一種快速鑒定雞白痢和雞傷寒沙門菌的pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒定雞白痢和雞傷寒沙門菌的PCR檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒中包括flhB基因檢測(cè)引物，所述flhB基因檢測(cè)引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。本發(fā)明的試劑盒能快速高通量鑒定雞白痢/傷寒沙門菌，可作為沙門菌傳統(tǒng)血清學(xué)分型的輔助方法，并為雞白痢/傷寒沙門菌的監(jiān)測(cè)與實(shí)驗(yàn)室診斷提供了一種簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好的新方法。
【專利說(shuō)明】
一種快速鑒定雞白痢和雞傷寒沙門菌的PCR檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒定雞白痢和雞傷寒沙門菌的 PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙門菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上有重要意義的傳染病之一，其病原沙門菌屬于腸桿菌 科，蛋、家畜和肉制品是主要傳播媒介，可引起多種畜禽疾病，造成全身性敗血癥和腸炎。雞 白痢和雞傷寒分別是由雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌引起的，雞白痢沙門菌主要感染2~3 周齡的雛雞，引起白色下痢，病死率較高，而成年雞感染后病死率較低，但可長(zhǎng)期帶毒排毒。 雞傷寒沙門菌對(duì)雛雞、成年雞均可致病，以引起貧血、白細(xì)胞增多、出血為特征。因而，雞白 痢/傷寒沙門菌是我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)中危害嚴(yán)重的細(xì)菌。目前，根據(jù)Kauffman-White(K-W)血清型 分型方法，依據(jù)沙門菌菌體抗原及鞭毛抗原的不同，沙門菌目前的血清型有2600種以上，中 國(guó)已報(bào)道了 292種不同的血清型，分屬于35個(gè)0群。
[0003] 傳統(tǒng)的檢測(cè)方法即非選擇性和選擇性增菌、生化特性及血清學(xué)鑒定很費(fèi)力、耗時(shí)， 需4-7天才能完成，其它如抗體檢測(cè)法，雖然快速，但其高假陽(yáng)性使之不適于常規(guī)檢測(cè)。因 此，急需一些快速、特異、敏感的檢測(cè)方法，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)雞白痢和雞傷寒沙門菌，這對(duì)于雞白 痢和雞傷寒的有效防控意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒定雞白痢和雞 傷寒沙門菌的PCR檢測(cè)試劑盒及其制備和應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供一種快速鑒定雞白痢和雞傷寒沙門菌的PCR檢測(cè)試劑盒， 所述試劑盒中包括fIhB基因檢測(cè)引物，所述fIhB基因檢測(cè)引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的反向引物。
[0007] 本發(fā)明的試劑盒采用PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行flhB基因檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增及檢測(cè)情況可分 析判斷檢測(cè)對(duì)象是否屬于雞白痢/傷寒沙門菌。因此，引物的設(shè)計(jì)是本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵。
[0008] 基于本發(fā)明所述試劑盒是采用PCR技術(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的，所以試劑盒中還可以包括 其他一些PCR所需要的常規(guī)試劑，如:無(wú)菌水(ddH2〇)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、樣品基因 組DNA提取試劑等常用PCR反應(yīng)試劑中的一種或多種。由于此類PCR常用試劑均可經(jīng)市場(chǎng)途 徑單獨(dú)購(gòu)得或者自行配置，因此具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可以根據(jù)客戶實(shí)際需 要配置，為方便起見(jiàn)，也可全部裝配入試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的試劑盒，可以是含有獨(dú)立包裝的引物對(duì)，也可以是含有配置好的含有引 物對(duì)的PCR檢測(cè)液。
[0010] 所述PCR檢測(cè)液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR檢測(cè)液加入引 物獲得。例如，所述試劑盒中還可以含有無(wú)菌水(ddH2〇)、dNTP、PCR buf f er、rTaq酶。加入本 發(fā)明的引物、待檢樣本DNA提取物或者樣本菌液即可獲得PCR反應(yīng)體系。
[0011] 優(yōu)選地，所述試劑盒中還可含有陽(yáng)性對(duì)照。所述陽(yáng)性對(duì)照為含有雞白痢/傷寒沙門 菌flhB基因表達(dá)的DNA樣本。
[0012] 優(yōu)選地，所述試劑盒中還可含有陰性對(duì)照。陰性對(duì)照可為非雞白痢/傷寒沙門菌的 DNA樣本。
[0013] 本發(fā)明的第二方面，提供了前述快速鑒定雞白痢/傷寒沙門菌的PCR檢測(cè)試劑盒的 使用方法，包括如下步驟：
[0014] (1)提取樣品基因組DNA;
[0015] (2)加樣:將樣品基因組DNA、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照分別加入裝有PCR反應(yīng)體系的 PCR管中，獲得對(duì)應(yīng)的樣品反應(yīng)管、陽(yáng)性反應(yīng)管或陰性反應(yīng)管，所述PCR反應(yīng)體系中含有前述 flhB基因檢測(cè)引物；
[0016] (3 )PCR反應(yīng):反應(yīng)管置于PCR儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0017] (4)PCR反應(yīng)結(jié)束后，分析結(jié)果。
[0018] 優(yōu)選地，所述方法為非疾病診斷目的的方法。
[0019] 步驟(1)中，提取樣品基因組DNA為現(xiàn)有技術(shù)。
[0020]優(yōu)選地，步驟（3)中，PCR 反應(yīng)的條件設(shè)置為：（a)94°C5min;(b)94°C45s;(c)55°C 458;((1)721€3〇8，步驟(13)~（(1)循環(huán)30次，（6)72°(：1〇11^11。
[0021]本發(fā)明的第三方面，提供了前述試劑盒在制備flhB基因檢測(cè)產(chǎn)品中的用途。
[0022] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)產(chǎn)品用于檢測(cè)和篩選雞白痢和雞傷寒沙門菌。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0024]本發(fā)明通過(guò)廣泛而深入的研究，首次報(bào)道雞白痢和雞傷寒沙門菌flhB基因與其它 血清型沙門菌flhB基因的差異，即雞白痢和雞傷寒沙門菌flhB基因的內(nèi)部缺少197bp的核 苷酸序列，以特異性引物通過(guò)PCR技術(shù)驗(yàn)證了 flhB基因在不同血清型沙門菌及其它細(xì)菌中 的分布及片段大小。本發(fā)明的試劑盒能快速高通量鑒定雞白痢和雞傷寒沙門菌，可作為沙 門菌傳統(tǒng)血清學(xué)分型的輔助方法，并為雞白痢和雞傷寒沙門菌的監(jiān)測(cè)與實(shí)驗(yàn)室診斷提供了 一種簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好的新方法。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1:為在NCBI全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中Blastn搜索腸炎沙門菌flhB基因；其中， "Description"為含有flhB基因的細(xì)菌名稱，"Query cover"為搜索到的基因占目標(biāo)基因全 長(zhǎng)的覆蓋比率，" Ident"為flhB基因核苷酸序列的相似性，紅框表示僅有雞白痢和雞傷寒沙 門菌flhB基因缺少一段核苷酸序列。
[0026]圖2:為雞白痢和雞傷寒沙門菌flhB基因與其它血清型沙門菌flhB基因的差異示 意圖；其中，SP為雞白痢沙門菌，SG雞傷寒沙門菌。紅色箭頭表示flhB引物位置，雞白痢和雞 傷寒沙門菌擴(kuò)增的目的條帶為182bp，而非雞白痢和雞傷寒沙門菌擴(kuò)增的目的條帶為 379bp〇
[0027]圖3:為PCR鑒定flhB基因在不同血清型沙門菌和其它細(xì)菌中的分布和片段大小圖 片；其中，泳道M為：DL2000Marker;泳道C50041、C50336、SL5928、T3、T9、T8、G2、ZX、Y7、Y8和 C500為：flhB基因片段（379bp處有目的條帶），泳道S06004、9855和SG9為：flhB基因片段 (182bp處有目的條帶）；C50041和C50336為腸炎沙門菌，S06004和6508為雞白痢沙門菌，SG9 為雞傷寒沙門菌，SL5928為都柏林沙門菌，T3為烏干達(dá)沙門菌，T9為火雞沙門菌，T8為鴨沙 門菌，G2為倫敦沙門菌，ZX為羅森沙門菌，Y7為德?tīng)柋吧抽T菌，Y8為鼠傷寒沙門菌，C500為豬 霍亂沙門菌;H37Rv為結(jié)核分枝桿菌，11168和110為空腸彎曲菌，S19為布魯氏菌，EGDe和 JS15為李斯特菌，1314和1352為大腸桿菌。
[0028] 圖4 :為鑒定雞白痢和雞傷寒沙門菌的PCR檢測(cè)試劑盒靈敏度；其中，泳道M為： DL2000Marker;泳道1-8為雞白痢沙門菌S06004基因組，濃度依次為58 · 5ng/yl、5 · 85ngAU、 585pg/yl、58·5pg/yl、5·85pg/yl、585fg/yl、58·5fg/yl、5·85fg/yl。
[0029] 圖5 :為PCR鑒定雞場(chǎng)分離的I~24株沙門菌樣品中的雞白痢和雞傷寒沙門菌，其 中，泳道M為:DL2000Marker;泳道1~24為雞場(chǎng)分離的沙門菌;可擴(kuò)增出182bp f IhB目的條 帶的泳道為雞白痢和雞傷寒沙門菌。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案;還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031] 當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0032] 實(shí)施例1生物信息學(xué)方法鑒定f IhB基因的分布
[0033] 在 NCBI 中使用Blastn在線比對(duì)軟件（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast, cgi)在全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索f IhB基因，搜索結(jié)果表明所有雞白痢和雞傷寒沙門菌 flhB基因的內(nèi)部缺少197bp的核苷酸序列，其基因長(zhǎng)度是其它血清型沙門菌f IhB長(zhǎng)度的 83%(圖 1)。
[0034]雞白痢和雞傷寒沙門菌flhB核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具體為：
[0035] GTGGCAGAAGAGAGCGACGACGACAAAACAGAAGCCCCCACACCCCACCGACTTGAAAAAGCGCGGGAAGAAGGGCA GATCCCCCGTTCCAGAGAACTGACCTCACTGCTGATATTGCTGGTGGGCGTTTGTATTATTTGGTTCGGCGGCGAGT CGTTAGCGCGGCAACTGGCGGGAATGCTCTCAGCAGGCCTGCACTTCGATCACCGTATGGTGAACGATCCTAACCTG ATCCTGGGGCAGATAATTTTGCTGATTAAAGCGGCGATGATGGCACTGCTACCGCTCATCGCGGGCGTGGTACTGGT GGCGCTTATCTCGCCGGTTATGCTTGGCGGCCTGATTTTTAGCGGTAAGTCGCTACAGCCAAAATTTTCTAAATTAA ACCCGCTGCCGGGAATTAAGCGCATGTTTTCGGCGCAGACCGGCGCGGAACTGCTAAAAGCGGTGTTGAAATCCACG CTGGTCGGCTGCGTTACCGGCTTTTATCTCTGGTATCACTGGCCACAAATGATGCGCCTGATGGCGGAGTCGCCGAT CGTCGCAATGGGGAATGCGCTGGATCTGGTTGGACTCTGCGCGTTACTGGTGGTACTGGGCGTGATTCCGATGGTGG GATTTGACGTGTTTTTCCAGATCTTTAGCCACCTGAAAAAATTACGCATGTCGCGGCAGGACATTCGCGACGAATTT AAAGAGAGCGAAGGCGATCCGCATGTTAAGGGCAAAATTCGCCAGATGCAACGCGCCGCCGCTGGCGCGGGCATTAT ATCGCCACGCCGAAATCGGTCAGCAAATTCCCGGGCAGTTATATGCTGCCGTTGCGGAAGTGTTGGCCTGGGTCTGG CAGCTTAAACGCTGGCGGCTTGCGGGCGGGCAACGTCCTCCACAACCTGAGAACCTTCCGGTGCCAGAAGCGCTGGA TTTTATGAACGAGAAGAATACTGATGGCTAAo
[0036] 非雞白痢和雞傷寒沙門菌fIhB核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具體為：
[0037] GTGGCAGAAGAGAGCGACGACGACAAAACAGAAGCCCCCACACCCCACCGACTTGAAAAAGCGCGGGAAGAAGGGCA GATCCCCCGTTCCAGAGAACTGACCTCACTGCTGATATTGCTGGTGGGCGTTTGTATTATTTGGTTCGGCGGCGAGT CGTTAGCGCGGCAACTGGCGGGAATGCTCTCAGCAGGCCTGCACTTCGATCACCGTATGGTGAACGATCCTAACCTG ATCCTGGGGCAGATAATTTTGCTGATTAAAGCGGCGATGATGGCACTGCTACCGCTCATCGCGGGCGTGGTACTGGT GGCGCTTATCTCGCCGGTTATGCTTGGCGGCCTGATTTTTAGCGGTAAGTCGCTACAGCCAAAATTTTCTAAATTAA ACCCGCTGCCGGGAATTAAGCGCATGTTTTCGGCGCAGACCGGCGCGGAACTGCTAAAAGCGGTGTTGAAATCCACG CTGGTCGGCTGCGTTACCGGCTTTTATCTCTGGTATCACTGGCCACAAATGATGCGCCTGATGGCGGAGTCGCCGAT CGTCGCAATGGGGAATGCGCTGGATCTGGTTGGACTCTGCGCGTTACTGGTGGTACTGGGCGTGATTCCGATGGTGG GATTTGACGTGTTTTTCCAGATCTTTAGCCACCTGAAAAAATTACGCATGTCGCGGCAGGACATTCGCGACGAATTT AAAGAGAGCGAAGGCGATCCGCATGTTAAGGGCAAAATTCGCCAGATGCAACGCGCCGCCGCGCAGCGCCGCATGAT GGAAGATGTGCCGAAAGCGGACGTCATTGTCACTAACCCGACGCACTATTCCGTGGCGCTGCAGTATGACGAAAACA AAATGAGCGCGCCGAAAGTGGTCGCGAAGGGGGCTGGATTAATAGCGCTGCGCATTCGCGAGATCGGCGCTGAACAT CGGGTTCCCACTTTAGAAGCGCCGCCGCTGGCGCGGGCATTATATCGCCACGCCGAAATCGGTCAGCAAATTCCCGG GCAGTTATATGCTGCCGTTGCGGAAGTGTTGGCCTGGGTCTGGCAGCTTAAACGCTGGCGGCTTGCGGGCGGGCAAC GTCCTCCACAACCTGAGAACCTTCCGGTGCCAGAAGCGCTGGATTTTATGAACGAGAAGAATACTGATGGCTAAo
[0038]實(shí)施例2試劑盒的制備
[0039] 引物設(shè)計(jì)與合成：以flhB基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)并分析引物，并根據(jù)基因組DNA序列情 況，從中選擇最佳檢測(cè)用引物對(duì)，為更好顯示雞白痢和雞傷寒沙門菌flhB基因缺失的中間 片段所帶來(lái)的差異，選擇缺失片段附近的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（圖2)，其核苷酸序列如下表1 所示：
[0040] 表 1
[0042] 上述引物對(duì)可單獨(dú)包裝，也可以配成PCR檢測(cè)液。所述PCR檢測(cè)液中，上述引物對(duì)的 量采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉的常規(guī)用量即可。
[0043] 也就是說(shuō)，本發(fā)明的試劑盒，可以是含有上述獨(dú)立包裝的引物對(duì)，也可以是含有配 置好的含有引物對(duì)的PCR檢測(cè)液。
[0044] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還可以含有無(wú)菌水(ddH2〇)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、樣 品基因組DNA提取試劑等等。
[0045] 實(shí)施例3試劑盒檢測(cè)雞白痢和雞傷寒沙門菌的特異性鑒定
[0046] 采用實(shí)施例2所述試劑盒中的引物，以不同血清型沙門菌和其它細(xì)菌的基因組分 別為模板，PCR方法鑒定f IhB基因在不同細(xì)菌中的分布特點(diǎn)。
[0047] PCR 反應(yīng)體系為（254〇:(1(1!12〇16.2541^(1犯13241^10\?0?1311打612.541^彳1118-F IyUflhB-R lyL，模板2yL，rTaq酶0.25yL。
[0048] PCR 程序?yàn)?941€5111丨11;941€458,551€458,72 1€3〇8,30個(gè)循環(huán)；72。(：1〇11^11。
[0049] PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，PCR電泳結(jié)果表明所有雞白痢和雞傷寒沙門菌 基因組為模板的泳道中均有182bp目的條帶（圖3)，而其它血清型沙門菌的擴(kuò)增條帶為 379bp。表明以實(shí)施例2所述試劑盒中特定的f IhB擴(kuò)增引物，可以通過(guò)PCR方法快速鑒定未知 細(xì)菌是否為雞白痢和雞傷寒沙門菌。
[0050] 實(shí)施例4試劑盒檢測(cè)雞白痢和雞傷寒沙門菌的靈敏性鑒定
[0051 ]采用實(shí)施例2所述試劑盒中的引物，將雞白痢沙門菌S06004基因組依次10倍稀釋， 以稀釋的基因組為模板，鑒定試劑盒檢測(cè)雞白痢和雞傷寒沙門菌的靈敏性。
[0052] PCR 反應(yīng)體系為（254〇:(1(1!12〇16.2541^(1犯13241^10\?0?1311打612.541^彳1118-F IyUflhB-R lyL，模板2yL，rTaq酶0.25yL。
[0053] PCR 程序?yàn)?941€511^11;941€458,551€458,72 1€3〇8,30個(gè)循環(huán)；72。(：1〇11^11。
[0054] PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，PCR電泳結(jié)果表明基于f IhB的PCR檢測(cè)試劑盒可 檢測(cè)5.85pg/yl的雞白痢沙門菌基因組（圖4)。
[0055]實(shí)施例5試劑盒在雞場(chǎng)的應(yīng)用
[0056]采用實(shí)施例2中試劑盒，檢測(cè)24株雞場(chǎng)分離的沙門菌，可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出雞白痢 和雞傷寒沙門菌。具體步驟如下：
[0057] 1)沙門菌的分離
[0058]本試驗(yàn)中樣品采自江蘇某雞場(chǎng)，樣品的采集、增菌及沙門菌的分離和生理生化鑒 定參考現(xiàn)有技術(shù)中已建立方法（Li Y，et al.Food Control，2016;Cai Y，et al.Int J Food Microbiol ,2016)，本次試驗(yàn)共分離鑒定了24株沙門菌。
[0059] 2) PCR方法檢測(cè)樣本中雞白痢和雞傷寒沙門菌
[0060]將24株沙門菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C180rpm過(guò)夜培養(yǎng)，次日，以菌液為 模板擴(kuò)增flhB基因，PCR反應(yīng)體系為（25yL):ddH20 16.25yL，dNTP 2yL，10XPCR buffer 2 · 5yL，fIhB-F IyL，fIhB-R IyL，模板（菌液）2yL，rTaq酶0 · 25yL。PCR程序?yàn)?4 °C 5min; 94 °C 45s，55°C45s，72°C30s，30個(gè)循環(huán);72°C IOmin JCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，可擴(kuò)增出 182bp f IhB目的條帶的細(xì)菌則為雞白痢和雞傷寒沙門菌。結(jié)果顯示24株沙門菌中共有10株 含182bp flhB目的條帶，分別是4、5、8、12、13、14、16、19、22和24(圖5)，這些沙門菌即為雞 白痢和雞傷寒沙門菌。
[0061] 3)沙門菌的傳統(tǒng)血清型鑒定
[0062]本次試驗(yàn)分離的24株沙門菌的血清型鑒定參考現(xiàn)有技術(shù)中已建立方法(Li Y，et al.Food Control，2016;Cai Y，et al.Int J Food Microbiol ,2016)，血清型鑒定結(jié)果表 明24株沙門菌中共有10株雞白痢沙門菌，分別為4、5、8、12、13、14、16、19、22和24，？0?檢測(cè) 結(jié)果與血清型鑒定結(jié)果完全一致。
[0063] 在本實(shí)施例中，采用血清型鑒定的方法，將24株沙門菌中的雞白痢和雞傷寒沙門 菌篩選出來(lái)，需要至少2天的時(shí)間。而采用本發(fā)明實(shí)施例2的檢測(cè)試劑盒，僅需3個(gè)小時(shí)，即可 將24株沙門菌中的雞白痢和雞傷寒沙門菌準(zhǔn)確篩選出來(lái)，且正確率為100%。
[0064] 綜上所述，本發(fā)明試劑盒相較于傳統(tǒng)血清型鑒定方法的優(yōu)勢(shì)：
[0065] 傳統(tǒng)血清型鑒定需購(gòu)買特定的沙門菌血清型鑒定試劑盒，價(jià)格昂貴，步驟繁瑣，尤 其在大樣本中分離特定的血清型沙門菌（如雞白痢和雞傷寒沙門菌）時(shí)，需耗費(fèi)大量時(shí)間 (至少兩天），且工作量龐大，其結(jié)果是由肉眼進(jìn)行判斷，因而可能存在人為誤差；而本發(fā)明 試劑盒的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，成本非常低，且對(duì)細(xì)菌的存在形式?jīng)]有要求(單菌落、凍存菌 液或新鮮菌液均可），整個(gè)鑒定過(guò)程在三小時(shí)內(nèi)即可完成(包含PCR和瓊脂糖凝膠電泳），且 準(zhǔn)確率達(dá)到100 %。
[0066] 因此，本發(fā)明的一種快速鑒定雞白痢和雞傷寒沙門菌的PCR檢測(cè)試劑盒，有利于簡(jiǎn) 化沙門菌血清型鑒定的傳統(tǒng)步驟，為在大量樣本中篩選雞白痢和雞傷寒沙門菌提供了一種 快速鑒定的新方法。
[0067]上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速鑒定雞白痢和雞傷寒沙門菌的PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括flhB基 因檢測(cè)引物，所述flhB基因檢測(cè)引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的正向引物和核 苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的反向引物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有無(wú)菌水、dNTP、 PCR buffer、rTaq酶、樣品基因組DNA提取試劑中的一種或多種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有陽(yáng)性對(duì)照或陰性 對(duì)照中的一種或多種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性對(duì)照為雞白痢/傷寒沙門 菌flhB基因表達(dá)的DNA樣本。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述陰性對(duì)照可為非雞白痢/傷寒 沙門菌的DNA樣本。6. 如權(quán)利要求1~5任一權(quán)利要求所述的檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括如下步驟： (1) 提取樣品基因組DNA; (2) 加樣:將樣品基因組DNA、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照分別加入裝有PCR反應(yīng)體系的PCR管 中，獲得對(duì)應(yīng)的樣品反應(yīng)管、陽(yáng)性反應(yīng)管或陰性反應(yīng)管，所述PCR反應(yīng)體系中含有權(quán)利要求1 中的所述的flhB基因檢測(cè)引物； (3) PCR反應(yīng):反應(yīng)管置于PCR儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行PCR反應(yīng)； (4) PCR反應(yīng)結(jié)束后，分析結(jié)果。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法為非疾病診斷目的的方法。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，PCR反應(yīng)的條件設(shè)置為：（a)94 °C5min;(b)94°C45s ;(c)55°C45s;(d)72°C30s，步驟(b)~（d)循環(huán)30次，（e)72°C10min。9. 如權(quán)利要求1~5任一權(quán)利要求所述的檢測(cè)試劑盒在制備flhB基因檢測(cè)產(chǎn)品中的用 途。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述檢測(cè)產(chǎn)品用于檢測(cè)和篩選雞白痢/傷 寒沙門菌。
【文檔編號(hào)】C12R1/42GK106086209SQ201610628075
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月3日 公開(kāi)號(hào)201610628075.3, CN 106086209 A, CN 106086209A, CN 201610628075, CN-A-106086209, CN106086209 A, CN106086209A, CN201610628075, CN201610628075.3
【發(fā)明人】焦新安, 潘志明, 熊丹, 宋麗, 安樹(shù)敏, 耿士忠, 焦揚(yáng), 孫林, 陳祥, 黃金林, 殷月蘭
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)