；
actin基因的上游引物5， -AGAGCAAGAGAGGTATCTTGA-3，， actin基因的上游引物5， -GGCGGTCTCGTGGATACCAG-3，， actin基因的探針5' -FAM- CACGGCATCATCACTAACTGGGACGA -TAMRA-3'。
(2) 實時熒光PCR檢測。配制熒光PCR擴增反應(yīng)體系，體系含有 PCR緩沖液、MgCl2、 dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑,DNA聚合酶、 上游引物和下游引物、Oligo dT15、 RNA模板、滅菌超純水(注探 針法需添加TaqMan探針)；熒光PCR擴增反應(yīng)條件為45_55匸逆轉(zhuǎn) 錄20-40min; 93-95。C預(yù)變性3—lOmin; 93-95°C/30-60S， 50_60°C/30-60S， 72°C/40-90S， 35-45循環(huán)(注:采用SYBR Green法需設(shè) 置6(TC到95-C的熔解曲線分析)；檢測設(shè)立陽性對照(水產(chǎn)品肌肉 總RNA)、陰性對照(豬肉總RNA)和空白對照(滅菌超純水)。反 應(yīng)結(jié)束后，依據(jù)熒光PCR儀器的分析軟件，求出每個樣品的Ct值， 依據(jù)Ct值和擴增動力學(xué)曲線對檢樣進行分析。
本發(fā)明可以制成用于檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因的實時熒光PCR 試劑盒。
由于本發(fā)明采用SYBR Green或TaqMan探針法實時熒光PCR檢測 水產(chǎn)品食物過敏原基因。SYBR Green是一種與DNA雙鏈結(jié)合的熒光 染料，當與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光；當DNA解鏈時，SYBR Green 被釋放出來，熒光信號急劇減弱，反應(yīng)體系中熒光信號強度代表了雙 鏈DNA分子的數(shù)量；但SYBR Green染料能與所有DNA雙鏈結(jié)合，因 此必須設(shè)置熔解曲線來分析擴增產(chǎn)物的特異性(即目標核酸序列的熔 解溫度，Tm) 。 TaqMan探針是一種能與PCR產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探 針，探針兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團；探針完整時，報告 基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，DNA聚合酶的外 切酶活性將探針降解，破壞了兩個熒光分子之間的能量傳遞，從而發(fā) 出熒光；切割下來的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，即熒光信 號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步(Ke L D， et al. A reliability test of standard-based quantitative PCR - exogenous vs endogenous standards. Molecular and Cellular Probes， 2000， 14: 127-135)。本發(fā)明還在反應(yīng)中設(shè)置了內(nèi)標基因e-actin作為檢 測質(zhì)控，也可用于對目的基因的定量結(jié)果誤差進行校正，P-actin 是構(gòu)成細胞骨架的主要成分肌動蛋白的一種，它具有基因序列高度保 守、mRNA表達數(shù)量高且穩(wěn)定的特點，常作為內(nèi)標棊因被廣泛使用(Neuvians T P， et al. Standardization strategy for quantitative PCR in human seminoma and normal testis. Journal of Biotechnology, 2005， 117: 163-171)。
本發(fā)明利用實時熒光PCR技術(shù)來檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因Par 和TM，相對于其它方法，該技術(shù)具有靈敏度高、檢測時間短和可以 定量分析等優(yōu)點，可用于水產(chǎn)品的未知品種或混合樣品中過敏原基因 的定性篩選、定量分析和確認鑒定。 '
下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。


圖1 TaqMan探針法熒光PCR (Par基因)擴增10倍梯度稀釋鯉 魚RNA的動力學(xué)曲線；
圖2A SYBR Green熒光PCR (TM基因)擴增10倍梯度稀釋鋸緣 青蟹RNA的動力學(xué)曲線；
圖2B梯度稀釋鋸緣青蟹RNA的SYBR Green熒光PCR產(chǎn)物的熔 解曲線；
圖3 TaqMan探針熒光PCR檢測未知樣品中魚類Par基因的動力 學(xué)曲線；
圖4A SYBR Green熒光PCR檢測未知樣品中蟹類TM基因的動力 學(xué)曲線；
圖4B SYBR Green熒光PCR檢測未知樣品中蟹類TM基因的產(chǎn)物 熔解曲線。
具體實施例方式
實施例l:用于檢測鯉魚Par基因的實時熒光PCR
用TaqMan探針熒光PCR法對10倍梯度稀釋的鯉魚肌肉總RNA進 行了 Par基因的檢測，反應(yīng)體系為PCR Master Mix 10nL、滅菌超純水6. 4uL、 'MultiScribe Reverse Transcriptase 0.5"、 RNase Inhibiter 0.4uL、 Par基因上游引物0.5uL、 Par基因的下游引物 0. 5 u L、 Par基因的探針0. 3 u L、 Oligo dT15 1 u L禾卩RNA模板0. 4 uL。反應(yīng)參數(shù)為48。C逆轉(zhuǎn)錄30min; 94。C預(yù)變性10min; 94°C/40S， 55°C/45S， 72°C/90S，共35循環(huán)。結(jié)果顯示擴增動力學(xué)曲線呈典型 的S型，并隨著樣品濃度的降低而逐漸向后平移；Ct值隨著樣品濃 度的降低而逐漸增大(如圖1所示)。
在圖1中，TaqMan探針法熒光PCR (Par基因)擴增10倍梯度 稀釋鯉魚RNA的動力學(xué)曲線；A. 1:10稀釋，Ct=15.3089; B. 1:100 稀釋，Ct=16. 5373; C. 1:1000稀釋，Ct二17.4470; D.. 1:10000稀釋， Ct=19. 0486;
實施例2:用于檢測鋸緣青蟹頂基因的實時熒光PCR
用SYBR Green熒光PCR法對10倍梯度稀釋的鋸緣青蟹肌肉總 RNA進行了 TM基因的檢測，反應(yīng)體系為PCR Master Mix 10 "L、滅 菌超純水6. 7uL、 MultiScribe Reverse Transcriptase 0. 5pL、 RNase Inhibiter 0. 4 u L、 TM基因上游引物0. 5uL、 TM基因的下游 引物O. 5uL、 Oligo dT15 luL和RNA模板O. 4uL。'反應(yīng)參數(shù)為48 。C逆轉(zhuǎn)錄30min; 94。C預(yù)變性10min; 94°C/40S， 55°C/45S， 72°C/90S， 共35循環(huán)；設(shè)置6(TC到95'C的熔解曲線分析。結(jié)果顯示擴增動力學(xué) 曲線呈典型的S型，并隨著樣品濃度的降低而逐漸向后平移；Ct值 隨著濃度的降低而逐漸增大(如圖2A所示)；擴增產(chǎn)物的熔解曲線 圖譜顯示其Tm為87"C，且只有一個特異性峰，表明無引物二聚體及 非特異性擴增出現(xiàn)(如圖2B所示)。
在圖2A中，SYBR Green熒光PCR (TM基因)擴增10倍梯度稀釋鋸緣青蟹RNA的動力學(xué)曲線；A. 1:10稀釋，Ct=15.2523; B. 1:100 稀釋，Ct=16.5799; C. 1:1000稀釋，Ct=18.0974; D. 1:10000， Ct=20. 7475。
實施例3:未知樣品中魚類Par基因檢測
用TaqMan探針熒光PCR法對未知樣品中的魚類Par基因進行了 Par基因的檢測，具體條件參照實施例l。結(jié)果顯示未知樣品的擴增 動力學(xué)曲線呈典型的S型，陰性對照沒有檢測到熒光信號變化，表明 未知樣品中含有魚類Par基因(如圖3所示)。
在圖3中，TaqMan探針熒光PCR檢測未知樣品中魚類Par基因的 動力學(xué)曲線；A.樣品S-I， Ct二15. 2695; B.樣品S-II， Ct=16. 0500; C.陰性對照，Ct=Undet。
實施例4:未知樣品中蟹類TM基因檢測
用SYBR Green熒光PCR法對未知樣品中的蟹類TM基因進行了 TM基因的檢測，具體條件參照實施例2。結(jié)果顯示未知樣品的擴增動 力學(xué)曲線呈典型的S型，陰性對照則沒有檢測到熒光信號變化，表明 未知樣品中含有蟹類TM基因(如圖4A所示)；陽性擴增產(chǎn)物的熔解 曲線圖譜顯示其Tm為87。C，且只有一個特異性峰，陰性對照中沒有 出現(xiàn)熔解特異性峰，表明陽性產(chǎn)物為特異性擴增(如圖4B所示)。
在圖4A中，SYBR Green熒光PCR檢測未知樣品中蟹類TM基因 的動力學(xué)曲線；A.樣品S- I , Ct二15.2204; B.樣品S-II ， Ct二16.2523; C.陰性對照，Ct=Undet。
權(quán)利要求
1、一種檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因的實時熒光PCR方法，其特征在于其步驟包括提取樣品總RNA，通過SYBR Green或TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)分別檢測水產(chǎn)品食物過敏原魚類小清蛋白(Par)和甲殼類原肌球蛋白(TM)基因，以及內(nèi)標基因β-actin，依據(jù)擴增動力學(xué)曲線和Ct值對檢樣進行結(jié)果分析。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因的實時熒 光PCR方法，其特征在于具體包括以下步驟(1) 設(shè)計合成用于檢測水產(chǎn)品食物過敏原的3組引物及探針； Par基因的上游引物5， -ATGGCATTCGCTGGAATTCTG-3，， Par基因的下游引物5， -TGCCATTTATGCCTTGACCAG-3，，Par基因的探針5, -FAM-AGGGCTGCCMGCTGCTGACTCC-TAMRA-3，； TM基因的上游引物，TM-1: 5， -CGCATGGACGCCATCAAGAAGAAGATG -3，，TM基因的上游引物5， -AGGTTAATAGCCAGACAGTTCGCT-3，， TM基因的探針5， -FAM-AGCAGCTGTCCGCCGCTAACACTAAG -TAMRA-3';actin基因的上游引物5， -AGAGCMGAGAGGTATCTTGA_3，， actin基因的上游引物5， -GGCGGTCTCGTGGATACCAG-3，， actin基因的探針5， -FAM-CACGGCATCATCACTAACTGGGACGA -TAMRA-3，。(2) 實時熒光PCR檢測。配制熒光PCR擴增反應(yīng)體系，體系含有 PCR緩沖液、MgCl2、 dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、DNA聚合酶、 上游引物和下游引物、01igodT15、 RNA模板、滅菌超純水；熒光PCR擴增反應(yīng)條件為45-55。C逆轉(zhuǎn)錄20-40min; 93-95°(3預(yù)變性3-10min; 93-95°C/30-60S， 50-60。C/30-60S， 72。C/40-90S， 35-45循環(huán)；檢 測設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照；反應(yīng)結(jié)束后，依據(jù)熒光PCR 儀器的分析軟件，求出每個樣品的Ct值，依據(jù)Ct值和擴增動力學(xué)曲 線對檢樣進行分析。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因的實 時熒光PCR方法，其特征在于通過SYBR Green或TaqMan探針法實 時熒光PCR技術(shù)分別檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因Par和TM。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因的實 時熒光PCR方法，其特征在于可以制成用于檢測水產(chǎn)品食物過敏原 基因的實時熒光PCR試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因的實時熒光PCR方法，其步驟包括提取樣品總RNA，通過SYBR Green或TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)分別檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因Par和TM，以及內(nèi)標基因β-actin，依據(jù)擴增動力學(xué)曲線和Ct值對檢樣進行結(jié)果分析。由于本發(fā)明利用實時熒光PCR技術(shù)來檢測水產(chǎn)品食物過敏原基因Par和TM，相對于其它方法，該技術(shù)具有靈敏度高、檢測時間短和可以定量分析等優(yōu)點，可用于水產(chǎn)品的未知品種或混合樣品中過敏原基因的定性篩選、定量分析和確認鑒定。
文檔編號G01N21/64GK101434991SQ20081007173
公開日2009年5月20日 申請日期2008年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月4日
發(fā)明者劉光明, 曹敏杰, 蔡慧農(nóng) 申請人:集美大學(xué)