Top2a基因表達(dá)量熒光定量pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用
【專利說明】T0P2A基因表達(dá)量黃光定量PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種人拓?fù)洚悩?gòu)IIαΟ?Ρ2Α)基因巧光定量PCR檢測試劑盒及其應(yīng) 用。 (二）【背景技術(shù)】
[0002] 拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase，TOP)是存在于細(xì)胞核內(nèi)的一類酶，能夠催化DNA鏈 的斷裂和結(jié)合，從而抑制DNA的拓?fù)錉顟B(tài)。哺乳動(dòng)物主要存在兩種拓?fù)洚悩?gòu)酶，拓?fù)洚悩?gòu)酶 I通過形成短暫的單鏈裂解結(jié)合環(huán)，催化DNA復(fù)制的拓?fù)洚悩?gòu)狀態(tài)的變化。相反拓?fù)洚悩?gòu)酶 II引起瞬間雙鏈酶橋的斷裂，然后開通和再封閉，W改變DNA的拓?fù)錉顟B(tài)。拓?fù)洚悩?gòu)酶II 又包括TOPIIa和TOPΙΙβ兩種同工酶。TOPIIa的編碼基因?yàn)門0P2A，位于17ql2.21。 T0P2A在快速增殖細(xì)胞中含量最高，其表達(dá)僅限于S期到G2/M期的細(xì)胞周期。TOPIIa在 分化差的腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于分化良好的腫瘤組織，在正常組織中則很少表達(dá)，運(yùn) 使得它可能成為抗腫瘤治療的有效祀點(diǎn)。
[0003] 臨床上的拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑就是針對(duì)該祀點(diǎn)的抗腫瘤藥物。拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑 制劑根據(jù)作用方式不同分為嵌入型和非嵌入型兩類。嵌入型抑制劑系通過其分子中類似嚷 嶺堿或喀晚堿的多環(huán)結(jié)構(gòu)嵌入到拓?fù)洚悩?gòu)酶II與DNA結(jié)合部位的雙鏈之間，從而干擾了酶 將DNA斷端重新接合的正常功能，并進(jìn)一步造成DNA鏈斷裂損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。運(yùn)一類藥 物主要有：叮晚類（m-AMSA)，蔥環(huán)類（阿霉素、柔紅霉素等），蔥二酬類（米托蔥釀、蔥雙咪 腺）。非嵌入性抑制劑的作用模式尚不清楚。
[0004] 研究表明，T0P2A基因異常對(duì)蔥環(huán)類藥物化療的療效有預(yù)測作用。有淋己結(jié)轉(zhuǎn)移的 乳泉癌患者被隨機(jī)分成CEF化療組和CNM化療組，分析T0P2A和化療療效的關(guān)系。結(jié)果顯 示，T0P2A基因變異（擴(kuò)增或缺失）的乳腺癌患者，接受CEF化療者的RFS(皿=0. 3,P= 0. 005)和0S化R= 0. 33,P= 0. 008)明顯優(yōu)于CMF組；相反T0P2A基因無變異的患者，CEF 和CMF的療效之間并無無明顯的差別。在一項(xiàng)分析5000例乳腺癌者肥R-2和T0P2A基因 改變與化療療效關(guān)系的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)單純使用AC方案化療，肥R-2和T0P2A基因同時(shí)高表 達(dá)的患者生存明顯優(yōu)于僅有肥R-2基因高表達(dá)組（P= 0. 004)，因此，認(rèn)為T0P2A基因擴(kuò)增 可預(yù)測乳腺癌含蔥環(huán)類化療藥物的療效。對(duì)278例乳腺癌患者的研究表明，T0P2A基因表 達(dá)的乳腺癌患者中pCR率要明顯高于T0P2A未表達(dá)的患者（P<0. 0001)。ΜΕΤΑ分析也同樣 證明，Τ0Ρ2Α基因擴(kuò)增可作為乳腺癌含蔥環(huán)類化療療效的預(yù)測因子。運(yùn)些研究結(jié)果均提示 我們?cè)谌橄侔┗颊咧校琓OP2Α基因變異與蔥環(huán)類輔助化療的作用有一定的關(guān)聯(lián)，可作為藥 物選擇的參考。 (Ξ)
【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明目的是提供一種人T0P2A基因巧光定量PCR檢測試劑盒，用于檢測人T0P2A基因的表達(dá)，特異性好，靈敏度高。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 一種檢測人T0P2A基因突變的巧光定量PCR試劑盒，主要包括特異性引物和PCR 反應(yīng)試劑；所述特異性引物序列如下：
[0008] 上游引物：5，-GGGAGAGTGATGACTTCCATATGGA-3 '
[0009] 下游引物：5 ' -AACACCTTCCCCAAACTAAATTCAG-3，。
[0010] 所述PCR反應(yīng)試劑為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，主要包括：dNTP、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、PCR緩沖 液、Mg2\雙蒸水、逆轉(zhuǎn)錄酶、Tag酶等，也可直接采用市售PCRMix成品。
[0011] 所述試劑盒還可包括人T0P2A基因檢測標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下：
[0012] 5'-AATGTGAGGCGATTATTTTAAGTAATTATCTTACCAAGCCCAAGACTGGTTTTAAAGTTACCTG AAGCTCTTAACTTCCTCCCCTCTGAATTTAGTTTGGGGAAGGTGTTTTTAGTACAAGACATCAAAGTGAAGTAAA GCCCAAGTGTTCTT-3>。
[0013] t不準(zhǔn)品的制備：WGenebank中發(fā)布的人T0P2A的基因序列為柄；準(zhǔn)，W健康體檢 人的外周血mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。W該cDNA為模板，用上述引物擴(kuò)增出特異性的 PCR片段，然后把該P(yáng)CR片段插入到T載體中，利用大腸桿菌D冊(cè)α菌株轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒， nano化ορ2000測定濃度和純度，W此質(zhì)粒作為檢測分析中的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0014] 本發(fā)明還設(shè)及所述的試劑盒在檢測人Τ0Ρ2Α基因表達(dá)量中的應(yīng)用。
[0015] 具體的，所述應(yīng)用方法如下：
[0016] (1)采集待測樣本，提取RNA;樣本可W是血液、穿刺組織、石蠟組織、手術(shù)切除組 織等；
[0017] (2)W樣品RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到樣品cDNA; 陽018] 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：RNA模板0.lug,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑（promega試劑盒），雙蒸水；反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)：25°C15min;50°CIhour;85°C5min;4°C，5min。
[0019] (3)w梯度濃度的人T0P2A基因檢測標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入所述特異性引物和PCR反 應(yīng)試劑，組成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； W20] (4)W樣品cDNA為模板，加入所述特異性引物和PCR反應(yīng)試劑，組成PCR反 應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得T0P2A基因表達(dá)量。可W樣 品cDNA為模板，加入內(nèi)參 18s特異性引物（F:5' -AGAAACGGCTACCACATCCA-3';R: 5' -CACCAGACTTGCCCTCCA-3')和PCR反應(yīng)試劑，組成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，監(jiān)控實(shí) 驗(yàn)體系的可行性。 陽02U 所述PCR反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性2min;95°C變性15s、60°C退火20s、72°C延伸 20s(此處收集巧光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。
[0022] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明試劑盒用于檢測人T0P2A基因表達(dá)量，特 異性好，靈敏度高，具有較好應(yīng)用前景。 (四）
【附圖說明】
[0023] 圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線及3對(duì)（癌組織和癌旁組織）臨床樣本的檢測結(jié)果；
[0024] 圖2為內(nèi)參18s的擴(kuò)增曲線。 (五）
【具體實(shí)施方式】
[00巧]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此： 陽0%] 實(shí)施例1:
[0027] (1)樣品準(zhǔn)備：取患者手術(shù)切除組織，提取RNA(濃度不小于l(K)ng，A260/280不小 于 1. 9)。
[0028] (2)樣品處理：取lOOng的RNA，加入反轉(zhuǎn)錄試劑（promega試劑盒）5μ1，補(bǔ)雙蒸 水到20μ1，按如下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：25°C15分鐘；50°C1小時(shí)；85°C5分鐘；4°C，5分 鐘。
[0029] (3)巧光定量PCR反應(yīng)：
[0030] 利用（2)中反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行：取上述反轉(zhuǎn)錄模板5μ1，加入0. 1ml的8聯(lián) 排管中（含巧光定量PCR反應(yīng)試劑15μ1)。同時(shí)在標(biāo) 陽03U 準(zhǔn)管中（含巧光定量PCR反應(yīng)試劑15μ1)加入相應(yīng)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；在內(nèi)參管 (含巧光定量PCR反應(yīng)試劑15μ1，引物為內(nèi)參18s特異性引物）中加入5μ1上述cDNA模 板?；靹?。然后加入巧光定量反應(yīng)引物，上機(jī)檢測。在ABISt巧化ePlus儀器上，選擇標(biāo) 準(zhǔn)曲線法和SYBR染料，進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0032]巧光定量PCR反應(yīng)試劑組成如下：總體積：15 μ 1 ;PCR Mix值BI Bioscience) (10 μ1)引物集（0. 2 μ1)，雙蒸水（4.8 μ1); 陽03引？〇?反應(yīng)條件如下：95°(：預(yù)變性2111111;95°(：變性153、60°(：退火203、72°(：延伸 20s(此處收集巧光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。
[0034] (4)結(jié)果判讀。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用待測樣品的Ct值，從該曲線上讀取 相應(yīng)的T0P2A基因表達(dá)量，結(jié)果參見圖1，內(nèi)參18s的擴(kuò)增曲線參見圖2 ;由圖可見：本發(fā)明 試劑盒可用于檢測人T0P2A基因表達(dá)量，特異性好，靈敏度高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.檢測人T0P2A基因突變的熒光定量PCR試劑盒，主要包括特異性引物和PCR反應(yīng)試 劑；其特征在于所述特異性引物序列如下： 上游引物：5' -GGGAGAGTGATGACTTCCATATGGA-3' 下游引物：5' -AACACCTTCCCCAAACTAAATTCAG-3'。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括人T0P2A基因檢測標(biāo)準(zhǔn) 品，所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下： 5' -AATGTGAGGCGATTATTTTAAGTAATTATCTTACCAAGCCCAAGACTGGTTTTAAAGTTACCTGAAGC TCTTAACTTCCTCCCCTCTGAATTTAGTTTGGGGAAGGTGTTTTTAGTACAAGACATCAAAGTGAAGTAAAGCCCA AGTGTTCTT-3'。3.權(quán)利要求1所述的試劑盒在檢測人T0P2A基因表達(dá)量中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用方法如下： (1)采集待測樣本，提取RNA ; (2)以樣品RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到樣品cDNA ; (3)以梯度濃度的人T0P2A基因檢測標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入所述特異性引物和PCR反應(yīng)試 劑，組成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4)以樣品cDNA為模板，加入所述特異性引物和PCR反應(yīng)試劑，組成PCR反應(yīng)體系，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得T0P2A基因表達(dá)量。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性2min ; 95°C變性15s、60°C退火20s、72°C延伸20s，40個(gè)循環(huán)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測人TOP2A基因突變的熒光定量PCR試劑盒，主要包括特異性引物和PCR反應(yīng)試劑；所述特異性引物序列如下：上游引物：5’-GGGAGAGTGATGACTTCCATATGGA-3’下游引物：5’-AACACCTTCCCCAAACTAAATTCAG-3’；本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明試劑盒用于檢測人TOP2A基因表達(dá)量，特異性好，靈敏度高，具有較好應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105256023
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510671926
【發(fā)明人】劉小龍, 張?jiān)? 楊福太, 高運(yùn)臻, 李雨陽
【申請(qǐng)人】蘇州貝斯麥醫(yī)療儀器有限公司
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年10月16日