嗜肺軍團(tuán)菌熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性檢測(cè)樣品中嗜肺軍團(tuán)菌核酸的試劑 盒，屬于嗜肺軍團(tuán)菌的體外診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗜肺軍團(tuán)菌（legionellapneumophila)是一種革蘭氏陰性菌，軍團(tuán)菌屬多形態(tài)性 的短小球桿菌。嗜肺軍團(tuán)菌為胞內(nèi)寄生菌，其致病性直接依賴于胞內(nèi)寄生能力，主要通過(guò)吸 入帶菌飛沫而感染，常見(jiàn)的感染來(lái)源為污染的空調(diào)和供水系統(tǒng)，該菌的感染力在抗體和血 清補(bǔ)體存在下大大提高，可引起軍團(tuán)菌肺炎、肺外綜合征和龐蒂亞克熱。在檢測(cè)中，PCR法由 于其快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)逐漸呈現(xiàn)出要替代以細(xì)菌培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)為主的傳統(tǒng)檢測(cè)方法的 趨勢(shì)。而對(duì)于PCR方法來(lái)說(shuō)，引物的特異性是其檢測(cè)的特異性和敏感性的基礎(chǔ)。
[0003] 本發(fā)明針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌基因序列的保守區(qū)域特異的靶序列設(shè)計(jì)引物和Taqman探 針，利用real-time PCR的方法，用來(lái)快速檢測(cè)樣品中是否存在嗜肺軍團(tuán)菌的核酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是快速準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中是否存在嗜肺軍團(tuán)菌，提供 一種特異性檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的熒光PCR試劑盒。
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的： 一種特異性檢測(cè)樣品中嗜肺軍團(tuán)菌核酸的試劑盒，其組分包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、 陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品，其中PCR反應(yīng)液主要含有相關(guān)的引物和探針、反應(yīng)緩沖液、Mg2+和 dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動(dòng)Taq酶，陰性質(zhì)控品為無(wú) RNase和DNase水，陽(yáng)性質(zhì)控品為 含有嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)靶序列的重組質(zhì)粒。
[0006] 其中PCR反應(yīng)液中用于核酸擴(kuò)增的引物為P1和P2，P1和P2為針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌基因 組群特異性保守序列設(shè)計(jì)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的特異性引物;PCR反應(yīng)液中用于熒光信號(hào)監(jiān) 測(cè)的寡核苷酸探針為ProbeUProbel為針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌基因組群特異性保守序列設(shè)計(jì)并經(jīng) 預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的特異性探針，其中熒光報(bào)告基團(tuán)Χι為FAM，熒光淬滅基團(tuán)YiSEclipse(見(jiàn)表 1) 〇 「00071 耒1給涮卩耆_罜閉茴的弓丨物和探針序歹1丨
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本熒光PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的應(yīng)用方法，包 括： 試劑盒選用的PCR反應(yīng)體系為20 yL，包括2XPCR緩沖液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ ?、25μπιο1/1 引物各0.5 yUlOymol/L 探針0.2 yL、熱啟動(dòng)Taq酶混合液0.4 yL、樣品DNA 2 yL，加滅菌水至終體系20 yL。
[0008] 試劑盒的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C，2min;進(jìn)入循環(huán)階段:94°C變性10s，56°C退火 50s，72 °C延伸15s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。
[0009] 質(zhì)量控制:每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照無(wú) Ct值(或Ct值為0)，陽(yáng)性對(duì)照 Ct值< 30，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成立。
[0010] 結(jié)果判讀： 陽(yáng)性：出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，Ct值< 35;可疑：出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，但Ct值> 35;陰性:沒(méi) 有出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，或者曲線雖然超過(guò)了閾值，但不呈"S"型;對(duì)可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)， 如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)還是出現(xiàn)"S"型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照沒(méi)有污染，可判斷為陽(yáng)性。
[0011] 樣本要求:臨床樣本類型包括咽拭子、痰液和分離培養(yǎng)物;臨床樣本采集后應(yīng)帶冰 運(yùn)輸，-20°C保存，不能反復(fù)凍融;從臨床樣本提取DNA，建議采用性能穩(wěn)定可靠的商品化試 劑盒，具體方法參見(jiàn)相應(yīng)商品化試劑盒說(shuō)明書，提取的DNA應(yīng)立即檢測(cè)，否則，應(yīng)將DNA分裝 后-80°C~_20°C保存。
[0012] 本發(fā)明提供的試劑盒具有很好的特異性，可以檢出嗜肺軍團(tuán)菌，但不能檢出非嗜 肺軍團(tuán)菌病原體的核酸;對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌核酸的檢測(cè)下限為10拷貝每反應(yīng)體系；只需要2小時(shí) 即可完成檢測(cè)，可為嗜肺軍團(tuán)菌的疾病監(jiān)測(cè)和臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線圖。從左至右的每 組曲線對(duì)應(yīng)濃度依次為2 X 106-2 X 102copiesAiL，試劑盒對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)限均為10拷 貝每反應(yīng)體系。橫坐標(biāo)為反應(yīng)循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測(cè)信號(hào)的ARn值。
[0014] 圖2為單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系檢測(cè)10種細(xì)菌基因組DNA的擴(kuò)增曲線圖。10種細(xì) 菌包括:嗜肺軍團(tuán)菌和9種陰性對(duì)照微生物。白喉棒狀桿菌出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，而其他9種病 原微生物未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。需要指出的是，這里列出 的實(shí)施例僅僅為示例性說(shuō)明的目的，而不應(yīng)將其解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的任何限制。其中使 用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實(shí)施例中具體選擇的試劑，應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應(yīng)試劑以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0016] 引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成 利用Blast工具對(duì)Genbank和國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中的嗜肺軍團(tuán)菌基因組序列進(jìn)行分析，分別選 擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測(cè)靶序列。嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)靶序列來(lái)源于核糖體RNA 23s基因； 并針對(duì)檢測(cè)靶序列設(shè)計(jì)和合成引物和探針(見(jiàn)表1)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生 物公司合成，嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)探針5 '端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)；3 '端標(biāo)記Eel ipse熒光淬滅基 團(tuán)。
[0017] 檢測(cè)菌種的準(zhǔn)備 本實(shí)施例中所使用的嗜肺軍團(tuán)菌以及其他陰性對(duì)照菌株(潰瘍棒狀桿菌，假白喉棒狀 桿菌，溶血棒狀桿菌，金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，大腸桿菌，微小棒狀桿菌，流感嗜血桿 菌，炭疽芽孢桿菌)均購(gòu)買于中國(guó)藥品生物制品檢定所。
[0018] 菌株DNA的抽提 選用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit(貨號(hào)：51306)提取菌株DNA。具體步驟試劑盒參 考操作說(shuō)明書。
[0019] 引物和探針的篩選 采用設(shè)計(jì)的引物和探針檢測(cè)提取的嗜肺軍團(tuán)菌和陰性對(duì)照菌株的基因組DNA，經(jīng)反復(fù) 實(shí)驗(yàn)，篩選出靈敏度、特異性和重復(fù)性最佳的引物探針組合。（見(jiàn)序列表，嗜肺軍團(tuán)菌(正向 弓丨物P1、反向引物P2和探針Probel) 標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與制備 利用P1和P2引物擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌基因組DNA，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5a 大腸桿菌，利用堿裂解法提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定在波長(zhǎng) 260nm處、280nm處DNA的吸光率，然后計(jì)算質(zhì)粒濃度與純度。然后10倍梯度稀釋至200拷貝每 微升，制備嗜肺軍團(tuán)菌的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。
[0020] 反應(yīng)條件優(yōu)化 對(duì)引物、探針、酶等要素逐一優(yōu)化，確定的反應(yīng)體系為：2XPCR緩沖液10 tiUlOmmol/L dNTP 1.0yL、25ymol/L引物各0.5 yL、10ymol/L 探針0.2 yL、Takara聚合酶混合物0.4 yL、 模板2 uL，加滅菌水至終體系20 yL。
[0021] 根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)短、引物和探針的退火溫度以及酶的特性，主要對(duì)反應(yīng)的退火溫 度和延伸時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定循環(huán)參數(shù)為:94°C，2min;進(jìn)入循環(huán)階段:94°C變性10s， 56°C退火50s，72°C延伸15s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在退火階段采集熒光信號(hào)。
[0022]在擴(kuò)增結(jié)束后按同一條件分析數(shù)據(jù)，確定各樣品的Ct值。
[0023]檢測(cè)限的評(píng)價(jià) 以上述中的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品評(píng)價(jià)本發(fā)明提供的試劑盒的檢測(cè)限，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品濃度為：2X lC^copies/yL、〗X lC^copies/yL、〗X 104copies/yL、2 X lC^copies/yL、〗X 102copies/yL，本 發(fā)明提供的試劑盒對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌核酸的檢測(cè)下限為10拷貝每反應(yīng)體系。
[0024] 檢測(cè)特異性的評(píng)價(jià) 以上述菌株DNA為模板評(píng)價(jià)了本試劑盒的特異性。對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌DNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)均可見(jiàn) 明確擴(kuò)增曲線，對(duì)上述9種其他咽部常見(jiàn)病原微生物DNA檢測(cè)時(shí)，未產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，說(shuō)明 我們使用的探針和引物與我們選定的其他菌株之間不存在交叉反應(yīng)。
[0025] 盡管上文中以優(yōu)選的方式，通過(guò)具體實(shí)施例示例性說(shuō)明了本發(fā)明的某些實(shí)施方 式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明并不限于上面所公開(kāi)的實(shí)施方式，而是可以根據(jù)本 發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的知識(shí)對(duì)其進(jìn)行修改，所作修改不會(huì)超出本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。例如， 本發(fā)明所使用的熒光實(shí)時(shí)PCR也可以根據(jù)需要采用說(shuō)明書中所列出的實(shí)施例中指出的熒光 報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)以外的標(biāo)記物質(zhì)，如了6丨、了411^、1?(^、0 73、了11?(1、1(^等標(biāo)記物;或 使用Taqman技術(shù)之外的其他標(biāo)記體系，例如MGB探針、分子信標(biāo)MB探針、蝎形探針、熒光雙雜 交探針等熒光探針標(biāo)記技術(shù);或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不飽和染料與LC Green 等飽和染料，只要其使用了本發(fā)明所述的特異性引物序列，即可定性或定量檢測(cè)目的基因 的存在，進(jìn)而特異性地檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的存在。所以，這些本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的改變和 慣用手段的替換也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求書限 定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于特異性檢測(cè)樣品中嗜肺軍團(tuán)菌核酸的試劑盒，其中包括PCR反應(yīng)液、酶混合 液、陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品，PCR反應(yīng)液中用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列如下： PI:5'-CTATATCCCTGAATGTCTTCACC-3'， P2:5'-CATATCCCTATAGTGGCCTGG-3'， PCR反應(yīng)液中用于熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)的寡核苷酸探針的序列如下： Probe: 5' -Xi-CGTCTAATCTCYGACACTATACCTAACGTGTG-Yi -3'， Probe熒光報(bào)告基團(tuán)X^FAM，焚光淬滅基團(tuán)Y^Eclipse。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR反應(yīng)體系為20 uL，包括2 XPCR緩沖液 10 yL、10mmol/L dNTP 1.0yL、25ymol/L引物各0.5 yL、10ymol/L 探針0.2 yL、熱啟動(dòng)Taq 酶混合液〇.4yL、樣品DNA 2yL，加滅菌水至終體系20 yL。3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為： 94°(：，2!1^11;進(jìn)入循環(huán)階段 ：94°(：變性1〇8,56°(：退火5〇8,72°(：延伸158，共反應(yīng)40個(gè)循 環(huán)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性檢測(cè)樣品中嗜肺軍團(tuán)菌核酸存在的試劑盒。利用本發(fā)明的試劑盒，可快速檢測(cè)樣品中是否存在嗜肺軍團(tuán)菌核酸。該試劑盒對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌核酸的檢測(cè)限為10拷貝每反應(yīng)體系，整個(gè)反應(yīng)可在2小時(shí)內(nèi)完成，在疾病監(jiān)測(cè)、臨床診斷等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12Q1/04, C12R1/01, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105624286
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510887360
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2015年12月7日