專利名稱：無毒微生物及其用途傷寒沙門菌的制作方法
本申請是于1990年11月9日提出的未決的美國專利申請No.07/612，001的繼續(xù)申請，該US申請No.07/612，001是于1988年6月1日提出的美國專利申請系列號No.200934的繼續(xù)申請，該No.200934又是于1987年6月4日提出的未決的美國專利申請系列號No.058360的繼續(xù)申請，該US系列申請?zhí)?00934也是于1988年10月3日提出的未決的美國專利申請系列號No.251304的繼續(xù)申請。該US No.251304則是于1987年10月7日提出的未決的美國專利申請No.106072的繼續(xù)申請。這些申請均作為參考而引入本文。
本發(fā)明涉及無毒微生物，它們的制備方法以及它們在疫苗中的運用，更進一步說，它涉及無毒傷寒沙門菌(S.typhi)。
對于不發(fā)達世界的居民以及走訪過流行區(qū)域的工業(yè)化國家的旅游者以及在實驗室中從事熟練試驗的臨床微生物學(xué)家們來說，因為傷寒沙門菌而引起的傷寒熱仍然是一個重要的公共健康問題?，F(xiàn)有獲得許可的腸胃外殺死整個細(xì)胞的傷寒疫苗是保護性的，但它會頻繁引起令人不能接受的明顯的系統(tǒng)和局部有害反應(yīng)(Levine，Typhoid fever Vaccines，in plothin SA，Mortimer EA Jr.(eds)VACCINES.Philadelphia，WB Saunders，1988，pp.333-361)，其它疫苗包括最近獲得許可的活口服疫苗菌株Ty21a和實驗性腸胃外Vi多糖疫苗。
口服疫苗的優(yōu)點在于能將復(fù)制組織輸送到粘液免疫系統(tǒng)中，在該系統(tǒng)中局部反應(yīng)能被最大限度地激發(fā)。此外，減弱毒性的傷寒沙門菌是一種有吸引力的候選物，可用它作為載體疫苗以表達外源抗原，并將它們輸送到人體免疫系統(tǒng)中。但是，要想成功地將這種方法用于免疫人體的一個關(guān)鍵先決條件是，必須具有高度致免疫作用而又安全的減毒傷寒沙門菌菌株，以便將外源蛋白及多糖抗原輸送到免疫系統(tǒng)中。
現(xiàn)有的以Ty21為基礎(chǔ)的口服疫苗有幾個缺陷，Ty21a其致免疫性較低且需要多次口服劑量才能免疫，當(dāng)大規(guī)模地將其發(fā)酵及凍干時，其存活有機體的產(chǎn)量較低。此外，Ty21a中除了qalE和Via以外還有多個至今尚未確定的突變。(Hone等人，1987，J.Infect，Dis.156167-174;Hone等人，1988，J.Infect，Immun.561326-1333)。
表達宋內(nèi)志賀菌(shigella，snnei)抗原(Formal等人，1981.Infect.Immun.34746-750)或霍亂弧菌(vibrio cholerae)01血清型Inaba的O抗原(Forrest等人，1989.J.Infect.Dis.159145-146)的Ty21a的構(gòu)件已經(jīng)在人體中進行了臨床試驗。盡管在北美志愿者身上試驗的兩組Ty21a/宋內(nèi)志賀菌構(gòu)件對用病原宋內(nèi)志賀菌進行的實驗感染具有有效的保護性。但各組之間均有所不同，且其他幾組沒有保護性(Black等人，J.Infect.Dis.1987.1551260-1627);Herrington等人。1990，vaccine8353-357)。Ty210/Inaba構(gòu)件只在少數(shù)疫苗中且低滴度地誘發(fā)血清Inaba殺弧菌抗體和腸SIgA抗-InabaO抗體。(Tacket等人，1990，Infect.Immun.1620-1627)在用病原霍亂弧菌01進行的實驗攻擊研究中，該構(gòu)件的受體沒有完全對腹瀉產(chǎn)生有效保護，但它確實減輕了腹瀉且瀉出較少野生型霍亂弧菌細(xì)胞(Tacket等人，Id)。
采用Ty21a作為候選載體菌株的主要缺陷在于其致免疫性有限，對其分子基礎(chǔ)上的減毒缺乏準(zhǔn)確的情報，以及該菌株的細(xì)菌遺傳控制(例如轉(zhuǎn)化，電穿孔術(shù)及重組頻率)中存在實際困難，此外在凍干培養(yǎng)恢復(fù)之后，其存活力極低。
本申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了新的對病毒性感染用疫苗進行保護的方法，在這些疫苗中采用了轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的有毒試劑的無毒突變，在該方法中，導(dǎo)致無毒損傷不可能因飲食或其它任何由動物宿主所提供的東西而恢復(fù)。本申請人的初始工作有些已在歐洲專利公開No.315，682(1987年5月17日公開)和專利合作條約(PCT)公開No.WO88/09669(1988年12月15日公開)中描述過，這些工作包括，通過在鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)腺苷酸環(huán)化酶基因(Cya)和環(huán)化Amp受體蛋白基因(Crp)中導(dǎo)入缺失突變來制備無毒微生物的方法。本申請人還提供了用于制備其它類型的無毒突變細(xì)胞的方法。這些突變細(xì)胞可望用作表達重組抗原的載體細(xì)胞。這些細(xì)胞的特征在于缺少編碼細(xì)胞存活所必需的酶的功能性天生基因，其中該酶催化一種基本細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組分生物合成過程中的一個步驟，另一特征系存在一種編碼該天然酶之功能替代物的一種酶的一級重組基因，其中該一級重組基因不能取代該缺陷性染色體基因。在這些細(xì)胞中，一級重組基因與編碼所需產(chǎn)物的二級重組基因在結(jié)構(gòu)上相連，失去一級重組基因?qū)⑹乖摷?xì)胞發(fā)生溶解，這些方法已公開在世界專利Wo89/03427(1989，4月20日公開)中，上面所述的專利申請以及相應(yīng)國家的專利申請公開的內(nèi)容均作為參考而引入本文。
本發(fā)明部分是基于新的無毒傷寒沙門菌衍生物，這些衍生物未公開在歐洲專利公開No.315682中。除此之外，本發(fā)明包括這些新型傷寒沙門菌衍生物在商業(yè)疫苗中的運用，激發(fā)免疫系統(tǒng)使之對傷寒沙門菌的致免疫抗原產(chǎn)生應(yīng)答的方法以及激發(fā)該免疫系統(tǒng)使之對一種病原體的致免疫抗原產(chǎn)生應(yīng)答的方法。本申請所提供的菌株可以直接和間接地適用于制備商業(yè)疫苗以預(yù)防因傷寒沙門菌和其它腸細(xì)菌(它與傷寒沙門菌抗體交叉反應(yīng))而引起的疾病。這些菌株還可用作為載體微生物以制備在細(xì)菌細(xì)胞中于重組基因上編碼的表達產(chǎn)物。
因此，本發(fā)明的一個具體方案是一種用于個體免疫的致免疫組合物，它包含在一種生理學(xué)上可接受的賦形劑中在cya基因中有一種突變的傷寒沙門菌(S.typhi)的無毒衍生物。
本發(fā)明的另一具體方案是在cya基因中有一種突變的傷寒沙門菌的一種分離無毒菌株。
本發(fā)明的另一具體方案是一種用于個體免疫的致免疫組合物，它包括在Crp基因中有一種突變的傷寒沙門菌的無毒衍生物。
本發(fā)明的另一具體方案是Crp基因中有一種突變的傷寒沙門菌的分離無毒菌株。
本發(fā)明的另一具體方案是一種用于個體免疫的致免疫組合物，它包括傷寒沙門菌的一種無毒衍生物。該衍生物在cya基因中有一種突變且在crp基因中有一種突變。
本發(fā)明的另一具體方案是傷寒沙門菌的一種分離無毒菌株，它在cya基因和crp基因中有一種突變。
本發(fā)明的另一具體方案是一種用于個體免疫的致免疫組合物，它包括cdt基因中有一種突變的沙門菌的無毒衍生物。
本發(fā)明的另一具體方案是cdt基因中有一種突變的沙門菌的分離無毒菌株。
本發(fā)明的另一具體方案是選自菌株X3958，X4323，X3926，X3927，X4297，X4346，X3940，X4073，及其衍生物的分離菌株。
本發(fā)明的另一具體方案是一種使用cya基因中有一種突變的無毒傷寒沙門菌的一種菌株的方法，該方法包括通過將菌株懸浮于一種生理學(xué)上可接受的賦形劑中制備一種致免疫組合物。
本發(fā)明的另一具體方案是一種使用crp基因中有一種突變的無毒傷寒沙門菌的一種菌株的方法，該方法包括通過該菌株懸浮于一種生理學(xué)上可接受的賦形劑中制備一種致免疫組合物。
本發(fā)明的另一具體方案是使用一種cdt基因中有一種突變的無毒沙門菌的一種菌株的方法，該方法包括通過將該菌株懸浮于一種生理學(xué)上可接受的賦形劑制備一種致免疫組合物。
本發(fā)明的另一具體方案是具有cdt突變體的傷寒沙門菌的分離菌株。
附圖簡述

圖1.A表示在口服接種9×108CFU X3622(Δ〔crp-cysG〕-10)、1×109CFU X3737(pSD 110+/Δ〔crp-cysG〕-10)和1×109CFU X3339(野生型)后的某些特定時間，從8周大的BALB/C小鼠的派伊爾(peyer)結(jié)中回收的CFU值。對于每一個時間點殺死三只小鼠，其結(jié)果用幾何平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
圖1.B表示在口服接種9×108CFU X3622(Δ〔crp-cysG〕-10)，1×109CFU X3737(pSD110+/Δ〔crp-cysG〕-10)和1×109CFU X3339(野生型)后的某些特定時間，從8周大的BALB/C雌性小鼠的脾中回收的CFU值。對于每一個時間點采用三只小鼠，其結(jié)果用幾何平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
圖2是PYA1077的局部限制圖，將取自λgt11克隆L14的1.0kb M.Leprae(麻瘋桿菌)嵌入DNA片段亞克隆到pYA 292的EcoRⅠ位點中。在該M.leprae嵌入DNA中有一單個不對稱的SalⅠ位點。對于下面的限制性核酸內(nèi)切酶，則在該M.leprae嵌入DNA中沒有位點BamHⅠ.HindⅢ，PstⅠ和XbaⅠ。
圖3是一個半程復(fù)制過程。它表示對由帶有PYA1077和PYA1078的傷寒沙門菌，鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌制成的蛋白質(zhì)的Western印跡分析。將在硝基纖維濾紙上的蛋白質(zhì)與來自21名瘤型麻瘋病人的混合血清進行反應(yīng)。線1分子大小標(biāo)記物(尺寸表示在印跡的左邊);線2由帶有PYA292的傷寒沙門菌X4297特定的蛋白質(zhì);線3到5由3種均含有PYA1078的獨立傷寒沙門菌X4297分離物特定的蛋白質(zhì);線6到8由3種含有PYA1077的單獨分離的傷寒沙門菌X4297特定的蛋白質(zhì);線9由帶有PYA1077的鼠傷寒沙門菌X4072特定的蛋白質(zhì);線10由帶有PYA1075(一種含有1.0kb M.leprae DNA插入物的pUC8-2衍生物，該DNA插入物取自λgt11克隆L14，L14正如在PYA1077中一樣相對LacZ啟動子具相同取向)的大腸桿菌X6060特定的蛋白質(zhì)。注意由PYA1075特定的免疫學(xué)上的活性蛋白比由PYA1077特定的稍微大些，是因為它是一種帶β半乳糖苷酶的α區(qū)域的融合蛋白。
圖4是一種半程復(fù)制過程，它表示對由λgt11∷M.leprae克隆L14和帶有PYA292，PYA1077和PYA1078的傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌菌株制備的蛋白質(zhì)的Western印跡分析。
圖5表示傷寒沙門菌Ty2和ISP1820的野生型和突變菌株在人體血清中在37℃下的生長情況。
實施本發(fā)明的方式本發(fā)明是基于這么一個發(fā)現(xiàn)，即某些突變可以使微生物無毒且基本不影響其致免疫性。更進一步說，本發(fā)明涉及微生物疫苗，在該疫苗中該微生物攜帶缺失(開放三角或Δ)突變體Δcya和/或Δcrp，該突變Δcya和/或Δcrp分別除去了合成腺苷酸環(huán)化酶(ATP焦磷酸溶解酶(環(huán)化)EC4.6.1.1)和環(huán)AMP受體蛋白(CRP)的能力。
環(huán)-3′5′-AMP(cAMP)和環(huán)AMP受體蛋白是轉(zhuǎn)錄與大量降解物的輸送及斷裂有關(guān)的大量基因和操縱子所必需的。已經(jīng)有證據(jù)證明用于輸送燃料/碳源的系統(tǒng)受到cAMP的正性控制，就象幾種氨基酸透酶一樣。除了其在分解代謝過程中的重要作用以外，細(xì)胞中的cAMP濃度也影響瞬間噬菌體的溶原化作用，菌毛的合成，鞭毛的合成以及至少一種外膜蛋白的合成。盡管cAMP存在于哺乳動物細(xì)胞中，但其在巨噬細(xì)胞和其他沙門菌可以侵入并繁殖的細(xì)胞中濃度低于0.1到1.0mM cAMP，此為造成體外Δcya突變表現(xiàn)出野生型表型所需濃度。另外，該Δcrp突變的卷入將因這樣的Δcya突變體而基本上消除了由于體外或體內(nèi)攝入cAMP而可以自然增長的益處。
利用轉(zhuǎn)座子將突變從其他沙門氏菌株中移入傷寒沙門氏菌中可以實現(xiàn)將突變引入傷寒沙門菌的cya和crp中。轉(zhuǎn)座子可以在許多點加入到細(xì)菌染色體中，轉(zhuǎn)座子的插入及缺失的特點已由Kleckner等人(1977)在J.Mol.Biol.116125中加以綜述。舉例來說，可以用具有四環(huán)素抗性(及對鐮孢菌酸敏感)的轉(zhuǎn)座子Tn10在多種細(xì)胞包括大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌中產(chǎn)生Δcya和Δcrp突變，歐洲專利公開No.315682中描述了在鼠傷寒沙門菌中產(chǎn)生和除去這些突變的方法，在下面的實施例中還要提供一種方法。利用Tn10可以將這些突變轉(zhuǎn)移到各種傷寒沙門菌的分離物中，優(yōu)選轉(zhuǎn)移到那些具有高致病性的細(xì)菌中。在下面的實施例中將描述將Δcya和Δcrp突變由鼠傷寒沙門菌移入野生型傷寒沙門菌株中的實例。
一旦通過導(dǎo)入Δcya和或Δcrp突變而導(dǎo)致無毒之后，該微生物就可以用作為疫苗的致免疫組分以對該微生物誘發(fā)免疫性。
在本發(fā)明的另一實施方案中，優(yōu)選通過缺失作用在主管沙門菌毒性的crp基因鄰近基因中，可以使該具有cya突變和/或crp突變的傷寒沙門菌進一步突變，在該基因即cdt基因中的突變降低了該細(xì)菌有效移生深部組織的能力，如脾。當(dāng)將具有crp+基因的質(zhì)粒放入攜帶Δ(crp-cdt)的菌株中時，它仍保持無毒并具有致免疫性。從而具有類似cya和crp突變體的表型。攜帶質(zhì)粒上含有crp+基因的Δ(crp-cdt)突變的突變體仍保持其正常的移生腸道及GALT的能力，但其移生更深部組織的能力則降低了。在這些實施例中，原始Δ(crp-cdt)突變(如在X3622中分離的)也失去了argD和cysG基因，這些基因需要精氨酸和半胱氨酸供其生長;這種突變等位基因已被命名為Δ(crp-cysG)-10。含有較短缺失的第二種突變體也被分離出來了。它未強加精氨酸需求;它存在于X3931中并被命名為Δ(crp-cysG)-14。在傷寒沙門菌中的cdt中的突變可以直接產(chǎn)生，也可以通過從鼠傷寒沙門菌菌株(例如在實施例中所述的)變換而引入。另外，利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)以及通過利用本文中所述的特點進行表型選擇，還可以在其它的沙門菌菌株中產(chǎn)生cdt突變。此外，利用本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)，可以將Δcdt突變由這些實施例中所述的鼠傷寒沙門菌變換到其它沙門菌菌株中。
在本發(fā)明的另一實施方案中，可以將病原性傷寒沙門菌的無毒衍生物用作為載體細(xì)菌以便將選定的抗原傳送到GALT中，例如傳送到回腸的Peyer結(jié)中。已經(jīng)知道沙門菌是位于Peyer結(jié)中(carter，P.B.和F.M.Collims.J.Exp.Med.1391189(1974))。鼠傷寒沙門菌-大腸桿菌雜種也顯示出能移生小鼠中的Peyer結(jié)(Hohmann，A.W.等人，Infect.and immun.22763，1978)，如果這些載體細(xì)菌能含有并表達來自病原生物體重組基因，則將會誘導(dǎo)由該病原體產(chǎn)生的抗原基因產(chǎn)物的抗體。隨著重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，獲得完全獨特的能產(chǎn)生特異抗原的疫苗現(xiàn)在已經(jīng)成為可能，它不必通過病原學(xué)試劑，而是通過能表達該抗原基因的另一種細(xì)菌宿主菌株。當(dāng)抗原可以和該哺乳動物宿主的抗原交叉反應(yīng)且由此加強自免疫的誘發(fā)能力時，也可以采用重組DNA技術(shù)去改變該基因，從而使起作用的交叉反應(yīng)抗原確定子不能形成。因此，重組DNA技術(shù)可用來制備這類疫苗這些疫苗不含有任何能與脊椎動物宿主抗原交叉反應(yīng)的物質(zhì)或任何能激發(fā)自免疫狀態(tài)的物質(zhì)。
制備能用作為載體細(xì)菌的生物體，特別是沙門菌的方法在Wo89/03427(1989年4月20日公開)和美國專利申請系列No.07/251304(1988年10月3日提出)中討論過，該美國專利申請已被共同擁有。這兩篇參考文獻作為參考而引入本文。通常，對沙門菌進行處理，使之在編碼一種細(xì)胞存活所必需的酶的染色體基因中產(chǎn)生一種突變，其中所述的酶能催化生物合成基本細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組分的過程中的一個步驟。將一種額外染色體遺傳成分例如一種重組載體引入該突變細(xì)胞中，該遺傳成分含有一級重組基因，該基因編碼一種酶，該酶是該天然酶的一種功能取代物，但是該一級重組基因不能取代該有缺陷的染色體基因。這種一級重組基因與編碼所需產(chǎn)物的二級重組基因在結(jié)構(gòu)上相連，將在載體微生物中被表達。失去一級重組基因?qū)乖摷?xì)胞在處于下述環(huán)境中時發(fā)生溶解由于一級重組基因表達的產(chǎn)物不存在時。
編碼細(xì)胞存活所必需的酶的許多基因(該酶能催化生物合成基本細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組分的過程中的一個步驟)，是本領(lǐng)域內(nèi)所熟悉的，例如天冬氨酸半醛脫氫酶(Asd)，它是由asd基因編碼的。實施例中描述了一種利用轉(zhuǎn)座子誘變將一種缺失突變引入傷寒沙門菌的asd基因中的方法。在這些實施例中還描述了一種遺傳成分的構(gòu)建過程，該遺傳成分?jǐn)y帶asd基因的功能取代物，與一種編碼欲在無毒載體傷寒沙門菌中表達的抗原的基因相連。
很顯然，在局部免疫具有重要意義且可能是第一道防線的地方，本發(fā)明可以廣泛地用于開發(fā)對細(xì)菌、真菌、寄生蟲或病毒致病劑的有效疫苗。有些實施例是用于控制下列病癥的疫苗由耶爾辛鼠疫(Yersinia pestis)引起的肺鼠疫，由淋病奈琵菌(Neisseria gonorrhoexe)引起的淋病，由梅素螺旋體(Treponema pallidum)引起的梅毒，和性病以及由沙眼衣原體(Chlamydia trachomalis)引起的眼睛感染。來自A組和B組的鏈球菌種，例如那些引起喉嚨痛或心臟病的菌種，奈琵腦膜炎菌，肺炎支原菌，流感嗜血桿菌，百日咳桿菌，結(jié)核分支桿菌，麻風(fēng)分支桿菌，Bordetella avium，大腸桿菌，類馬鏈球菌，肺炎雙球菌，流產(chǎn)布魯桿菌，溶血性巴士德菌，霍亂弧菌，志賀菌種和Legionella pneumophila是另外一些屬于本發(fā)明的范圍可以獲得基因的細(xì)菌例子，本發(fā)明還包括病毒疫苗，例如那些抗流感病毒的疫苗。可以生產(chǎn)抗其他病毒的疫苗，不管它是DNA病毒還是RNA病毒，舉例來說，如那些來自乳多空病毒(papovirus)腺病毒，皰疹病毒，痘病毒，細(xì)小病毒，呼吸道腸道病毒，微小RNA病毒，粘液病毒，副粘液病毒，或逆轉(zhuǎn)病毒這類病毒。本發(fā)明還包括用于對病原真菌，原蟲和寄生蟲感染具保護性的疫苗。
在進一步的實施方案中，當(dāng)疫苗的致免疫組分是宿主的過敏原時，可以將這些疫苗用于專門使過敏宿主解除過敏的暴露過程中。
在其一種實施方案中，本發(fā)明被描述成一種用于脊椎動物或非脊椎動物免疫的疫苗，它包括一種活的病原微生物的無毒衍生物，該衍生物不能產(chǎn)生功能性腺苷酸環(huán)化酶和cAMP受體蛋白，但能表達來自一種生物體的重組基因，該生物體是所述動物的一種病原，或產(chǎn)生一種所述動物的過敏原。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的無毒微生物可以用作為合成各種宿主蛋白的載體，由于本發(fā)明的無毒微生物在引入宿主后能橫越多種免疫活性結(jié)構(gòu)，包括GALT，腸系膜淋巴結(jié)和脾，故這種微生物可用來將多種免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)物作為藥靶。因此，可以將一種或多種編碼免疫調(diào)整蛋白或肽的基因通過重組引入該無毒微生物中，從而當(dāng)這些微生物停留在合適的免疫活性組織中時它們就能表達該重組產(chǎn)物，以抑制、增強或修飾宿主中的免疫應(yīng)答。這種免疫調(diào)整分子的例子包括(但不限于)菌落激發(fā)因子(巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞或混合物)，巨噬細(xì)胞化學(xué)毒素、巨噬細(xì)胞抑制因子、白細(xì)胞抑制因子、淋巴毒素，母細(xì)胞化因子，干擾素以及內(nèi)白細(xì)胞素。
本發(fā)明的另一實施方案是采用其中的無毒微生物去輸送并制備藥理學(xué)上活性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以激發(fā)或抑制多種生理功能(即生長速度、血壓等)。
在精心考慮所有上述特點后的一個實施例中，本發(fā)明的主題是傷寒沙門菌的無毒菌株，它在cya和/或crp基因中帶有突變。
利用其它本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)也能實現(xiàn)在傷寒沙門菌(包括那些在cdt中還含有突變和/或在載體微生物中含有突變的菌株)中產(chǎn)生cya和/或crp突變。這些技術(shù)，例如包括標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)和/或利用重組DNA技術(shù)。然后根據(jù)表型特點選擇所需的突變體，其中的一部分特點將在下文，在實施例中描述，并示于表8中。
在下面的討論中將對本發(fā)明的這些實施例中的每條術(shù)語進行分析。
致免疫試劑是指一種用來激發(fā)活生物體的免疫系統(tǒng)的試劑，由此使該免疫系統(tǒng)的一種或多種功能獲得提高并指向該致免疫試劑。致免疫試劑包括疫苗，利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)可以將致免疫試劑用于制備抗體，分離多克隆抗體和單克隆抗體均可。
所謂疫苗是指一種用來激發(fā)活生物體的免疫系統(tǒng)，而對將要遇到的有害物提供保護的試劑。免疫是指誘發(fā)持續(xù)高水平抗體和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的過程，在該過程中T-淋巴細(xì)胞可以殺死病原體和/或激發(fā)其他細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)在生物體中做此工作，該免疫反應(yīng)是針對該有機體先前所暴露于其中的病原體或抗原的。盡管短語“免疫系統(tǒng)”可以包括單細(xì)胞生物體對外源體存在(如產(chǎn)生干擾素)的應(yīng)答，但在本申請中，該短語僅指多細(xì)胞生物體產(chǎn)生對抗原物質(zhì)的抗體的解剖特征及機理，其中所述的抗原物質(zhì)侵入該生物體的細(xì)胞或該生物體額外細(xì)胞流體中。由此產(chǎn)生的抗體可以屬于任何一種免疫學(xué)類型，例如免疫球蛋白A、D、E、G或M。盡管本發(fā)明的疫苗并不僅限于那些激發(fā)IgA生成的疫苗，但其中特別感興趣的是那些激發(fā)免疫球蛋白A(IgA)生成的疫苗，這是因為免疫球蛋白A是由暖血動物的分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。舉例來說，除形成IgA之外，本文所述的天然疫苗還很可能產(chǎn)生寬范圍的其他免疫應(yīng)答，例如細(xì)胞和體液免疫?？乖拿庖叻磻?yīng)已被人們深入研究并廣泛報導(dǎo)了。Barrett.James.T.在Textbook of lmmunology(第四版，C.V.Mosby公司，St.Louis.Moo(1983))一書中對免疫學(xué)進行了綜述，該書作為參考而引入本文。
脊椎動物可以是亞門脊椎動物(脊索門中的一個基本部分)中任何一種成員，包括魚類、兩棲類、爬行動物、鳥類以及哺乳動物，所有這些動物的特征在于具有成段的骨胳或軟骨脊柱。所有脊椎動物具有功能免疫系統(tǒng)并通過產(chǎn)生抗體而對抗原產(chǎn)生應(yīng)答。因此，所有的脊椎動物均能對疫苗起反應(yīng)。盡管疫苗通常大多是施用于哺乳動物，如人類或狗(狂犬疫苗)身上的，但用于商業(yè)上培養(yǎng)其他種類的脊椎動物如魚類和鳥類(如果它們具有本文中所述的性能)疫苗也屬于本發(fā)明的范圍。
無脊椎動物可以是除脊椎動物外的動物界中任何一種成員。這類動物組成了無脊椎門(Division lnvertebrata)，不具備脊骨或脊柱。這類動物包括所有除魚類、兩棲類、爬行動物、鳥類及哺乳動物之外的動物。許多無脊椎動物對抗原刺激能誘發(fā)產(chǎn)生初級免疫應(yīng)答，而且對感染脊椎動物且在本發(fā)明中所描述的相同微生物敏感。這類無脊椎動物的例子如牡蠣和軟體動物以及其它相近的動物。盡管用疫苗保護無脊椎動物的技術(shù)至今尚未被人們廣泛記載，但熟悉本領(lǐng)域的人員將會認(rèn)識到通過利用無脊椎動物的初級免疫系統(tǒng)也可以將本發(fā)明用到所述的無脊椎動物上。舉例來說根據(jù)本發(fā)明，牡蠣對沙門菌感染的敏感性可以使我們向其引入沙門菌種的無毒菌株，從而使其初級免疫系統(tǒng)具有應(yīng)答的潛力。因此，使用能夠感染無脊椎動物的致病微生物的無毒衍生物，從而從存在于所述無脊椎動物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)激發(fā)對病原的應(yīng)答，此用途亦屬于本發(fā)明的范圍。
用本發(fā)明的疫苗進行處理的“個體”在本文中定義為包括所有脊椎動物，如哺乳動物(包括家養(yǎng)動物和人類)、各種鳥(包括家養(yǎng)鳥)，特別是那些對農(nóng)業(yè)具有重要意義的動物。此外，軟體動物以及其它一些無脊椎動物具有初級免疫系統(tǒng)，它們也屬于一種“個體”。
本發(fā)明的一個具體方案是采用與GALT或BALT相連、侵入并持續(xù)存在于該GALT或BALT中的病原微生物的無毒衍生物，作為基因產(chǎn)物的載體，該基因產(chǎn)物是用來對病原體或過敏原激發(fā)抗體應(yīng)答的。無毒并不是說這類種微生物不能起一種病原體的作用，而是指所用的這種特殊微生物相對所處理的特殊動物來說是無毒的。該微生物可以屬于一類或甚至一種其他通常是會致病的，但必須屬于是一種無毒的菌株。而致病是指能引起疾病或損害正常的生理功能。無毒菌株不能產(chǎn)生一整套通常與其有毒病原同伴相關(guān)的疾病癥狀。本文所用的微生物包括細(xì)菌、原蟲以及單細(xì)胞真菌。
用于將遺傳物質(zhì)從第一種生物體轉(zhuǎn)移到通常不與第一種生物體交換遺傳物質(zhì)的第二種生物體中的技術(shù)，近來隨著重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展而變得廣泛可行。在本申請中，被從一種生物體轉(zhuǎn)移到第二種生物體中(并且其轉(zhuǎn)移方式要保證該第二種生物體的繁殖能產(chǎn)生含有相同遺傳物質(zhì)的后代)的遺傳物質(zhì)被認(rèn)為是一種重組基因。術(shù)語“基因”在本文中使用最為廣泛的意義是代表任何一種生物遺傳單位。該重組基因不一定是象存在于母體生物體中的一種完整的基因，其能產(chǎn)生巨型分子(如一種功能多肽)或調(diào)節(jié)該巨型分子的產(chǎn)生，只需要該基因能起一種模板作用，作為抗原產(chǎn)物形成過程中的導(dǎo)物。該產(chǎn)物可以是一種在母體生物體中找不到精確形式的東西。舉例來說，可以將一種編碼含100氨基酸殘基的多肽抗原的功能基因部分轉(zhuǎn)移到一種載體微生物中，從而通過該宿主細(xì)胞的細(xì)胞作用產(chǎn)生一種只含75個、或者甚至10個氨基酸殘基的肽。但是，如果說基因產(chǎn)物是一種抗原，該抗原能導(dǎo)致對存在于該母體生物體中的相似抗原的抗體的形成，那么就可以認(rèn)為這種基因是在如本發(fā)明所定義的術(shù)語“基因”的范圍內(nèi)。另一方面，如果一種特定抗原的氨基酸順序或其片段是已知的，則通過自動基因合成器或其類似裝置就可以化學(xué)合成該DNA片段或其類似物，并且將所述的DNA順序引入合適的表達載體中。在該系列的另一端是一長段編碼幾種基因產(chǎn)物的DNA，其中的一種或其全部可以是抗原的，這樣此處定義和要求保護的基因即是能產(chǎn)生抗原的任何遺傳單元，該基因可以是染色體、質(zhì)?；虿《驹?。
為了使該基因能有效地誘發(fā)免疫應(yīng)答，就必須表達該基因?！氨磉_一種基因”是指通過該基因所在的細(xì)胞的生化作用將該基因的結(jié)構(gòu)的固有信息(DNA堿基的順序)轉(zhuǎn)化成一種物質(zhì)產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以是一種RNA分子、多肽或其它生物分子形式。由此產(chǎn)生的生物分子叫做基因產(chǎn)物。這里所用的術(shù)語“基因產(chǎn)物”是指通過在基因控制下進行的生化反應(yīng)而產(chǎn)生的任何一種生物產(chǎn)物或多種產(chǎn)物。該基因產(chǎn)物例如可以是一種RNA分子，一種肽，或一種在酶或其它分子(該基因的起始產(chǎn)物、即一種代謝產(chǎn)物)的控制下產(chǎn)生的產(chǎn)物。舉例來說，一種基因可以首先控制一種RNA分子的合成，該RNA分子通過核糖體的作用被轉(zhuǎn)譯成一種酶，這種酶在該原始細(xì)胞(該基因存在其中)之外的環(huán)境中控制聚糖的形成。RNA分子、酶以及聚糖均是這里所述的基因產(chǎn)物。如果引入動物的免疫系統(tǒng)中，這些產(chǎn)物中的任何一種以及許多其它類型的基因產(chǎn)物，如糖蛋白和多糖將起抗原作用。蛋白基因產(chǎn)物，包括糖蛋白和脂蛋白是優(yōu)選的用作為疫苗中的抗原的基因產(chǎn)物。
為了使疫苗能有效地產(chǎn)生抗體，該抗原物質(zhì)必須以這樣一種方式被釋放，即接種過疫苗的動物的抗體產(chǎn)生機理能發(fā)揮作用。因此，必須將該基因產(chǎn)物的微生物載體引入該動物中。為了如前所述地激發(fā)優(yōu)選的GALT或BALT細(xì)胞的應(yīng)答，優(yōu)選將該微生物或基因產(chǎn)物直接導(dǎo)入內(nèi)臟或支氣管中，例如可以通過口服、胃插管接種或以氣溶膠形式。當(dāng)然，也可以使用其它方法施用疫苗，例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下注射或乳房內(nèi)或陰莖內(nèi)或陰道內(nèi)給藥。
當(dāng)將無毒微生物用作載體微生物并且一旦該載體微生物存在于動物中時，該動物的免疫系統(tǒng)就需要能得到抗原，這一點可以在該載體微生物死亡時實現(xiàn)，此時抗原分子被釋放出。當(dāng)然也可能利用能釋放胞質(zhì)體且不發(fā)生溶解而“泄漏”無毒突變體。另外，也可以選擇一種能控制抗原的生成過程的基因，該抗原可以在該細(xì)胞死亡之前在外部環(huán)境中由該載體細(xì)胞獲得。以此方式，就可以使用一種活的微生物，該微生物將生存于接種過疫苗的動物中，例如在Peyer結(jié)中，并且可以持續(xù)地產(chǎn)生抗原，從而持續(xù)地誘發(fā)抗體形成。在這些環(huán)境下優(yōu)選的基因產(chǎn)物是一種可以穿過細(xì)胞膜而進入外部環(huán)境的產(chǎn)物或是一種與該外膜相連或嵌入該外膜從而使該基因產(chǎn)物全部或部分向環(huán)境暴露的產(chǎn)物。后一類基因產(chǎn)物的典型代表是通常在需要保護的生物體的表面上發(fā)現(xiàn)的抗原。如果將這些抗原以正常方式傳送到細(xì)胞表面上，則對該抗原的抗體形成將獲得提高。
利用病原將來自其它病原的抗原輸送到GALT或BALT中，如果此時不能使這類病原無毒同時保持其移生Peyer結(jié)或BALT的能力，那么將是不合適的。
衍生該重組基因的生物體可以是接種動物的任何一種病原體，或者是一種能產(chǎn)生該動物的一種過敏原或其它抗原的生物體。過敏原是指能在將要接種抗該過敏原的動物中引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)。有許多種不同的物質(zhì)是過敏源，例如動物毛發(fā)皮屑和花粉，對于任何一種特定的過敏源各個動物的過敏反應(yīng)也將不同。在具有正常過敏應(yīng)答的動物中可能誘發(fā)對過敏源的耐受性。誘發(fā)耐受性的方法已為人們熟知，它通常包括以遞增劑量向動物施用該過敏原。有關(guān)耐受性誘發(fā)的進一步討論在前面引用的Barrett textbook中給出。最后，當(dāng)由載體表達免疫調(diào)整基因或其它藥理活性物質(zhì)的基因時，宿主生物體本身可以起一種遺傳物質(zhì)源的作用。
可以利用任何已知的或標(biāo)準(zhǔn)方法將上面所述的活疫苗施用到動物上，這些方法包括口服消化、胃插管、或支氣管一鼻一眼噴灑。所有這些方法均可以使該活疫苗很容易地到達GALT或BALT細(xì)胞，并且誘發(fā)抗體形成，它們是優(yōu)選的給藥方法。其它給藥方法也是可行的，例如靜脈內(nèi)注射，它可以使該載體微生物到達動物血液。利用后面將要描述的本發(fā)明的其它實施方案，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或乳房內(nèi)注射也是可行的。
由于優(yōu)選的給藥方法是口服消化、氣溶膠噴灑和胃插管，因此優(yōu)選的載體微生物是那些能粘連到能侵入并存在于被接種動物的腸或支氣管的任何一種淋巴上皮結(jié)構(gòu)中的載體微生物品種。這些菌株中優(yōu)選的是通過致腸病菌株進行遺傳操作而產(chǎn)生的致腸病菌株的無毒衍生物。最優(yōu)選的菌株是與Peyer結(jié)相連，侵入并存在于其中從而直接激發(fā)IgA生成的菌株。在動物中，這些菌株包括特定的沙門菌菌株和位于Peyer結(jié)中的沙門菌-大腸桿菌雜種。
現(xiàn)在，重組DNA技術(shù)已為人們充分了解并廣泛傳播，因此可以將它視為慣用技術(shù)。按照籠統(tǒng)的且廣義的說法，這種方法包括將一種生物體的遺傳物質(zhì)(或者通常是部分遺傳物質(zhì))輸送到第二種生物體中從而使輸送的遺傳物質(zhì)變成被輸送生物體的遺傳物質(zhì)中的一部分。這種方法通常包括首先由母體生物體的質(zhì)粒或母體染色體獲得一小片DNA。質(zhì)粒(也叫一種額外染色體成分)是一種遺傳單元，它同細(xì)胞的染色體是物理上分離的。這種DNA可以是任意尺寸的，且通常是通過限制性內(nèi)切酶的作用，在特定的堿基對位點處切斷DNA分子而獲得的。接著在與質(zhì)粒、噬菌體或粘粒載體連接從而形成重組分子以后，就可以將該重組分子通過各種手段如轉(zhuǎn)化(從外部環(huán)境中吸收裸體DNA，這種吸收可以通過各種化學(xué)試劑，如鈣離子的存在而人為地誘發(fā)產(chǎn)生)，包括電穿孔轉(zhuǎn)移到一種宿主細(xì)胞中。也可以采用其它方法如轉(zhuǎn)導(dǎo)法，此時該重組DNA是包裹在噬菌體，如轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體或粘粒載體中。一旦該重組DNA位于載體細(xì)胞中，它就可以以一種獨立片斷存在(通常是真正的完全傳遞的質(zhì)粒)，或者它可以嵌入宿主細(xì)胞染色體中，并在細(xì)胞分裂期間隨該染色體而繁殖。
雖然遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是相當(dāng)簡單的，但要想預(yù)測何種轉(zhuǎn)移會產(chǎn)生表達基因現(xiàn)在尚不可能，然而這種選擇過程對本發(fā)明來說將不存在任何困難。由于宿主微生物必須表達該被轉(zhuǎn)移的基因，并且由此產(chǎn)生一種抗原，故“鳥槍”方法可以很好地起作用。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)首先產(chǎn)生對所需抗原的抗體，例如從病原微生物獲得細(xì)胞膜片段，利用核酸內(nèi)切酶將來自作為抗原源的生物體的DNA切割成多個片段，并將該片段隨機插入到表達該病原體的抗原的載體微生物中，通過與對病原抗原的抗體反應(yīng)可以很容易地被識別?？梢詫⒈磉_抗原微生物進行選擇并克隆從而產(chǎn)生所需的重組生物體。鳥槍克隆是人們所熟悉的，其詳細(xì)描述參見Maniatis，T.等人，Molecular Cloning，Second Edihion，Cold Spring Hardor Laboratories(1989)，該文獻作為參考而引入本文?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)，不視為本發(fā)明的一部分，而任何可以產(chǎn)生重組生物體(該重組生物體含來自在無毒微生物中被表達的生物體的基因)的方法均可以滿足要求。
假使該菌種可以正常地交換遺傳信息，則可以使用更多傳統(tǒng)方法進行基因轉(zhuǎn)移，如結(jié)合、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
無毒微生物的衍生物也應(yīng)視為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。衍生物是指該無毒菌株經(jīng)有性或無性衍生的子代及突變體，它們包括單個或多個堿基取代、缺失、插入或轉(zhuǎn)化，它們?nèi)匀徊荒墚a(chǎn)生功能腺苷酸環(huán)化酶和/或cAMP受體蛋白和/或cdt基因表達，而不管其是否攜帶了自然產(chǎn)生的有毒質(zhì)粒。舉例來說，菌株如4062和4064攜帶賦于萘啶酮酸抗性的gyrA突變，在本申請中在口服接種以后，該性質(zhì)被用作一種很方便的標(biāo)記來跟蹤菌株通過動物體。因此可以通過轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將野生型gyrA-(對萘啶酮酸敏感)基因?qū)氚淳o密結(jié)合Tn10的遺傳來挑選的菌株，并爾后利用在攜帶有g(shù)yrA-等位基因(具鐮孢菌酸抗性選擇性)的母體菌株上繁殖噬菌體溶解物進行轉(zhuǎn)導(dǎo)而除去Tn10，由此很容易地除去gyrA突變。
所需劑量將隨該基因產(chǎn)物的抗原性而變化，且僅要求足以誘發(fā)現(xiàn)有疫苗那樣的典型免疫應(yīng)答即可，通常常規(guī)試驗就可以很容易地確定所需用量，可以采用多次劑量以產(chǎn)生所需的保護力。
懸浮或溶解疫苗的藥物載體或賦形劑可以是任何一種溶劑或固體，也可以包裹在一種對接種動物無毒且與該載體生物體或抗原基因產(chǎn)物相容的材料中。合適的藥物載體已為本領(lǐng)域熟知，例如它們包括液體載體，如標(biāo)準(zhǔn)鹽水和其他濃度為生理濃度或接近生理濃度的無毒鹽，以及固體載體，如滑石粉或蔗糖，并且還可以將它們導(dǎo)入農(nóng)場動物的飼料中。如果需要，也可以加入助劑以提高抗原性。當(dāng)通過支氣管給藥時，優(yōu)選該疫苗以氣溶膠形式存在。有關(guān)合適的藥物載體及助劑以及劑形的制備的描述。例如可以參見Remington′s Pharmace-ceutical Science，第17版，(Gennaro，Ed.Mack Publishing Co.，Easton，Peunsylvania，1985)。
可以將由病原體產(chǎn)生的基因產(chǎn)物進行的免疫與先前的用作為載體(以表達由來自病原的重組基因特定的基因產(chǎn)物)的病原微生物的無毒衍生物進行的免疫相結(jié)合。一旦通過載體微生物(表達病原體衍生基因產(chǎn)物，以刺激GALT或BALT的淋巴樣細(xì)胞)的免疫作用。病原體衍生基因衍生物對分泌免疫體系起動以后這種腸胃外的免疫可以起一種第二次激發(fā)以促進該分泌性免疫應(yīng)答的表達。已經(jīng)知道這種增強的反應(yīng)是一種輔助性，二次激發(fā)或回憶性應(yīng)答，并且它可以對宿主產(chǎn)生長期的免疫保護?？梢詫⒍渭ぐl(fā)免疫重復(fù)若干次，其效果較好。
上述內(nèi)容對本發(fā)明作了一般性描述，通過參考下列特定實施例可以獲得對本發(fā)明更全面的了解，提供這些實施例的目的僅在于說明本發(fā)明而不是對其進行限制(除非另有說明)。
實施例1該實施例描述了無毒微生物的分離過程(通過導(dǎo)入影響cAMP合成及使用的缺失突變)以及對賦于其表型穩(wěn)定性，完全無毒及高致免疫性的突變的菌株的鑒別。
細(xì)菌菌株表1.A和B中列出了所用的大腸桿菌及鼠傷寒沙門菌，它們以冰凍培養(yǎng)液形式懸浮于含有5%甘油的1%Bacto-蛋白胨中保持，并在干冰-乙醇中快速冷凍以在-70℃下貯存復(fù)制，并且也將其懸浮于含有50%甘油的1%Bacto-蛋白胨中以在-20℃下貯存供常規(guī)使用。
培養(yǎng)基用于常規(guī)培養(yǎng)的復(fù)合培養(yǎng)基是L液體培養(yǎng)基(Lonnox，Virology 1190-206，1965)和Luria液體培養(yǎng)基(Luria和Burrous，J.Bacteriol.74461-476，1957)將Difco瓊脂加入到Luria液體培養(yǎng)基中，其基本瓊脂為1.2%而軟瓊脂為0.65%，用Penassay瓊脂對細(xì)菌進行常規(guī)計數(shù)，通過補充Mac Conkey基本瓊脂或Eosin亞甲基蘭瓊脂(Curtiss，Geretics 589-54，1968)且使某種合適的碳水化合物的最終濃度達到1%，由此對發(fā)酵過程進行評價。
合成培養(yǎng)基是最低限度的液體(ml)和最低限度的瓊脂(MA)，用以前所述的最佳水平的營養(yǎng)成分對這些介質(zhì)進行補充(Curtiss，J.Bacteriol.8928-40，1965)。將用明膠(BSG)緩沖的鹽水(Curtiss，1965同上)常規(guī)用作為稀釋劑。
轉(zhuǎn)導(dǎo)常規(guī)地用噬菌體P22HTint進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)過程用標(biāo)準(zhǔn)方法進行(Davis等人，“Aman.for Genet.Eng-Adv Bacterial Geretics”Cold Spring Harbor.Laboratory.Cold Spring Harbor.NY.1979)。將供體菌株培養(yǎng)過夜，然后將其按1∶20比例稀釋入預(yù)熱的Luria液體培養(yǎng)基中，在37℃下?lián)u動生長60分鐘，然后用0.01 P22HTint進行多次感染，將該感染混合物搖動過夜，約15小時，加入氯仿并在37℃下再搖動10分鐘，并將懸浮液離心(Sorvall Rc5C，ss-34轉(zhuǎn)子，7000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)以除去細(xì)菌碎片。將含有噬菌體(Ca.1010/ml)的上清液在氯仿上在4℃下貯存，為選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)Tn10插入和Tn10誘發(fā)突變，使用濃度為12.5μg/ml的四環(huán)素。
鐮孢菌酸的Tn10缺失選擇采用Maloy和Nunn(J.Bacteriol.1451110-1112，1981)所述的培養(yǎng)基及方法。將攜帶Tn10誘導(dǎo)突變的菌株在含有12.5mg四環(huán)素/ml的L液體培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)過夜，使其濃度大約為5×108CFU/ml。然后將該培養(yǎng)液稀釋(1∶40)進預(yù)熱的無四環(huán)素的L液體培養(yǎng)基中并將它在37℃下暴露于空氣中使其滴度達到2×109CFU/ml。將用BSG稀釋的適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞(即107-108)鋪在含有鐮孢菌酸的介質(zhì)上并在37℃下培養(yǎng)48小時，在相同的選擇性介質(zhì)上提純抗鐮孢菌酸的分離物。從中挑選出單個分離物，將其生長并將其在含有或不含有12.5μg四環(huán)素/ml的Penassay瓊脂上測試四環(huán)素過敏性。
小鼠采用雌性BALB/c小鼠(6到8周大)(Sasco，Omaha.NS)進行感染和/或免疫實驗，在實驗前將該動物在隔離室中放一周。將實驗小鼠放在有Nalgene濾片覆蓋的籠子里，籠子配有金屬絲地板。任意供給食物和水以12小時照明動物室保持在22-23℃。
動物感染性在口服(P.O.)或腹膜內(nèi)(i.p.)接種后測定鼠傷寒沙門菌菌株的毒性。將用于接種小鼠的細(xì)菌在37℃下在L液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將這些培養(yǎng)液稀釋(1∶50)進預(yù)熱的L液體培養(yǎng)基中，在37℃下將它向空氣中暴露約4小時使其OD600達到約0.8-1.0。通過在Sorvall Rc5C離心機中在GSA轉(zhuǎn)子，4℃下以7000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘將細(xì)胞濃縮50倍，隨后懸浮于BSG中。將合適的稀釋液鋪于Penassay瓊脂上以進行滴度測定，并在含有1%麥芽糖的MacConkey瓊脂上驗證其cya/crp表型。對于所有口服接種鼠傷寒沙門菌的小鼠，在感染前4小時內(nèi)不喂食物及水。在用Pipetman P20口服喂入20μl懸浮于BSG中的鼠傷寒沙門菌之前10-15分鐘，用Pipetman P200向它們喂30毫升10%(W/V)的碳酸氫鈉。在口服接種后30分鐘再給食物及水，在30天內(nèi)觀察小鼠的發(fā)病率及死亡率。用26-gauge 3/8″針頭對未禁食的BALB/c小鼠進行腹膜內(nèi)接種以輸送100μl用BSG稀釋的鼠傷寒沙門菌懸浮液。在30天內(nèi)觀察其發(fā)病率及死亡率。
保護性免疫的評價在最初的實驗中，對于在感染鼠傷寒沙門菌突變菌株后存活30天的任何小鼠，在第31天通過口服103-104倍于LD50劑量的野生型小鼠毒性鼠傷寒沙門菌母體菌株進行攻擊。隨后，以各種劑量的毒性突變體對各組小鼠口服免疫，然后在最初免疫后的不同時間用各種劑量的毒性野生型母體細(xì)胞對其進行攻擊。在整個實驗過程中以及在用野生型母體進行攻擊后至少30天內(nèi)觀察其發(fā)病率及死亡率。
分離含有Δcya-12和Δcrp-11突變的鼠傷寒沙門菌菌株利用類似Curtiss和Kelly(1987)所述的經(jīng)典遺傳學(xué)方法，正如下文所述對野生型，連續(xù)傳帶型小鼠的毒性鼠傷寒沙門菌SL1344菌株X3339進行遺傳修飾。該方法由下列步驟組成將來自pp1037的原crp-773∷Tn10突變和來自pp1002的原cya∷Tn10突變轉(zhuǎn)導(dǎo)到高毒性和侵入性鼠傷寒沙門菌SL1344菌株X3339中，并從大量獨立的抗鐮孢菌酸的、四環(huán)素過敏缺失的突變體中篩選出在小鼠中完全無毒且致免疫性最高以及表型穩(wěn)定性最大的突變體。
通過首先在含有crp-773∷Tn10突變的鼠傷寒沙門菌菌株pp1037上制成一種高滴度噬菌體P22H Tint溶解物以及在含有cya∷Tn10突變的鼠傷寒沙門菌菌株pp1002上制成另一種溶解物，可以實現(xiàn)將crp基因和cya基因中的Tn10嵌入物轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后用所產(chǎn)生的P22H Tint溶解物感染受體鼠傷寒沙門菌X3339(0.3感染復(fù)制率)，從而將它轉(zhuǎn)導(dǎo)成四環(huán)素抗性(篩選出麥芽糖陰性表型)。在將100μl試樣鋪開在含有1%麥芽糖(終濃度)(用12.5μg四環(huán)素/ml補充)的MacConkey瓊脂(Difco Laboratories，Detroit，MI)上之前，將該噬菌體-細(xì)菌感染混合物在37℃下培養(yǎng)20分鐘。鋪上后在37℃下培養(yǎng)約26小時之后，將其中的抗四環(huán)素的由P22H Tint(pp1037)→X3339感染產(chǎn)生的麥芽糖陰性菌落和抗四環(huán)素的由P22H Tint(pp1002)→X3339感染產(chǎn)生的麥芽糖陰性菌落挑選到0.5ml BSG中，并在相同的選擇培養(yǎng)基上劃線。將產(chǎn)生的X3339衍生物命名為X3604(cya∷Tn10)和X3605(crp-773∷Tn10)(表1.A.)。

在L液體培養(yǎng)基+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)菌株X3604和X3605，取各菌株樣品100μl，用含明膠的緩沖鹽水(BSG)以1∶10比例進行稀釋，再鋪在10塊含鐮孢菌酸(FA)培養(yǎng)基的平板上(Maloy and Nunn，1981)。該平板在37℃保溫約36小時，從各板中收集5個鐮孢菌酸抗性菌落放入0.5ml BSG中，在FA培養(yǎng)基中進行純化。將已純化的鐮孢菌酸抗性菌落收集到L液體培養(yǎng)基中，在37℃進行培養(yǎng)至混濁，檢驗Tn10(四環(huán)素敏感性)缺失。從FA培養(yǎng)基中的10只板中的每一板中選出一種四環(huán)素敏感衍生物，鑒定如下性能完全LPS(通過P22HTint敏感性)、營養(yǎng)缺陷型或原養(yǎng)型、基因缺失穩(wěn)定性和回復(fù)四環(huán)素抗性。本方法結(jié)果得到10個獨立的由X3604中分離的Δcya突變體和10個獨立的由X3605中分離的Δcrp突變體。
無毒突變體的遺傳穩(wěn)定性作活疫苗口服用的菌株，其有關(guān)的無毒性和免疫屬性必須十分穩(wěn)定。當(dāng)10個獨立Δcya突變體的每個和10個獨立Δcrp突變體的每個的濃縮50倍的培養(yǎng)物和各種稀釋液(～109、107、105、103CFU/每板)鋪在含0.5%麥芽糖、蜜二糖、木糖、甘油，或鼠李糖的基本(minimal)瓊脂培養(yǎng)基(添加22μg半胱氨酸/ml和22μg精氨酸/ml)上(不助其生長)，檢測不到回復(fù)突變等位基因和突變體。將一組復(fù)制皿用紫外線輔照(5焦耳/米2/秒)，并在暗處在37℃下保溫。另一組皿在光照下在37℃保溫。生長48小時后來檢測到回復(fù)突變等位基因和突變體。還進行試驗以確定從鐮孢菌酸抗性Δcya和Δcrp突變體中是否可以以較之四環(huán)素敏感性野生型母體菌株所能觀察到的較高頻率回復(fù)四環(huán)素抗性回收突變等位基因/突變體。但在所有情況下，均未測到這種四環(huán)素抗性回復(fù)突變等位基因突變體。
Δcrp和Δcya突變體的毒性和免疫原性將得到的10個Δcrp和10個Δcya突變體經(jīng)口服接種在BALB/c小鼠中進行篩選，以測定最低毒性和疾病癥狀(根據(jù)皮毛(零亂或者光滑)、食欲情況和活動狀況(強或弱))。每組5個小鼠(口服)接種～109CFU各獨立cya或crp缺失突變體。動物均按上述標(biāo)準(zhǔn)計分，試驗30天時，用108CFU野生型毒性親代菌株X3339攻擊存活者，20組中的三組用cya或crp缺失突變體感染，最初被Δcya-12、Δcrp-11和Δcrp-10突變體感染的5個小鼠存活，且對104LD50野生型攻擊也能完全保護。尤其是Δcrp-10突變體這一組在無毒性，免疫原性和穩(wěn)定性方面是不相同的。重復(fù)這些試驗后，任何給定劑量口服接種(P.O)或腹膜內(nèi)接種(i.p)Δcrp-10突變體對小鼠均無影響(見實施例3表6)。
所選突變體菌株的性質(zhì)分別鑒定具有Δcya-12、Δcrp-10和Δcrp-11突變的X3615、X3622和X3623菌株是最低毒性、高免疫性和最穩(wěn)定的表型性和遺傳性。這些菌株的表型性質(zhì)數(shù)據(jù)列于表2中。分別與具有cya∷Tn10和crp-773∷Tn10突變的X3604和X3605菌株和毒性野生型親代X3339菌株相比這些菌株的無毒性和免疫原性的數(shù)據(jù)如表3所示。除了需要組氨酸(由于在親代X3339中的hisG突變)外，Δcrp-10突變影響X3622對氨基酸、精氨酸和半胱氨酸的需要?；谠撚^測結(jié)果，實施例3給出了Δcrp-10突變性質(zhì)的進一步分析結(jié)果。
實施例2本實施例敘述通過引入影響cAMP合成和利用的缺失突變的無毒生物體的構(gòu)建及具有二個缺失突變菌株的表型穩(wěn)定性、完全無毒性和高免疫原性的鑒定。
細(xì)菌菌株所用的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌菌株列于表1A和B中。這些菌株的保存和貯藏如實施例1所述。
培養(yǎng)基細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)、計數(shù)和鑒定所用的復(fù)合培養(yǎng)基如實施例1所述。
轉(zhuǎn)導(dǎo)和鐮孢菌酸Tn10缺失選擇所用培養(yǎng)基和方法如實施例1所述。
動物傳染性和保護免疫性的測定鼠傷寒沙門氏菌菌株的毒性和免疫原性的測定如實施例1所述。
具有Δcya-12和Δcrp-11缺失突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株的構(gòu)建最好的疫苗菌株就其效能來說類似于顯示明顯移生能力和侵襲力的高毒性菌株的減毒獲得的結(jié)果。選擇這些高致病鼠傷寒沙門氏菌野生型菌株如SL1344(X3339)，UK-1(X3761)和798的標(biāo)準(zhǔn)，包括在鼠毒性鑒定中的低LD50值(見表4)，抗生素敏感性、毒性質(zhì)粒的擁有，容易遺傳操作(噬菌體P22HTint或P1的敏感性，轉(zhuǎn)化能力和容易接收移動質(zhì)粒)和大腸桿菌素敏感性。
用類似Curtiss和Kelly(1987)所述的經(jīng)典遺傳方法進行野生型、毒性鼠傷寒沙門氏菌菌株SL1344(X3339)、798和UK-1(X3761)的遺傳修飾如下所述。該方法包括移動crp和cya基因的缺失，該基因已被分離并已鑒定特征(在鼠傷寒沙門氏菌SL1344(如實施例1所述)中)，將轉(zhuǎn)座子Tn10(編碼四環(huán)素抗性)放在Δcya-12或Δcrp-11突變附近，通過P22HTint中介轉(zhuǎn)導(dǎo)將連接特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入高毒性鼠傷寒沙門氏菌菌株UK-1X3761、798和SL1344X3339并選擇四環(huán)素抗性和篩選麥芽糖-負(fù)表型。將連接Δcrp-11的zhc-1431∷Tn10和連接Δcya-12的zid-62∷Tn10用于該目的。沒有一種插入獨自影響鼠傷寒沙門氏菌的毒性。
在含Δcrp-11和zhc-1431∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株X3773首先制得一高滴度噬菌體P22H Tint溶菌產(chǎn)物，并在含Δcya-12和zid-62∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株X3711中制成另一種溶菌產(chǎn)物以促進具有連接轉(zhuǎn)座子的基因缺失的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后用得到的P22HTint溶菌產(chǎn)物將遺傳特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入野生型受體菌株X3339、798和X3761中。
在鼠傷寒沙門氏菌X3773(Δcrp-11 zhc-1431∷Tn10)中繁殖的P22HTint被使用于轉(zhuǎn)導(dǎo)毒性菌株為篩選出具Mal-的四環(huán)素抗性。將噬菌感染混合物在37℃保溫20分鐘，然后將100μl樣品涂布在MacConkey瓊脂(Difco Laboratories，Detroit，MI)上，該瓊脂含有1%麥芽糖(最終濃度)，添加12.5μg四環(huán)素/ml。在37℃保溫約26小時后，收集四環(huán)素抗性Mal-轉(zhuǎn)導(dǎo)體，在同樣的培養(yǎng)基中進行純化。得到的798衍生物用X3825表示，UK-1衍生物用X3828表示。菌株X3773X3825和X3828具有基因型Δcrp-11 zhc-1431∷Tn10(表1.B.)。在L液體培養(yǎng)基+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)這些菌株，用含明膠的緩沖鹽水(BSG)以1∶10比例對各培養(yǎng)物進行稀釋，將各菌株培養(yǎng)物100μl涂布在含鐮孢菌酸(FA)的培養(yǎng)基(Maloy和Nunn，1981)的平板上，將該板在37℃下保溫約36小時。將各菌株的鐮孢菌酸抗性菌落收集在0.5ml BSG中，在FA培養(yǎng)基中進行純化。將已純化的鐮孢菌酸抗性菌落收集在L液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，檢測Tn10(四環(huán)素敏感性)的損失，完全LPS的存在和營養(yǎng)缺陷。這些新的菌株用X3876(798)和X3954(UK-1)〔二者均具有基因型Δcrp-11 Δ(zhc-1431∷Tn10)〕和X3623(SL1344Δcrp-11是最初分離的，如實施例1所述)表示(見表1.B.)由于cya-和crp-突變體的表型是相同的(Mal-、Stl-、Mtl-等)，攜帶經(jīng)克隆的crp+基因并具有氨芐青霉素抗性的質(zhì)粒pSD110(Schroeder和Dobrogosz.J.Bacteriol 167616-622(1986))被暫時用于補充染色體中的Δcrp突變，當(dāng)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)引入時，能鑒定Δcya突變。用在鼠傷寒沙門氏菌X3670中繁殖的P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)X3623、X3876和X3954的L液體培養(yǎng)基生長的培養(yǎng)物，它含有質(zhì)粒pSD110(表1.B.)。在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml中進行選擇。26小時后，收集各菌株的氨芐青霉素抗性，Mal+菌落，在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖瓊脂+100μg氨芐青霉素/ml中進行純化，用X3938(798)和X3961(UK-1)(二者均具有基因型Δcrp-11Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+)及X3774(SL1344)(它具有基因型Δcrp-11 pSD110+)表示。
在L液體培養(yǎng)基+100μg氨芐青霉素/ml中培養(yǎng)菌株X3774、X3938和X3961，用在X3711中繁殖的P22HTint各自獨立地轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株以引入連接的Δcya-12和zid-62∷Tn10突變。將該轉(zhuǎn)導(dǎo)混合物涂布在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml的平板上。收集氨芐青霉素抗性(pSD110+)、四環(huán)素抗性(zid-62∷Tn10)，Mal-(Δcya)菌落，在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml中進行純化。將已純化的菌落收集在L液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)以至混濁，檢驗該菌株的完全LPS和營養(yǎng)缺陷。得到的菌株用X3978(798)和X3962(UK-1)(二者均具有基因型Δcrp-11Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10)及X3936(SL1344)(它具有基因型Δcrp-11 pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10)表示。在L液體培養(yǎng)基+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)X3936、X3978和X3962的培養(yǎng)物至混濁，以1∶10比例用BSG稀釋，將100μl各培養(yǎng)物樣品涂布在含鐮孢菌酸的培養(yǎng)基中，在37℃下保溫約36小時。收集各菌株的鐮孢菌酸抗性菌落，在FA培養(yǎng)基中進行純化。將經(jīng)純化的FA抗性菌落收集到L液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)以至混濁，然后檢驗Tn10(四環(huán)素敏感性)損失，完全LPS和營養(yǎng)缺陷。在該工序中pSD110質(zhì)粒通常從該菌株中自然消失以導(dǎo)致氨芐青霉素敏感性，只是SL1344的衍生例外，它包括二步以除去pSD110。最后的這些菌株稱為X4039(798)和X3985(UK-1)(二者均具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕和X3939(SL1344)(它具有基因型Δcrp-11 Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕(表1.B.)。
無毒突變體的遺傳型和表型穩(wěn)定性測定遺傳特性穩(wěn)定性的方法如實施例1所述。由于Δcya Δcrp突變，所有遺傳型和表型特性是十分穩(wěn)定的(除能動性外)。雖然功能性鞭毛的合成和能動性的出現(xiàn)取決于野生型cya和crp基因功能，但容易挑選在cfs(基本的鞭毛合成物)基因中的抑制基因突變以導(dǎo)致鞭毛合成和能動性與Cya和crp基因功能無關(guān)。在鼠傷寒沙門氏菌Δcya Δcrp菌株中，在菌株構(gòu)建過程中，可方便地選擇能動變異體。因為對鞭毛抗原的免疫，可以是保護性的，從而可選擇所有疫苗菌株的能動變異體。
用借助Luria軟瓊脂涂覆技術(shù)的p22H Tint噬菌體敏感性并通過用抗血清CDifco Laboratories，Detroit，MI)的載片凝集法可證實鼠傷寒沙門氏菌族BO-抗原的合成。
糖的發(fā)酵和在各種雙突變體菌株的碳原中生長與表2所示只含Δcya或Δcrp的菌株相同。根據(jù)公開報道的有關(guān)對分解代謝活性的環(huán)狀A(yù)MP和環(huán)狀A(yù)MP受體蛋白質(zhì)的需求其表型正如所預(yù)料的。
在構(gòu)建下列鐮孢菌酸抗性四環(huán)素敏感，衍生物的選擇的各步中、經(jīng)研究，確定能否以較之親代四環(huán)素敏感性野生型菌株被處理所能觀察到的更高頻率回收四環(huán)素抗性回復(fù)突變等位基因/突變體。在所有情況下，未觀察到這種四環(huán)素抗性回復(fù)突變等位基因/突變體。
突變體菌株對小鼠的毒性口服108突變體細(xì)胞使每個小鼠感染，記錄發(fā)病率和死亡率，從而可得到鼠傷寒沙門氏菌突變體菌株毒性的初步信息。口服鼠傷寒沙門氏菌野生型親代菌株，和Δcya-12 Δcrp-11衍生物X3985和X4039而感染的小鼠的發(fā)病率和死亡率數(shù)據(jù)如表4所示。
用無毒突變體免疫接種的效力表5所示數(shù)據(jù)說明用104倍LD50劑量的全毒性野生型鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞口服攻擊后，由鼠傷寒沙門氏菌Δcya Δcrp突變體X3985和X4039誘導(dǎo)的免疫能力。在這些高劑量攻擊情況下，許多小鼠出現(xiàn)中度病狀如食欲減退，而用X4039免疫的小鼠仍很健康，能正常進食和生長。
實施例3本實施例說明具有包含crp基因和相鄰基因(它們也能控制沙門氏菌的毒性)的缺失突變的無毒生物的分離。
細(xì)菌菌株所用的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌菌株列于表1A和B中。這些菌株的保存和貯藏如實例1所述。
培養(yǎng)基細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)、計數(shù)和鑒定所用的復(fù)合培養(yǎng)基如實例1所述。
轉(zhuǎn)導(dǎo)和鐮孢菌酸缺失Tn10選擇所用培養(yǎng)基和方法如實例1所述。
動物傳染性和保護免疫性的測定鼠傷寒沙門氏菌菌株的毒性和免疫原性的測定如實例1所述。
具有Δcrp-10突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株的分離如實例1所述，使在X3605中分離的10個Δcrp突變之一個具有精氨酸(由于argD缺失)和半胱氨酸(由于cysG缺失)營養(yǎng)缺陷。在鼠傷寒沙門氏菌SL1344菌株X3622中的突變原來稱為Δcrp-10，而現(xiàn)在由于半胱氨酸營養(yǎng)缺陷而稱為Δ〔crp-cysG〕-10?？诜?09X3622細(xì)胞而感染的5組BALB/c小鼠中有一組仍然是健康的。且完全不受影響(表3)。而且這些小鼠對口服108親代X3339細(xì)胞攻擊獲得高水平免疫性(表3)。
構(gòu)建一組菌株以分別測定X3622的各種表型。用載帶克隆的crp＊基因并具有氨芐青霉素抗性的質(zhì)粒pSD110〔Schroeder and Dobrogosz，J.Bacteriol.167616-622(1986)〕補充染色體中Δcrp突變。用含有質(zhì)粒pSD110的在鼠傷寒沙門氏菌X3670中繁殖的P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)X3622的L液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物。在MacConKey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml中進行選擇。26小時后，收集氨芐青霉素抗性、Mal+菌落并在MacConKey瓊脂+1%麥芽糖瓊脂+100μg氨芐青霉素/ml中進行純化，稱其為X3706。使小鼠口服X3706，再從脾臟中分離。動物繼續(xù)傳代型的菌株稱為X3737。另外2個crp突變體，X3605(crp-773∷Tn10)和X3623(Δcrp-11)(不具有Arg-或cys-營養(yǎng)缺失性能)也通過用PSD110質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)被補充，分別稱為X3731和X3774。構(gòu)建分別載帶cysG和arg突變的鼠傷寒沙門氏菌，并稱之為X3910(cysG∷Tn10)、X4063和X4071(arg∷Tn10)。
選擇其它兩個高致病鼠傷寒沙門氏菌菌株，通過引入Δcrp-10突變而使其減毒。X3761(UK-1)和798是分別從半死狀態(tài)的馬和豬中分離的有毒、侵害性菌株，在小鼠中的LD50約為1×105CFU。先在鼠傷寒沙門氏菌菌株X3712中制成高滴度噬菌體P22HTint溶菌產(chǎn)物可方便進行以連接轉(zhuǎn)座子zhc-1431∷Tn10的Δcrp-10轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見表1.B)。然后用該噬菌體溶菌產(chǎn)物將遺傳性能轉(zhuǎn)導(dǎo)入野生型受體菌株X3761和798。選擇四環(huán)素抗性菌落，篩選出Mal-、Arg-和Cys-表型，得到的798衍生物稱為X4246，而X3761(UK-1)衍生物稱為X4248(表1)。
將載帶crp+野生型等位基因的質(zhì)粒pSD110引入X4246和X4248中以補充crp突變。用含有質(zhì)粒pSD110，在鼠傷寒沙門氏菌X3670中繁殖的P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)X4246和X4248的L液體培養(yǎng)基生長培養(yǎng)物(表1)。在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml中進行選擇。26小時后，收集各菌株的氨芐青霉抗性，Mal+菌落，在相同的培養(yǎng)基中進行純化，稱為X4247(798)和X4262(UK-1)，二者均具有基因型pSD110+/Δcrp-10 zhc-1431∷Tn10。
鼠傷寒沙門氏菌X3622、X3731、X3737、X3774、X3910、X4063和X4071的毒性。表6所示數(shù)據(jù)說明口服鼠傷寒沙門氏菌菌株X3622、X3731、X3737、X3774、X3910、X4063和X4071而感染的小鼠的發(fā)病率和死亡率。菌株X3737對已接受104倍LD50劑量的野生型X3339親代菌株的小鼠是完全無毒的。觀測30天過程中小鼠從未出現(xiàn)病態(tài)。作為本實例的比較試驗，以pSD110補足在X3605中的crp-773∷Tn10突變成野生型crp+表型(X3731)，小鼠被感染并死亡。用X3731和X3774(pSD110+/crp-11)口服接種約1×105CFU劑量可殺死五只中的四只小鼠。為分別測定具有Cys-和Arg-表型菌株的毒性，使BALB/c小鼠口服菌株X3910(cysG∷Tn10)、X4063(arg∷Tn10)和X4071(arg∷Tn10)。當(dāng)口服X3910、X4063和X4071相同或較少劑量時就能殺死小鼠。因此，有關(guān)Δ〔crp-cysG〕-10突變的無毒性不完全是由于缺失crp基因，而且缺失argD或cysG loci也不會使其具有無毒性。相反，對鼠傷寒沙門氏菌毒性來說另一個必不可少的基因必須位于crp基因附近的染色體區(qū)內(nèi)。
用X3622、X3737、X4247和X4262免疫接種的效力用104倍LD50劑量的全毒性的野生型鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞p.o或i.p攻擊后由X3622、X3737、X4247和X4262誘導(dǎo)的免疫性能數(shù)據(jù)列于表7中。在試驗30天期間，接受過量劑量野生型親代菌株的所有小鼠始終未出現(xiàn)病癥。因此，Δ〔crp-cysG〕-10突變至少缺失二個基因，這二個基因使鼠傷寒沙門氏菌完全無毒且高度致免疫。
具有Δcrp-14突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株的分離由于crp-773∷Tn10的不精確刪除過程會導(dǎo)致從argD至cysG的基因缺失，可制定另一種對策以在鄰近crp的區(qū)中確定具有無毒性的基因位置。在含鐮孢菌酸的培養(yǎng)基中選擇20個X3910(cysG∷Tn10)的獨立缺失突變體，并篩選四環(huán)素敏感性和麥芽糖-負(fù)表型。X3910的20個鐮孢菌酸抗性衍生物中一個有Δ〔crp-cysG〕-14基因型，具有組氨酸和半胱氨酸營養(yǎng)缺陷，但無精氨酸營養(yǎng)缺陷。用在X3670中生長的p22HTint溶菌產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)稱為X3931的這種菌株以引入載帶野生型crp+基因的psD110。收集氨芐青霉素抗性、麥芽糖-正轉(zhuǎn)導(dǎo)體，在相同的培養(yǎng)基中進行純化，得到的菌株稱為X3955。
鼠傷寒沙門氏菌psD110+/Δ〔crp-cysG〕-14×X3955的毒性表7說明口服鼠傷寒沙門氏菌X3955而感染的小鼠的發(fā)病率和死亡率。對于接受約109CFU的小鼠，菌株X3955是完全無毒的。在整個30天期間小鼠從未出現(xiàn)病態(tài)。
用X3955免疫接種的效力表7說明用104倍LD50劑量的全毒的野生型鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞口服攻擊后由X3955誘導(dǎo)的免疫能力。在試驗30天期間得到過量劑量親代菌株的小鼠從未出現(xiàn)病態(tài)。
X3622(Δ〔crp-cysG〕-10)和X3737(pSD110+Δ〔crp-cysG〕-10)的腸胃、GALT和脾臟的移生培養(yǎng)和制備相對于野生型菌株X3339，鼠傷寒沙門氏菌X3622和X3737，用以口服接種生長8周的雌性DALB/C小鼠(如實例1所述)。用9.4×108CFU(X3622)、1.2×109CFU(X3737)或1.1×109CFU(X3339)口服接種后1 3，5和7天殺死動物。每組任意選擇3只小鼠，euthanized和收集組織樣品。從每個鼠中取出脾臟、Peyer結(jié)、10-cm后段的回腸和少量腸內(nèi)含物放入含BSG的聚丙烯管中，用Brinkmann組織均漿器使其混合均勻，并放在冰中。將未稀釋或已稀釋的樣品(100μl)直接涂有在MacConkey瓊脂+1%乳糖+50μg鏈霉素/ml(X3339和X3337)以及MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+50μg鏈霉素/ml(X3622)上，將該平板在37℃下保溫26小時。每隔一段時間測定透視組知中的滴度，每次取樣以每組中取3個小鼠來計算幾何平均值。
該分析結(jié)果如圖1所示。顯然在X3622中的額外減毒突變(在crp+(pSD110+)衍生物X3737中更明顯)將大大減弱有效地移生至深層組織的能力。因此由Δ〔crp-cysG〕-10突變?nèi)笔У钠鹬匾饔玫幕蚍Q為cdt。由不存在任何脾大的情況這一事實，X3622和X3737的cdt-表型也得到證實，而用具有Δcrp-11突變的鼠傷寒沙門菌X3623或用具有Δcrp和Δcya結(jié)合突變的其他各種菌株(curtiss和Kelly，1987)對鼠口服接種后這種脾腫大可以觀察到。菌株X3737比X3622生長更快。在X3622中的額外減毒突變不像crp突變那樣降低其生長速率。
根據(jù)賦予表型的缺失突變的分離和分析結(jié)果，在鼠傷寒沙門菌染色體中基因的順序可推斷為argD、crp、cdt、cysG。
顯然，當(dāng)包括有Δ〔crp-cvsG〕-10或Δ〔crp-cysG〕-14突變(它也是Δcdt突變時將增加活的減毒的沙門氏菌疫苗菌株的安全性，而不會降低其免疫原性。這對下列品種特別重要。即宿主適應(yīng)的侵害性沙門氏菌菌種如，傷寒沙門氏菌(s.typhi)，甲型副傷寒沙門氏苗(s.paratyphi A〕(薛氏沙門氏菌S.Schottmuelleri)，乙型副傷寒沙門氏菌(希氏沙門氏菌)〔S.paratyphi B(s.hirshfeldii〕，丙型副傷寒沙門氏菌C(所有使人感染)(S.paratyphi C)，豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)(使豬感染)，都柏林沙門氏菌(S.dublin)(使牛感染)，雞沙門氏菌(S.gallinarum)和雛沙門氏菌(S.pullorum)(二者均使雞鴨感染)，以及非宿主特異的侵害性沙門氏菌(Salmonella)菌種，如鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)和腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)。
實施例4本實施例敘述通過引入缺失突變(該突變影響cAMP合成和利用)和一個相鄰基因(該基因也通過影響深部組織移生性而控制沙門氏菌毒性)來構(gòu)建無毒生物體，以及鑒定帶兩個缺失突變的菌株的表型穩(wěn)定性，完全無毒性及高致免疫原性。
細(xì)菌菌株所用的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌菌株列于表1A和B中，這些菌株的保存貯藏如實例1所述。
培養(yǎng)基用于細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)、計數(shù)、和鑒定的復(fù)合培養(yǎng)基如實例1所述。
轉(zhuǎn)導(dǎo)和鐮孢菌酸Tn10缺失的選擇所述培養(yǎng)基和方法如實例1所述。
具有Δcya-12和Δ〔crp-cysG〕-10缺失突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株的構(gòu)建最好的疫苗菌株就其效能來說類似于顯示明顯移生能力和侵襲力的高毒性菌株的減毒結(jié)果。選擇這些高致病鼠傷寒沙門氏菌野生型菌株如，SL1344(X3339)，UK-1(X3761)和798的標(biāo)準(zhǔn)已在實例2中敘述。
用類似Curtiss和Kelly(1987)所述的經(jīng)典遺傳方法，按如下所述進行野生型、毒性鼠傷寒沙門氏菌菌株SL1344、798和UK-1的遺傳修飾。該方法由下述步驟組成移動已分離出并鑒明特性(在鼠傷寒沙門氏菌SL1344(如例1所述)中)放入轉(zhuǎn)座子Tn10(編碼四環(huán)素抗性)于靠近Δcya-12或Δ〔crp-cysG〕-10突變處)的crp和cya基因的缺失和通過P22H Tint介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將連接特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入高毒性鼠傷寒沙門氏菌株UK-1X3761、798和SL1344X3339中同時挑選出四環(huán)素抗性及篩選麥芽糖陰性表型。將連接Δ〔crp-cysG〕-10的zhc-1431∷Tn10和連接Δcya-12的zid-62∷Tn10用于該目的。沒有插入單獨影響鼠傷寒沙門氏菌的毒性。
先在含Δ〔crp-cysG〕-10和zhc-1431∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株X3712中制成高滴度噬菌體P22H Tint溶菌產(chǎn)物，并在含Δcya-12和zid-62∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株X3711中生成另一種溶菌產(chǎn)物便很方便進行具有連接轉(zhuǎn)座子的基因缺失的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后用所得到的P22H Tint溶菌產(chǎn)物將遺傳特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入野生型受體菌株X3339、798和X3761。
用在鼠傷寒沙門氏菌X3712(Δ〔crp-cysG〕-10 zhc-1431∷Tn10)中繁殖的P22H Tint使毒性菌株轉(zhuǎn)導(dǎo)成四環(huán)素抗性并篩選出Mal-。將噬菌感染混合物在37℃下保溫20分鐘，然后將100μl樣品涂布在MacConkey瓊脂(Difco，Laboratories，Detroit，MI)上，該瓊脂含有1%麥芽糖(最終濃度)，添加12.5μg四環(huán)素/ml。在37℃保溫約26小時后，收集四環(huán)素抗性Mal-轉(zhuǎn)導(dǎo)物，在相同的培養(yǎng)基中進行純化。得到的798衍生物稱為X3777，UK-1衍生物稱為X3779。菌株X3712、X3777和X3779均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 zhc-1431∷Tn10(表1.B.)。在L液體培養(yǎng)基+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)X3777和X3779，用含明膠的緩沖鹽水(BSG)以1∶10比例對各菌株進行稀釋，將100μl各菌株涂布在含鐮孢菌酸(FA)的培養(yǎng)基(Maloy和Nunn，1981)平板上，將該平板在37℃下保溫約36小時。收集各菌株的鐮孢菌酸抗性菌落放入0.5ml BSG中，在FA培養(yǎng)基中進行純化。將已純化的鐮孢菌酸抗性菌落收集在L液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，檢測Tn10(四環(huán)素敏感性)的缺失，完全LPS的存在和營養(yǎng)缺陷。這新菌株稱為X3784(UK-1)和X3806(798)(二者均具有基因型Δ〔crp-cysG-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕)。X3622〔(SL1344Δ〔crp-cysG〕-10)。最初分離的，如實例1所述(表1.B)。
由于cya-和crp-突變體的表型是相同的(Mal-、Stl-、Mtl-等)，可用載帶克隆的crp+基因并具有氨芐青霉素抗性的質(zhì)粒pSD110(schroeder and Dobrogosz，J.Bacteriol 167616-622(1986)暫時補充染色體中的Δcrp突變，當(dāng)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)引入時，能鑒別Δcya突變。用在鼠傷寒沙門氏菌X3670中繁殖的P22H Tint轉(zhuǎn)導(dǎo)X3622、X3784和X3806的L液體培養(yǎng)基生長培養(yǎng)物，它含有質(zhì)粒pSD110(表1)。在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml中進行選擇。26小時后，收集各菌株的氨芐青霉素抗性，Mal+菌落，在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖瓊脂+100μg氨芐青霉素/ml中進行純化，稱為X3901(798)和X3945(UK-1)(二者均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+)及X3706(SL1344)，它具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10pSD110+。
在L液體培養(yǎng)基+100μg氨芐青霉素/ml中培養(yǎng)菌株X3706、X3901和X3945，用在X3711中繁殖的P22H Tint分別轉(zhuǎn)導(dǎo)各菌株以引入連接的Δcya-12和zid-62∷Tn10突變。將該轉(zhuǎn)導(dǎo)混合物涂布在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml的平板。收集氨芐青霉素抗性(pSD110+)、四環(huán)素抗性(zid-62∷Tn10，Mal-(Δcya)菌落，在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml中進行純化。將已純化的菌落收集在L液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，檢測這些菌株的完全LPS和營養(yǎng)缺陷。得到的菌株稱為X3902(798)和X3956(UK-1)，二者均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10，及X3722(SL1344)，它具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10。在L液體培養(yǎng)基+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)X3722、X3902和X3956的培養(yǎng)物至出現(xiàn)混濁，以1∶10比例用BSG進行稀釋。將100μl各培養(yǎng)物樣品涂布在含鐮孢菌酸的培養(yǎng)基中，在37℃下保溫約36小時，收集各菌株的鐮孢菌酸抗性菌落，在FA培養(yǎng)基中進行純化。將已純化的FA-抗性菌落收集到L液體培養(yǎng)基中，進行培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，然后檢測Tn10(四環(huán)素敏感性)的缺失，完全LPS和營養(yǎng)缺陷。在該過程中pSD110質(zhì)粒通常從該菌株中自然消失，以導(dǎo)致氨芐青霉素敏感性，只是SL1344和UK-1的衍生包括二步以除去pSD110。最后的菌株稱為X3958(UK-1)和X4038(798)，二者均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕及X3724(SL1344)，它具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕(表1.B)。
無毒突變體的遺傳型和表型穩(wěn)定性測定遺傳特性穩(wěn)定性的方法如實施例1所述。由于Δcya Δcrp突變，所有遺傳型和表型特性是十分穩(wěn)定的，除能動性外。雖然功能性鞭毛的合成和能動性的表現(xiàn)取決于野生型cya和crp基因功能，但容易選擇在cfs(構(gòu)建鞭毛合成)基因中的抑制基因突變，以使鞭毛合成和能動性與cya和crp基因功能無關(guān)。在鼠傷寒沙門氏菌Δcya Δcrp菌株中，在該菌株構(gòu)建過程中容易選擇能動變異體。由于對鞭毛抗原的免疫是保護性的，所以可選擇所有疫苗菌株的能動變異體。
用Luria軟瓊脂涂覆技術(shù)，利用P22H Tint噬菌體敏感性，以抗血清(Difco Laboratorits，Detroit，MI)的載片凝集法可證實鼠傷寒沙門氏菌族BO-抗原的合成。
糖的發(fā)酵和在雙突變體菌株的各種碳源中生長與只含Δcya或Δcrp的菌株相同，如表2所示。根據(jù)對如有分解代謝活性的環(huán)狀A(yù)MP和環(huán)狀A(yù)MP受體蛋白質(zhì)的需求這一已公開的種種報道，該表型正如所預(yù)料的一樣。
在構(gòu)建接著的鐮孢菌酸抗性四環(huán)素敏感衍生物的選擇各步中，進行試驗，以決定與四環(huán)素敏感性野生型親代菌株所觀察到的相比，是否四環(huán)素抗性回復(fù)突變等位基因/突變體可以以較高頻率回收。在所有情況下，未觀察到該四環(huán)素抗性回復(fù)突變等位基因/突變體。
實施例5本實施例敘述通過引入影響cAMP合成和利用的缺失突變的無毒生物體的構(gòu)件，及鑒定具有二個缺失突變的菌株的表型穩(wěn)定性和完全無毒性。
細(xì)菌菌株所用的鼠傷寒沙門氏菌和傷寒沙門氏菌菌株列于表1.B和C中。這些菌株的保存和貯藏如實例1所述。
培養(yǎng)基用于細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)、計數(shù)和鑒定的復(fù)合培養(yǎng)基如實例1所述。
轉(zhuǎn)導(dǎo)和鐮孢菌酸的Tn10缺失選擇所用培養(yǎng)基和方法如實例1所述。
無毒突變體的遺傳穩(wěn)定性測定遺傳特性穩(wěn)定性的方法如實例1所述。
小鼠所有感染試驗均用雌性CFW-1小鼠(18-20g)(Charles River，Wilmington，MA)。將這些動物用于試驗以前，先在隔離的房間中飼養(yǎng)一周，將試驗用小鼠放在帶有金屬絲底板復(fù)蓋Nalgene濾片的籠內(nèi)。隨意給些食物和水。該動物的房間保持22-23℃，光照時間達12小時。
動物傳染性在腹膜內(nèi)(i.p.)注射豬胃粘蛋白后測定傷寒沙門氏菌菌株的毒性。接種到小鼠中的細(xì)菌在L液體培養(yǎng)基中在37℃靜置培養(yǎng)生長過夜。用預(yù)熱的L液體培養(yǎng)基以1∶50的比例稀釋該培養(yǎng)物，在37℃通風(fēng)約4小時使OD600約為0.8-1.0。將合適的稀釋液涂布在Penassay瓊脂上以進行滴度測定，并涂布在含1%麥芽糖的MacConkey瓊脂板上以鑒定cya/crp表型。
用26-gauge 3/8″的針將懸浮在15%(W/V)豬胃粘蛋白(Wilson lot＃0347A001)中的500μl傷寒沙門氏菌細(xì)胞注入未禁食的CFW-1小鼠進行腹膜內(nèi)接種。該粘蛋白懸浮液的制法為在121°F(15p.s.i.)熱壓處理10分鐘，中和至PH為7，在加傷寒沙門氏菌細(xì)胞前，每ml中加入3μg檸檬酸鐵銨(sigma，st.Louis.MO)。記錄10天的發(fā)病率和死亡率數(shù)據(jù)，然后測定該野生型母體的LD50值，以及Δcrp-11 Δcya-12衍生物的毒性。
含有cya和crp突變的傷寒沙門氏菌菌株的構(gòu)建用類似Curtiss和Kelly(1987)所述的經(jīng)典遺傳方法進行野生型、毒性傷寒沙門氏菌Ty2(type E，)ISP1820(type 46)和ISP2822(type E，)菌株的遺傳修飾，如下所述ISP1820和ISP2822是最近在智利流行傷寒期間分離的，它可能比傷寒沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)實驗室Ty2菌株的侵害性更強。該方法包括移動crp和cya基因缺失，該基因已被分離出并鑒定出其特征為在鼠傷寒沙門氏菌SL1344中)放轉(zhuǎn)座子Tn10(編碼四環(huán)素抗性)于Δcya或Δcrp突變體附近，并通過P22HTint一介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將連接特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入高毒性的傷寒沙門氏菌Ty2，ISP1820和ISP2822菌株中，同時挑選出四環(huán)素抗性及篩選麥芽糖陰性表型。將連接crp的zhc-1431∷Tn10和連接cya的zid-62∷Tn10用于該目的。沒有一種插入單獨影響鼠傷寒沙門氏菌的毒性。
首先在含Δcrp-11和zhc-1431∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株X3773中制成高滴度噬菌體P22HTint溶菌產(chǎn)物，再在含Δcya-12和zid-62∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株X3773中制成高滴度噬菌體P22H Tint溶菌產(chǎn)物，再在含Δcya-12和zid-62∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株X3711中生成另一種溶菌產(chǎn)物便很方便地進行帶有連接轉(zhuǎn)座子的基因缺失的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后用所得的P22HTint溶菌產(chǎn)物以感染復(fù)制率10進行感染，將遺傳特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入受體傷寒沙門氏菌Ty2、ISP1820和ISP2822菌株中。
用鼠傷寒沙門氏菌X3773〔Δcrp-11 zhc-1431∷Tn10〕中繁殖的P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)毒性傷寒沙門氏菌Ty2、ISP1820和ISP2822菌株為篩選Mal-的四環(huán)素抗性。將噬菌感染混合物在37℃下保溫20分鐘，然后將100μl樣品涂布在含1%麥芽糖(最終濃度)，添加12.5μg四環(huán)素/ml的MacConkey瓊脂(Difco Laboratories，Detroit，MI)上。在37℃保溫約26小時后，收集四環(huán)素抗性Mal-轉(zhuǎn)導(dǎo)體，在相同的培養(yǎng)基中進行純化。所得到的Ty2衍生物稱為X3853，ISP1820衍生物稱為X4298，ISP2822衍生物稱為X3852。所有這些菌株均具有基因型Δcrp-11 zhc-1431∷Tn10(表1.C.)。在L液體培養(yǎng)基+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)菌株X3852、X3853和X4298，用含明膠的緩沖鹽水(BSG)以1∶10比例稀釋各菌株，將100μl各菌株樣品涂布在含鐮孢菌酸(FA)的培養(yǎng)基上(Maloy and Nunn，1981)，將該平板在37℃下保溫約36小時。將各菌株的鐮孢菌酸抗性菌落收集到0.5ml BSG中，在FA培養(yǎng)基中進行純化。將已純化的鐮孢菌酸抗性菌落收集在L液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，檢測Tn10(四環(huán)素敏感性)的缺失，完全LPS和Vi抗原的存在以及半胱氨酸和色氨酸(所有母體菌株需要的二種氨基酸)營養(yǎng)缺陷。這些新菌株稱為X3877(ISP2822)、X3878(Ty2)和X4299(ISP1820)，它們均具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕(表1.C.)。
由于Cya-和Crp-突變體的表型是相同的(Mal-、Stl-、Mtl-等)，可用載帶克隆的Crp+基因，并具有氨芐青霉素抗性的質(zhì)粒pSD110(Schroeder and Dobrogosz，J.Bacteriol，167616-622(1986)〕暫時補充染色體中的Δcrp突變，當(dāng)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)引入時，能鑒定Δcya突變。用在鼠傷寒沙門氏菌X3670中繁殖的P22H Tint轉(zhuǎn)導(dǎo)X3877、X3878和X4299的L液體培養(yǎng)基生長培養(yǎng)物，它含有質(zhì)粒pSD110(表1.B.)。在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml中進行選擇。26小時后，收集各菌株的氨芐青霉素抗性、Mal+菌落，在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖瓊脂+100μg氨芐青霉素/ml中進行純化，得到的菌株稱為X3879(ISP2822)，X3880(Ty2)和X4300(ISP1820)，它們所有均具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+在L液體培養(yǎng)基+100μg氨芐青霉素/ml中培養(yǎng)菌株X3879、X3880和X4300，用在X3711中繁殖的P22HTint分別轉(zhuǎn)導(dǎo)各菌株以引入連接的Δcya-12和zid-62∷Tn10突變。將該轉(zhuǎn)換混合物涂布在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml的平板上。收集氨芐青霉素抗性(pSD110+)、四環(huán)素抗性(zid-62∷Tn10)，Mal-(Δcya)菌落，在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml中進行純化。將已純化的菌落收集在L液體培養(yǎng)基中，進行培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，檢測這些菌株的完全LPS、Vi抗原和半胱氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷。所得到的菌株稱為X3921(ISP2822)、X3922(Ty2)和X4316(ISP1820)，所有均具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10(表1.C.)。在L液體培養(yǎng)基+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)X3921、X3922和X4316的培養(yǎng)物至出現(xiàn)混濁，用BSG以1∶10比例進行稀釋，將100μl各培養(yǎng)物樣品涂布在含鐮孢菌酸的培養(yǎng)基上，在37℃下保溫約36小時，收集各菌株的鐮孢菌酸抗性菌落，在FA培養(yǎng)基中進行純化。將已純化的FA-抗性菌落收集到L液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，然后檢測Tn10(四環(huán)素敏感性)的缺失，完全LPS，Vi抗原和半胱氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷。在該過程中，質(zhì)粒pSD110通常從該菌株中自然消失以導(dǎo)致氨芐青霉素敏感性。最后得到的菌株稱為X3926(ISP2822)、X3927(Ty2)和X4322(ISP1820)，所有均具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕(表1.C.)。用Luria軟瓊脂涂復(fù)技術(shù)，利用ViⅡ噬菌體敏感性，用對Vi(Difco Laboratories，Detroit，MI)的抗血清載片凝集法可證實傷寒沙門氏菌Vi抗原的合成。鞭毛的合成取決于功能性cya和crp基因。然而，由于鞭毛是一種有潛力的重要抗原，因此Δcya Δcrp傷寒沙門氏菌菌株的能動衍生物〔由于在cfs(本質(zhì)的鞭毛合成物)基因中突變(silverman和simon，J.Bacteriol.1201196-1203(1974)〕可在能動性瓊脂中選擇。X3926和X3927作為鞭毛狀的和能動性的被分離出，其中菌株X4323作為X4222的鞭毛陽性能動衍生物而被選擇。
表8列出了關(guān)系到糖的發(fā)酵和在各種碳中生長的所有突變體菌株及其母體的表型性質(zhì)，LPS外形，Vi抗原和平均生殖時間。根據(jù)所公開報道的需具有分解代謝活性的環(huán)狀A(yù)MP和環(huán)狀A(yù)MP受體蛋白質(zhì)這一必要條件，這些表型是正如所預(yù)料的一樣。
無毒突變體的遺傳穩(wěn)定性作活疫苗口服用的菌株就其無毒屬性來說必須完全穩(wěn)定。將Δcya Δcrp傷寒沙門氏菌菌株濃縮50倍的培養(yǎng)物和各種稀釋液(～109、107、105、103CFU/平板)涂布在含0.5%麥芽糖、蜜二糖、木糖、甘油、或鼠李糖(不會幫助其生長)的基本瓊脂培養(yǎng)基(添加所需氨基酸)的平板上時，檢測不到回復(fù)突變等位基因和突變體。將一組復(fù)制平板進行紫外線輻照(5焦耳/米2/秒)，并在暗處在37℃下保溫。另一組平板在光照下在37℃保溫。生長48小時后，未檢測到回復(fù)突變等位基因和突變體，也進行試驗以便確定與親代菌株可以觀察到的相比，四環(huán)素抗性回復(fù)突變等位基因/突變體是否能以較高頻率回收。但在所有情況下，均未檢測到這種四環(huán)素抗性回復(fù)突變等位基因/突變體。
突變體菌株對小鼠的毒性表9所列數(shù)據(jù)說明用大約104倍LD50劑量的X3926或X3927感染小鼠后的存活情況。傷寒沙門氏菌的天然宿主是人。因此，用豬胃粘蛋白作小鼠中傷寒沙門氏菌細(xì)胞的毒性增強劑，從而使該模擬系統(tǒng)中傷寒沙門氏菌疫苗后選物的毒性達最大。
實施例6本實施例說明通過引入影響cAMP合成和利用的缺失突變，以及引入通過影響深層組織移生而控制沙門氏菌毒性的一個相鄰基因的無毒微生物的構(gòu)建。
細(xì)菌菌株所用鼠傷寒沙門氏菌和傷寒沙門氏菌菌株列于表1.B和C中，這些菌株的保存和貯藏如實例1所述。
培養(yǎng)基用于細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)、計數(shù)和鑒定的復(fù)合培養(yǎng)基如實例1所述。
轉(zhuǎn)導(dǎo)和鐮孢菌酸Tn10缺失選擇所用培養(yǎng)基和方法如實例1所述。
無毒突變體的遺傳穩(wěn)定性測定遺傳特性穩(wěn)定性的方法如實例1所述。
含有Δcya-12和Δ〔crp-cysG〕-10突變的傷寒沙門氏菌菌株的構(gòu)建傷寒沙門氏菌對人的侵害性很強。雖然含有Δcya-12和Δcrp-11突變的傷寒沙門氏菌(S.typhi)菌株顯示無毒，但也似乎為慎重起見考慮加入一種額外的減毒突變以進一步提高安全性而不損害其致免疫性。在鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimu-rium)菌株中Δ〔crp-cysG〕-10突變的性質(zhì)(實例1、3和4)證明它的使用可使傷寒沙門氏菌(S.typhi)無毒和致免疫。該突變也缺失cdt基因，該基因控制鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的深層組織移生，而不會明顯減少腸道的移生和GALT。
用類似Curtiss和Kelly(1987)所述的經(jīng)典遺傳方法對野生型、毒性Ty2(E1型)、ISP1820(46型)、和ISP2822(E1型)菌株進行遺傳修飾，如下所述ISP1820和ISP2822是最近在智利流行傷寒期間分離的，它可能比傷寒沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)實驗室Ty2菌株的侵害性更強。因此，其減毒作用生成疫苗菌株比由Ty2衍生的菌株更有效。該構(gòu)建方法包括使crp和cya基因缺失移動，該基因已被分離出并已鑒定。
〔在鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)SL1344中(如實例1所述)〕，放轉(zhuǎn)座子Tn10(編碼四環(huán)素抗性)于靠近Δcya或Δ〔crp-cysG〕-10突變附近和利用P22HTint介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將連接特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入傷寒沙門氏菌Ty2和高毒性傷寒沙門氏菌ISP1820和ISP2822菌株同時選擇四環(huán)素抗性和篩選麥芽糖陰性表型。將連接〔crp-cysG〕-10的zhc-1431∷Tn10和連接cya的zid-62∷Tn10用于該目的。沒有一種插入單獨影響鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)的毒性。
先在含Δ〔crp-cysG〕-10和zhc-1431∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)菌株X3712中制成高滴度噬菌體P22HTint溶菌產(chǎn)物，在含Δcya-12和zid-62∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)菌株X3711中制成另一種溶菌產(chǎn)物便很方便的進行具有連接轉(zhuǎn)座子的基因缺失的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后用所得到的P22HTint溶菌產(chǎn)物將遺傳特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入受體傷寒沙門氏菌(S.typhi)Ty2、ISP1820和ISP2822菌株中。
用在鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)X3712(Δ〔crp-cysG〕-10 zhc-1431∷Tn10)中繁殖的P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)毒性傷寒沙門氏菌(S.typhi)Ty2、ISP1820和ISP2822菌株為四環(huán)素抗性同時篩選Mal-。將噬菌感染混合物在37℃下保溫20分鐘，然后將100μl樣品涂布在含1%麥芽糖(最終濃度)，添加12.5μg四環(huán)素/ml的MacConkey瓊脂(Difco Laboratories，Detroit，MI)平板上。在37℃保溫約26小時后，收集四環(huán)素抗性Mal-轉(zhuǎn)導(dǎo)體，在相同的培養(yǎng)基中進行純化。所得到的ISP2822衍生物稱為X3791，該Ty2衍生物稱為X3792，ISP1820衍生物稱為X4324。所有這些菌株均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 zhc-1431∷Tn10，它們是半胱氨酸、色氨酸和精氨酸營養(yǎng)缺陷(表1.C)。在L液體培養(yǎng)基+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)菌株X3791、X3792和X4324。用含明膠的緩沖鹽水(BSG)以1∶10比例稀釋各培養(yǎng)物，取100μl各培養(yǎng)物涂布在含鐮孢菌酸(FA)的培養(yǎng)基(Maloy and Nunn，1981)板上，將該板在37℃下保溫約36小時。將各菌株的鐮孢菌酸抗性菌落收集到0.5ml BSG中，在FA培養(yǎng)基中進行純化。將已純化的鐮孢菌酸抗性菌落收集到L液體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，檢測Tn10(四環(huán)素敏感性)缺失，完全LPS和Vi抗原的存在以及半胱氨酸、精氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷。這些新菌株稱為X3802(ISP2822)、X3803(Ty2)和X4325(ISP1820)，所有這些菌株均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕(表1.C)。
由于Cya-和Crp-/Cdt-突變體的基因型是相同的(Mal-、Stl-、Mtl-等)，可用載帶克隆的Crp+基因并具有氨芐青霉素抗性的質(zhì)粒pSD110(Schroeder and Dobrogosz.J.Bacteriol.167616-622(1986))暫時補充染色體中的Δcrp突變，當(dāng)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)引入時，能鑒定Δcya突變。用在鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)X3670中繁殖的P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)X3802、X3803和X4325的L液體培養(yǎng)基生長培養(yǎng)物，它含有質(zhì)粒pSD110(表1.B)。在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml中進行選擇。26小時后，收集各菌株的氨芐青霉素抗性，Mal+菌落，在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖瓊脂+100μg氨芐青霉素/ml中進行純化，得到的菌株稱為X3824(Ty2)，X3845(ISP2822)和X4331(ISP1820)，所有這些菌株均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+。
在L液體培養(yǎng)基+100μg氨芐青霉素/ml中培養(yǎng)菌株X3824、X3845和X4331，用在X3711中繁殖的P22HTint分別轉(zhuǎn)換各菌株以引入連接的Δcya-12和zid-62∷Tn10突變。將該轉(zhuǎn)導(dǎo)混合物涂布在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml上。收集氨芐青霉素抗性(pSD110+)、四環(huán)素抗性(zid-62∷Tn10)，Mal-(Δcya)菌落，在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml進行純化。將已純化的菌落收集到L液體培養(yǎng)基中，進行培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，檢測這些菌株的完全LPS，Vi抗原和半胱氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷。得到的菌株稱為X3919(Ty2)、X3920(ISP2822)和X4340(ISP1820)，所有這些菌株均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10。在L液體培養(yǎng)基+100ug氨芐青霉素/ml+12.5ug四環(huán)素/ml中培養(yǎng)×3919、X3920和X4340的培養(yǎng)物至出現(xiàn)混濁，用BSG以1∶10的比例進行稀釋，將各培養(yǎng)物的100μl樣品涂布在含鐮孢菌酸培養(yǎng)基的板上，在37℃下保溫的36小時。收集各菌株的鐮孢菌酸抗性菌落，在FA培養(yǎng)基中進行純化。將已純化的FA抗性菌落收集到L液體培養(yǎng)基中，進行培養(yǎng)至出現(xiàn)混濁，然后檢測Tn10(四環(huán)素敏感性)的缺失，完全LPS，Vi抗原和半胱氨酸、精氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷。在該工序中pSD110質(zhì)粒通常從該菌株中自然消失，結(jié)果得到氨芐青霉素敏感性。最后得到的這些菌株稱為X3924(Tyz)、X3925(TSP2822)和X4345(TSP1820)，所有這些菌株均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10Δ〔znc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕(表l.c.)。用Luria軟瓊脂涂復(fù)技術(shù)，采用ViTT噬菌體敏感性，用對Vi(Difco Laboratories，Detroit，MI)的抗血清載片凝集法可證實傷寒沙門氏菌(S.typhi)Vi抗原的合成。鞭毛的合成取決于功能性cya和crp基因。然而，因為鞭毛是一種有潛力的重要抗原，由于在cfs(本質(zhì)的鞭毛合成物)基因中突變(Silverman and Simon，J.Bacteriol 1201196-1203(1974))，因此可在能動性瓊脂中選擇Δcya Δcrp傷寒沙門氏菌菌株的能動衍生物。菌株X3940(ISP2822)，X4073(Tyz)和X4346(ISP1820)分別作為X3925、X3924和X4345的鞭毛陽性能動衍生物而被選擇。
糖的發(fā)酵和在Δ〔crp-cysG〕-10突變體菌株在各種碳源中生長與Δcrp-11突變體菌株所觀察到的是相同。根據(jù)公開報道的需要有分解代謝活性的環(huán)狀A(yù)MP和環(huán)狀A(yù)MP受體蛋白質(zhì)的這一條件，該表型正如所預(yù)料的。
無毒突變體的遺傳穩(wěn)定性作活疫苗口服用的菌株其無毒屬性必須完全穩(wěn)定。將Δcya Δcrp傷寒沙門氏菌(S.typhi)菌株濃縮50倍的培養(yǎng)物和各種稀釋液(～109、107、105，103CFU/板)涂布在含0.5%麥芽糖、蜜二糖、木糖、甘油或鼠李糖(不會幫助其生長)的基本瓊脂培養(yǎng)基(添加所定量氨基酸)的平板上時，檢測不到回復(fù)突變等位基因和突變體。將一組復(fù)制板進行紫外線輻照(5焦耳/米2/秒)，并在暗處中，在37℃保溫。其它組的板在光照下在37℃保溫。生長48小時后，未測到回復(fù)突變等位基因和突變體。對四環(huán)素抗性回復(fù)突變等位基因/突變體的回收與其親代菌株的測定值相比能否以較高頻率出現(xiàn)進行了試驗。在所有情況下，均未檢測到這種四環(huán)素抗性回復(fù)突變等位基因/突變體。
實施例7本例描述重組體無毒傷寒沙門氏菌菌株的構(gòu)建，該菌株表達作為口服疫苗使用以對各種傳染病免疫的外來抗原。
細(xì)菌菌株使用的大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和傷寒沙門氏菌的菌株列于表1。這些菌株的維持和儲存如表1所述。
培養(yǎng)基適于細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)、計數(shù)和鑒定的復(fù)合培養(yǎng)基如例1所述。
轉(zhuǎn)導(dǎo)和鐮孢菌酸的Tn10缺失選擇培養(yǎng)基和方法列于例1。
具有Δasd A1突變的傷寒沙門氏菌菌株的構(gòu)建采用類似于Curtiss和Kelly(1987)和Nakayama、Kelly和Curtiss(1988)所述經(jīng)典遺傳方法，將野生型毒性的傷寒沙門氏菌Ty2(E1型)按下述步驟，從遺傳上加以改性含Δcya-12 Δcrp-11突變的菌株X3927和X4323的構(gòu)建描述于例5中，含Δ〔crp-cysG〕-10突變的菌株X4346的構(gòu)建描述于例6。在無毒沙門氏菌屬菌株中的重組質(zhì)粒上穩(wěn)定的維持和高水平的表達克隆基因，取決于使用平衡的-致死寄主-載體系統(tǒng)(balanced-lethal host-vector system)。為此編碼天冬氨酸β-半醛脫氫酶的asd基因的染色體突變，被引入Δcya Δcrp突變體中，以此強加上需二氨基庚二酸(DAP)這一專門必要條件，該酸是細(xì)菌細(xì)胞壁堅硬層的主要成分，而且它不能在動物體內(nèi)合成。染色體Δasd突變由具有野生型asd+基因的質(zhì)?？寺≥d體加以補充。質(zhì)粒的喪失導(dǎo)至無DAP(DAPless)死亡和細(xì)胞的溶解。這種平衡的-致死寄主-載體的結(jié)合，在已免疫的動物寄主中可穩(wěn)定數(shù)周，并能對克隆的基因產(chǎn)物以及沙門氏菌屬誘發(fā)出強烈的免疫應(yīng)答。
構(gòu)建方法包括移動Δasd A1突變(該突變已被分離出并已在鼠傷寒沙門氏菌LT2-Z(X3520)中驗明特征)至Δcya Δcrp傷寒沙門氏菌。該步驟的完成是通過放置轉(zhuǎn)座子Tn10(編碼四環(huán)素抗性)靠近Δasd A1突變，再通過P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，將連接特性轉(zhuǎn)導(dǎo)入傷寒沙門氏菌Ty2 Δcya-12 Δcrp-11菌株X3927、傷寒沙門氏菌ISP1820Δcya-12Δcrp-11菌株X4323以及傷寒沙門氏菌ISP1820 ΔcyaΔ〔crp-cysG〕-10菌株X4346并同時挑選四環(huán)素抗性和篩選二氨基庚二酸(DAP)陰性表型。用連接Δasd A1的zhf-4∷Tn10于該目的。
帶連接轉(zhuǎn)座子的基因缺失，按下述方法很方便進行首先在含ΔasdA1和zhf-4∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌X3520上制成高滴度的噬菌體P22HTint溶胞產(chǎn)物，所得到的P22HTint溶胞產(chǎn)物再用于感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳特性至受體傷寒沙門氏菌Ty2菌株X3927，ISP1820菌株X4323和X4346，其感染復(fù)制率為10。
噬菌體細(xì)菌感染混合物于37℃下保溫20分鐘，然后取100μl樣品涂布于含50μg DAP/ml的Penassay瓊脂上(Difco實驗室Detroit、MI)，并補充以12.5μg四環(huán)素/ml，于37℃下保溫約26小時后，檢出轉(zhuǎn)導(dǎo)體并于相同培養(yǎng)基上純化。5個四環(huán)素抗性菌落篩選出，能產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)體約4-5個，也是需DAP者。所得到的Ty2衍生物稱為X4295并具有基因型Δcrp-11Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕 Δasd A1 zhf-4∷Tn10。所得到的ISP1820衍生物稱為X4416，具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10Δ〔zhc-1431∷Tn10〕 Δ〔zid-62∷Tn10〕ΔasdA1 zhf-4∷Tn10和X4434具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕ΔasdA1 zhf-4∷Tn10。菌株X4296、X4416和X4434在L液體培養(yǎng)基+50μg DAP/ml+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基用含明膠的緩沖生理鹽水(BSG)以1∶10比例稀釋。取100μl樣品涂布于含鐮孢菌酸(FA)+50μg DAP/ml的培養(yǎng)基上(Malog和Nunn，1981)，再將平板于37℃下保溫大約36小時。鐮孢菌酸抗性菌落取出放入0.5mlBSG中，并于FA+50μg DAP/ml的培養(yǎng)基上純化。純化過的鐮孢菌酸抗性菌落取出放入L液體培養(yǎng)基+50μg DAP/ml中，于37℃下培養(yǎng)至溶液發(fā)生混濁，再檢驗Tn10缺失(四環(huán)素敏感性)，完全LPB和Vi抗原的存在以及在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和DAP的營養(yǎng)缺陷，新菌株稱為X4297(Ty2)，該菌株具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕 Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕 ΔasdA1 Δ〔zhf-4∷Tn10〕;X4417(ISP1820)，具有基因型Δ(crp-cysG)-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕 Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕 ΔasdA1 Δ〔zhf-4∷Tn10〕;以及X4435(ISP1820)，具有基因型 Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕 Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕 ΔasdA1 Δ〔zhf-4∷Tn10〕。
野生型親代菌株的Asd-衍生物構(gòu)建的目的是用于將由Crp+Cya+背景表達的重組抗原的產(chǎn)生與用Crp-Cdt-Cya-背景表達的相比較。Ty2 ΔasdA1菌株的構(gòu)建是通過用P22HTint(X3520)轉(zhuǎn)導(dǎo)傷寒沙門氏菌X3769和傷寒沙門氏菌ISP1820菌株X3744，同時選擇四環(huán)素抗性和篩選二氨基庚二酸陰性表型。所得到的Ty2衍生物稱為X4456而ISP1820衍生物稱為X4454，且兩者都具有基因型ΔasdA1 zhf-4∷Tn10。菌株X4456和X4454在L液體培養(yǎng)基+50μg DAP/ml+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)并按1∶10比例將培養(yǎng)基用含明膠的緩沖生理鹽水(BSG)稀釋。將100μl的樣品涂布于含鐮孢菌酸+50μg DAP/ml培養(yǎng)基(Maloy和Nunn，1981)中，平板于37℃下保溫約35小時。將鐮孢菌酸抗性菌落收集放入L液體培養(yǎng)基+50μg DAP/ml中并于37℃下培養(yǎng)至混濁，再驗證Tn10的缺失(四環(huán)素敏感性)，完全LPS和Vi抗原的存在，以及在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和DAP營養(yǎng)缺陷。新菌株稱為X4457(Ty2)和X4455，并具有基因型ΔasdA1 Δ〔zhf-4∷Tn10〕。
麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae)抗原在無毒重組傷寒沙門氏菌中的表達λgt11∷麻瘋分枝桿菌克隆L14(也稱為克隆7.8)，借助于匯集21名患麻瘋結(jié)節(jié)(LL)的麻瘋病人的血清通過λgt11∷麻瘋分析桿菌庫免疫篩選加以鑒定(Sathish，Esser Thole和Clark-Curtiss，Infect.Immun.581327-1336(1990))?？寺14確定了兩種約158和153KDa的蛋白，這兩種蛋白與匯集的LL病人血清中的抗體反應(yīng)非常強烈(Sathish等人，1990)。當(dāng)血清逐個被檢驗時，這些蛋白也與21名LL病人中的14名血清抗體反應(yīng)(Clark-Curtiss，Thole，Sathish，Bosecker，Sela，de Carvalho和Esser.Res.in Microbiology，in press)。
通過使用EcoRⅠ來消化重組噬菌體DNA，接著用瓊脂糖凝膠電泳法分離經(jīng)消化的片段，而從λgt11克隆14中除去1.0Kb的麻瘋分枝桿菌插入DNA片段。該麻瘋分枝桿菌片段從凝膠中提純并克隆到Asd+載體pYA292的EcoRⅠ位點(Galan，Nakayama和Curtiss，Gene(1990)，9429)，產(chǎn)生兩種重組質(zhì)粒pYA1077，其中麻瘋分枝桿菌插入DNA克隆成pYA292，其相對于trc啟動子的取向與它在λgt11中相對于lacZ啟動子的取向相同，還有pYA1078，其中麻瘋分枝桿菌(M.leprae)片段以相對于trc啟動子相反取向克隆。pYA1077的部分限制圖列于圖2，兩種重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進大腸桿菌(Escherichia coli)K-12菌株X6060和鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)菌株X3730，由轉(zhuǎn)化體特定的蛋白通過Western印跡法進行分析。克隆pYA1077特定大約30KDa的單融合蛋白，它能與匯集的LL病人血清中的抗體強烈反應(yīng)。克隆pYA1078不特定任何能與病人血清反應(yīng)的蛋白。
噬菌體P22HTint溶胞產(chǎn)物在鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)X3730+pYA1077和X3730+pYA1078上制備;這些溶胞產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)導(dǎo)傷寒沙門氏菌(S.typhi)X4297、X4417、X4435、X4455和X4457。借助于pYA1077由三種任意挑選的X4291轉(zhuǎn)導(dǎo)體產(chǎn)生的蛋白的Western印跡分析表明，每一種轉(zhuǎn)導(dǎo)體都特定一種能與匯集的LL病人血清反應(yīng)的30KDa蛋白，而其中三種獨立X4297轉(zhuǎn)導(dǎo)體(包含pYA1078)，就不特定任何免疫活性蛋白(圖3)。
另外，來源于pYA1077的免疫活性蛋白的表達，也能在X4417、X4435、X4455和X4457中被證明。圖4表示蛋白的Western印跡，該蛋白是由λgt11麻瘋分枝桿菌(M.leprae)克隆L14和包含pYA292、pYA1077和pYA1078的傷寒沙門氏菌(S.typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)和大腸桿菌(E.coli)產(chǎn)生的。硝化纖維濾紙上的蛋白，與21名麻瘋結(jié)節(jié)麻瘋病人匯集的血清起反應(yīng)，按Sathish、Esser.Thole和Clark-Curtiss(1990)581327所說明的技術(shù)檢測陽性抗原-抗體。尤其是當(dāng)次生抗體是堿性磷酸酶-結(jié)合抗-人多特異性抗體，產(chǎn)色底物是氮蘭四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯、P-甲苯胺鹽時。附圖泳道如下(泳道1)分子大小標(biāo)記;(泳道2)具有pYA1077的傷寒沙門氏菌(S.typhi)X4297;(泳道3)具有pYA1077的傷寒沙門氏菌(S.typhi)X4417;(泳道4)具有pYA1077的傷寒沙門氏菌X4435;(泳道5)具有pYA1077的傷寒沙門氏菌X4455;(泳道6)具有pYA1077的傷寒沙門氏菌(S.typhi)X＝4457;(泳道7)具有pYA292的傷寒沙門氏菌(S.typhi)X4297;(泳道8)具有pYA292的傷寒沙門氏菌(S.typhi)X4435;(泳道9)具有pYA292的傷寒沙門氏菌(S.typhi)的X4455;(泳道10)具有pYA292的傷寒沙門氏菌(S.typhi)X4457;(泳道11)具有pYA292的傷寒沙門氏菌(S.typhi)X4417;(泳道12)具有pYA1077的大腸桿菌(E.coli)X6097;(泳道13)來源于λgt11∷麻瘋分枝桿菌(M.leprae)克隆L14的蛋白;(泳道14)具有pYA1078的鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)X4072。由λgt11∷麻瘋分枝桿菌(M.leprae)克隆L14特定的免疫活性蛋白尺寸較大，因為它們是與β-半乳糖苷酶的融合蛋白。
具有pYA1077重組載體的傷寒沙門氏菌菌株X4297、X4417和X4435是用于人體免疫，對傷寒熱和麻瘋病具有保護作用的候選物。這種疫苗的效力由驗明1至數(shù)種麻瘋分枝桿菌抗原(該抗原可產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答)，并由其具有在傷寒沙門氏菌Δcya Δcrp Δcdt Δasd菌株中以Asd+載體所克隆基因而特定的該抗原而定，然后可用于人體免疫接種試驗。
實施例8本例提供的程序適于檢驗活口服疫苗的安全性、免疫性和效果，該疫苗包含傷寒沙門氏菌(S.typhi)的Δcya Δcrp突變體。試驗用的菌株是Ty2、ISP1820和ISP2822的Δcya Δcrp衍生物。
個體研究個體研究是年令為18-39歲的健康成年的志愿者。研究前予定的志愿者要經(jīng)篩選。篩選程序包括1.用藥史2.身體檢查3.心電圖4.尿分析5.全血球計數(shù)6.血化學(xué)(BUN、肌酸酐、禁食血糖)7.血清Na+、Cl-、K+、HCO-38.VDRL
9.乙型肝炎表面抗原10.按ELISA計的HIV抗體11.妊娠試驗(女性)12.肝功能試驗(SPGT)13.心理檢查和會見挑選參與研究的志愿者的根據(jù)是一般良好的健康狀況和1.不具重大臨床史的膽囊膀胱病，免疫缺乏、心血管性疾病、呼吸道疫病、內(nèi)分泌紊亂、肝病(包括乙型肝炎，腎臟和膀胱病史)、前列腺肥大、青光眼、胃腸病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)紊亂、神經(jīng)病、需住院治療的精神混亂、藥物或酒精濫用;
2.腸的正常和規(guī)則的習(xí)性(屬于普通群體所定義的界限)大便至少每周三次和每天不多于三次，不經(jīng)常使用輕瀉劑或止瀉藥劑;
3.對羥氨芐青霉素或ciprofloxacin不過敏;
4.接種疫苗前7天中無抗菌素治療史;
5.陰性妊娠試驗(女性);
6.HIV抗體試驗陰性。
讓志愿者進入隔離病房，還要獲得經(jīng)宣告的、能作為證據(jù)的書面許可。
研究計劃研究一群22名志愿者，收集原始血液和腸液樣品。在病房新環(huán)境下適應(yīng)2天后，禁食的志愿者允許隨機攝取摻有碳酸氫鹽緩沖劑的一次口服劑量，其中含5×105的Ty2 ISP1820或ISP2822之任一種Δcya Δcrp衍生物。以后觀察志愿者15天看有否不良反應(yīng)發(fā)燒、不適、寒冷、嘔吐、腹瀉(通常傷寒熱的潛伏期為8-12天)。獲得一系列血液和糞便培養(yǎng)物。另外，任何志愿者體溫升至100.8°F時，便即時抽取血樣進行觀察，假如體溫維持在該溫度12小時，開始口服羥氨芐青霉素(每6小時1.0g)和ciprofloxacin(每12小時750mg服10天)進行治療。在觀察期第7、10和13天還吸取十二指腸液物。
動物試驗借助豬胃粘蛋白作為輔助劑，通過腹膜內(nèi)接種小鼠測定親代菌株和其減毒的衍生物的LD50。
疫苗接種劑的配制傷寒沙門氏菌候選疫苗菌株的現(xiàn)有培養(yǎng)物，以胰蛋白酶(tryphicase)大豆液體培養(yǎng)基(TSB)(同時補充15%甘油)的細(xì)胞懸浮液形式儲存，溫度為-70℃，直到需要時。為制得每種菌株接種物，作細(xì)菌攻擊前2天，將懸浮液熔化并涂復(fù)于羊紅血細(xì)胞瓊脂上(TSA中的Srbc為5%)，于37℃保溫過夜。挑選大約20-30株具代表性的菌落再懸浮于生理鹽水中。該懸浮液于胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)平板上接種，培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)丶右匝a充，平板于37℃保溫過夜。在配制適于志愿者口服接種的制劑時，采集每塊平板上的生長物，大約使用3ml的消毒普通生理鹽水。用濁度測定法標(biāo)定所得到的懸浮液，在生理鹽水中稀釋至接近所需沙門氏菌屬的濃度。用冰鎮(zhèn)將疫苗接種物轉(zhuǎn)移至隔離病房。使用前要進行顯微鏡檢查和進行以傷寒沙門氏菌O和H抗血清的載片凝集法試驗。為了確定存活力和接種物尺寸，接種前和接種后，涂復(fù)于平板的復(fù)制物的定量培養(yǎng)物由接種物制成。
志愿者接種施用疫苗是摻有NaHCO3口服的，接種以前志愿者禁食(NPO)90分鐘。將2g NaHCO3溶解于5盎司蒸餾水中，志愿者飲4盎司的該碳酸氫鹽水，1分鐘后志愿者攝取懸浮于剩余的1盎司碳酸氫鹽水中的疫苗。接種后，志愿者不吃食物或水90分鐘。
樣品收集程序大便樣品持續(xù)記錄志愿者便出的全部大便編號、稠度和特征描述。收集每一份大便樣品(或若大便不通時用直腸拭子)用于培養(yǎng)，測量樣品的體積。大便按五點體系分等1級-硬大便(正常)2級-軟大便(正常)3級-稠液體(非正常)4級-非透明水樣(非正常)5級-米湯狀(非正常)靜脈切開放血接種疫苗前和接種后的第8、21、28、60和180天取抗體測定用的血清。在第0、4、7和10天收集為分泌抗體細(xì)胞檢驗用的，使淋巴細(xì)胞分離的肝素化血液。在第0、28、60和180天時收集的單核細(xì)胞用于檢驗淋巴細(xì)胞對沙門氏菌屬和對照抗原的增殖應(yīng)答。最后第0、28、60和180天時的單核細(xì)胞，也可用于對傷寒沙門氏菌和對照生物體的抗體依賴性胞毒性進行檢驗。接種后疫苗觀察期中，取第3、4、7、8、10、12和15天的血樣(5ml)培養(yǎng)以檢測疫苗生物體。在初次接種疫苗后的第180天，再取額外的血清和單核細(xì)胞樣品。
空腸液的吸出口服接種疫苗前和緊接排出液體之前(第15天)，志愿者吞下聚氯乙烯腸管，其距離為由嘴量起130cm，以收集腸液，測定局部SIgA抗體。在咽下腸管以后，口服10mg滅吐靈(甲氧普胺)以加速腸管由胃通過幽門進入小腸。管在空腸中放置的位置可從距離(130cm)，吸出液的顏色(黃-綠)和其PH值(6)來得到證實。每次插管排出的空腸體液大約100ml。
明膠引線膠囊為了測量每種疫苗菌株的腸移生速率，在住院期間，志愿者要三次吞咽明膠引線膠囊(Entero試驗)。
志愿者自上午6時禁食(NPO)，咽下水為潤濕嘴和咽喉。該膠囊(帶有拉出的線的部份)隨水咽下，同時拉住尼龍線的環(huán)、線停留在面部，并保持4小時。允許志愿者最多飲水1磅，但不允許吃其它的食物或飲料。4小時后取出線，為粘有粘液的膽汁所飽和的末端被切下放在消毒過的陪替氏培養(yǎng)皿中。為識別起見注上標(biāo)志。然后用該線培養(yǎng)微生物，采用的方法與用大便樣品相同。
扁桃體培養(yǎng)為了檢測接種疫苗后扁桃體淋巴組織可能的侵染，獲得第3、4、7、8、10、12和15天的系列扁桃體培養(yǎng)物。
細(xì)菌學(xué)分析大便、直腸拭子和吞咽明膠膠囊得到的粘膽汁的十二指腸引線15cm末端，均在亞硒酸鹽F濃縮液液體培養(yǎng)基中接種。扁桃體拭子接種在GN液體培養(yǎng)基中，于37℃保溫過夜后，再次培養(yǎng)在沙門氏菌屬-沙雷氏菌屬(Salmonella-shigella)瓊脂和XLD瓊脂上進行，兩者均需對疫苗菌株的營養(yǎng)缺陷作適當(dāng)?shù)难a充?？梢删滢D(zhuǎn)移至補充三倍糖鐵斜面培養(yǎng)上，并通過以傷寒沙門氏菌Vi，O和H抗血清的凝集作用而加以證實。這些分離物保存在-70℃的甘油中以便進一步分析(例如質(zhì)粒的存在或用克隆基因的特異基因探針作Southem印跡分析)。
血培養(yǎng)物(5ml)接種于50ml補充過腦心浸液的液體培養(yǎng)基中。
免疫學(xué)分析采用Levine等人(1987年)在J.Clin.Invest.79888-902所描述的程序檢驗血清和空腸樣品的對傷寒沙門菌O、H、和Vi抗原的IgA、IgM和IgG抗體(該抗原是按ELISA法測定過的)。H抗體也可使用弗吉尼亞沙門氏菌(S.Virginia)作抗原通過Widal管凝集來進行測定(S.Virginia與S.typhi共享同樣鞭毛抗原)。
收集末稍血單核細(xì)胞并為研究對沙門氏菌屬抗原的特異反應(yīng)而加以分離，這些包括下列內(nèi)容。
1.抗體-分泌細(xì)胞按Kantele等人的方法測定穿叉(trafficking)淋巴細(xì)胞，所述細(xì)胞能分泌抗傷寒沙門氏菌O、Vi或H抗原的IgG、IgA或IgG抗體。
2.復(fù)制淋巴細(xì)胞末稍血液單核細(xì)胞與加熱苯酞失活的傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、沙氏沙門氏菌(S.thompson)和大腸桿菌混合以檢測引發(fā)抗原的淋巴細(xì)胞復(fù)制，如上面Levine等人所述。
3.ADCC傷寒沙門氏菌的血漿介導(dǎo)單核細(xì)胞抑制作用，按上述Levine所述的抗體依賴性細(xì)胞毒素檢驗法進行檢驗。
疫苗菌株的排泄作用，予期服用一劑量疫苗后，疫苗菌株的排泄在一周內(nèi)終止。假若排泄持續(xù)7或更多天，就要給連續(xù)排泄的志愿者一定劑量的ciprofloxacin(每12小時750mg)，液體排泄物需連續(xù)兩天或兩天以上為陰性培養(yǎng)物方可。
實施例9本例用實例說明Δcya Δcrp傷寒沙門氏菌(S.typhi)菌株，X3927，的安全性和致免疫性，所述菌株是由野生型親代菌株Ty2制備的。該菌株在小鼠中的LD50為1.8×104(采用腹腔注射豬胃粘蛋白)。
下列的程序基本上如上文例8所述。兩群志愿者用來研究服用不同劑量的疫苗。在第一類研究中，以17名志愿者隨機處于雙盲方式，6名志愿者接受5×1015cfu的X3927，剩余的接受相同劑量的其它傷寒沙門氏菌(S.typhi)。在第二類研究中，19名志愿者隨機處于雙盲方式，6名志愿者接受5×104cfu的X3927，剩余者接受相同劑量的另外傷寒沙門氏菌(S.typhi)菌株。志愿者在隔離病房密切監(jiān)視15天(第一類研究)或24天(第二類研究)。在觀察期每6小時測一次生命征狀。每一志愿者的全部大便都收集在塑料容器內(nèi)、檢查、按五等分級，若大便是松散的則測其體積。醫(yī)生逐日會晤志愿者并詢問征狀。定義發(fā)燒為口腔溫度≥38.2℃;定義腹瀉為48小時內(nèi)兩次或更多次松散大便，其總體積至少為200ml或一次松散大便其體積≥300ml。對發(fā)燒加劇或陽性血培養(yǎng)的志愿者要給予抗生菌治療。
為了制備疫苗，將維持在-70℃下具有15%甘油的胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基上的現(xiàn)有的X3927中培養(yǎng)物解凍后在補充的變性瓊脂(aro agar)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。于37℃下保溫后，從變性瓊脂上挑出20-30株有代表性的疫苗菌株的菌落，懸浮于生理鹽水中，并再次接種于變性瓊脂上。37℃下培養(yǎng)過夜后，用3ml消毒磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)收集細(xì)菌，細(xì)菌的濃度用濁度測量法校對。懸浮液以PBS稀釋使達到每毫升存活生物體為所需之濃度。接種物的密度由顯微鏡檢查和與S.typhi O、H和Vi抗血清的side凝集作用來確定。涂覆于平板的復(fù)制物定量培養(yǎng)是由接種前后的接種物制成的，以證實存活率和接種物尺寸。
疫苗菌株與碳酸氫鈉一起口服施藥，碳酸氫鈉(2mg)溶解于150ml的蒸餾水中，志愿者飲120ml以中和胃酸。1分鐘后，志愿者飲用懸浮于剩余30ml碳酸氫鈉溶液中的疫苗。接種疫苗前后90分鐘內(nèi)，志愿者不得吃或飲任何東西。
志愿者排出的每份大便(如無大便排出可用直腸拭子)逐日進行疫苗菌株培養(yǎng)。大便接種于革蘭氏陰性液體培養(yǎng)基(BBL，cockeysvilla，MD)，補充以0.1%PABA和0.1%PHB和直接在具有補充物的S-S瓊脂上。37℃下保溫過夜后，在補充過的S-S瓊脂上進行次代培養(yǎng)。為了定量疫苗菌株的脫落，1克大便連續(xù)在生理鹽水中稀釋10倍并且每次稀釋液均涂布于如上補充的S-S瓊脂上，可疑菌落轉(zhuǎn)移至三倍糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)并以傷寒沙門菌的O、H和Vi抗血清凝聚法來確定其屬性。
疫苗接種后的第7、10和13天，禁食的志愿者吞下帶引線裝置的明膠膠囊以收集沾染膽汁的十二指腸液的樣品。4小時后，取出引線并記錄15cm末端的顏色和PH。由引線的終端擠壓出十二指腸液并按上述方式培養(yǎng)。
培養(yǎng)疫苗生物體的血液按接種疫苗后的第4、5、7、8、10、12和15天系統(tǒng)收集，如果出現(xiàn)發(fā)燒則再來一次，將5ml的血液接種到50ml的補充的變性液體培養(yǎng)基中。
另外，取1、2、4、5、7、8、10、12和15的扁桃體培養(yǎng)以檢測疫苗菌株。用于扁桃體的拭子接種于具有補充物的革蘭氏陰性液體培養(yǎng)基中24小時然后再涂于補充過的沙門氏菌屬-志賀氏桿菌屬(shigella)瓊脂上。
為了測定免疫反應(yīng)，接著進行下列程序。疫苗接種前和接種后的第7、21、28和60天取血清樣品。疫苗接種前和接種后的第14天收集空腸液，如例8所述。用ELISA法測量腸液中IgA的總含量并校準(zhǔn)每份樣品使每100ml含20mg的IgA。測量血清和空腸液中的S.typhi脂多糖(LPS)、H和Vi抗原的抗體。
對LPS O抗原的IgG抗體用ELISA法檢驗。試驗血清以1∶100的比例稀釋，接種前后，這二者之間凈光密度升高≥0.20被認(rèn)為是顯著性升高。陽性對照血清均使用含高水平LPS O抗體的微滴平板，它代表12名健康智利人血清匯集，這些人在免疫接種Ty21a疫苗后具有很強的IgG LPS O抗體反應(yīng)。對LPS O抗原的IgA抗體采用兩倍血清稀釋度來測量，一開始稀釋為1∶25。假若接種程序前后之間出現(xiàn)4倍的上升，這樣的IgA滴度被認(rèn)為是顯著的。
通過ELISA法也可測量腸分泌對傷寒沙門氏菌LPS O抗原的IgA抗體。上升4倍被認(rèn)為是顯著的。
為了測定H抗體，要從傷寒沙門氏菌菌株541Ty制備H-d鞭毛抗原。血清和空腸液H-d抗體可通過ELISA法測定。滴度上升4倍被認(rèn)為是顯著的。
使用弗吉尼亞沙門氏菌(Salmonella Virgina)(該菌與傷寒沙門氏菌共享鞭毛抗原d，而無其它抗原)來進行H抗體Widal管凝集試驗。
測定血清和空腸液中的Vi抗體，可用ELISA法，上升4倍認(rèn)為是顯著的。
腸-衍生的、穿叉(trafficking)抗體分泌細(xì)胞(分泌抗傷寒沙門氏菌O、H或Vi抗原的IgG、IgA或IgM抗體)，按Forrest等人(1988，Lancet 181)的方法，使用ELISA和ELISPOT檢測法加以改良來測定。在接種前和接種后的第7天和第10天取出肝素化血液。簡言之，將按Ficoll梯度法(Organon Teknika，Durham，NC)分離的末稍血淋巴細(xì)胞加到抗原-涂布平板上。在ELISA中，由淋巴細(xì)胞分泌出的抗體結(jié)合性能，可通過底物與結(jié)合的抗-IgA共軛物的反應(yīng)所產(chǎn)生的光密度的變化來測定。對LPS H和Vi抗原的顯著反應(yīng)是用在O.D.pllus 3 S.D.中之差來測定的，該差值由取自參加該項研究的志愿者免疫前和4天時的細(xì)胞測出的。在ELISPOT檢驗中，由個體淋巴細(xì)胞分泌的特異IgA的測定。是通過向每個微孔上加瓊脂糖，并計數(shù)底物與結(jié)合的抗-人IgA共軛物反應(yīng)所產(chǎn)生的色斑。接種后每個孔色斑≥4，定義為陽性反應(yīng)。該數(shù)目是根據(jù)接種前的斑數(shù)加上2 S.D.后的平均數(shù)得到的。
所得結(jié)果如下。
接種后志愿者的臨床病癥和癥狀以雙盲方式評價。12位接受菌株X3927的志愿者中的1人發(fā)燒，該志愿者接種后的第22天，發(fā)燒出現(xiàn)最高溫度達40.1℃。該志愿者在4-13天期間有過劇烈的腹痙攣、精神欠爽、缺乏食欲、頭痛和嘔吐，但22天前并未開始發(fā)燒。之后，他的癥狀包括暈弦，肌肉和身體持續(xù)疼痛、便泌、失眠和咳嗽產(chǎn)生棕色痰。該組另一志愿者在住院病人監(jiān)視期內(nèi)有過精神欠爽、痙攣、頭痛和反嘔。
細(xì)菌學(xué)研究表明，接受5×104cfu X3927的6名志愿者中有1名，接受5×105的六名中的1人，有血培養(yǎng)陽性反應(yīng)，這些分別于15天、8天和12天出現(xiàn)，這些志愿者中沒有一人有任何癥狀。接受X3927的十二位志愿者中，有一位檢驗其第1天的大便，發(fā)現(xiàn)一株疫苗生物體菌落。這些志愿者沒有1人扁桃體或十二指腸引線培養(yǎng)是陽性的。由志愿者的血液和大便回收的X3927分離物保留著全部與存在Δcya Δcrp突變有關(guān)的予期表型。
免疫學(xué)研究表明接受X3927的12名志愿者中有6名(50%)IgG抗傷寒沙門菌LPS反應(yīng)有發(fā)展。在12名志愿者中未檢出1例有對H抗原或Vi抗原的抗體。在12名志愿者中只有1例空腸液中抗LPS的分泌IgA有發(fā)展。對H抗原的分泌IgA抗體反應(yīng)只在1名志愿者出現(xiàn)，而接種后無志愿者具有分泌抗Vi抗體。通過ELISA或ELISASPOT檢驗法，檢測抗LPS的分泌IgA的循環(huán)細(xì)胞時，12名志愿者中有5名發(fā)展。
由在環(huán)AMP調(diào)節(jié)途徑中的缺失賦于的減毒程度，若志愿者不同時用突變體和親代菌株進行試驗則不能精確測出。然而，根據(jù)給志愿者相似劑量的野生菌株得出的歷史實驗資料表明，這種缺失使傷寒沙門氏菌減毒是很可能的。當(dāng)給6名志愿者服用劑量為1×107的野生型傷寒沙門菌株Ty2而無碳酸氫鈉時，83%出現(xiàn)傷寒發(fā)燒(定義溫度為103°F、持續(xù)36小時以上)或感染(定義為低級發(fā)燒、顯著的血清反應(yīng)、陽性血培養(yǎng)、或排泄傷寒沙門菌5天以上)。相反，在本文所報導(dǎo)的12名志愿者中，接受由Ty2衍生出來的X3927疫苗，與碳酸氫鈉一起使用劑量為104或105cfu(相當(dāng)于無碳酸氫鈉時一個高得多的劑量)，僅一例志愿者發(fā)燒且血培養(yǎng)陽性。除此而外，出現(xiàn)發(fā)熱的志愿者在他們的血液中并沒有檢測出疫苗細(xì)菌，盡管發(fā)燒的同時收集了額外的血培養(yǎng)。出現(xiàn)發(fā)燒可能是在于由疫苗的腸感染刺激的胞質(zhì)分裂釋放作出反應(yīng)所致。
實施例10本例描述含Δcdt突變的Δcrp-10 Δcya傷寒沙門氏菌構(gòu)件的構(gòu)建和特性鑒定。我們已將Δcya Δcrp突變引入傷寒沙門氏菌Ty2(E1型)和傷寒沙門氏菌ISP1820(智利流行性分離株46型)。具有Δcya-12和Δcrp-11突變的菌株，前者已在志愿者中進行了評價，描述于例9。接受5×104cfu Δcrp-11 Δcya-12傷寒沙門菌株X3927的6名志愿者中有一名，接受5×105cfu的6名中有1名出現(xiàn)陽性培養(yǎng)物，這些分別出現(xiàn)在15天和8、12天。然而這些志愿者中沒有1人有任何癥狀。此外，并不是所有的免疫過的個體對傷寒沙門氏菌抗原都能演變成高滴度抗體反應(yīng)。為了能在這些已免疫的大多數(shù)中誘導(dǎo)保護性免疫，需經(jīng)額外減毒，使能口服較高劑量的突變體。我們已鑒定了被引入Δcya Δcrp傷寒沙門菌的附加基因缺陷，結(jié)果降低了毒性，于是可以使用較高劑量。該缺陷是使深層組織移生的一種稱為cdt的基因缺失。除帶Δcya和Δcrp突變外，還帶Δcdt突變的菌株，與只有Δcya Δcrp突變的菌株相比，能存活于人血清中也較少，因此它們比較容易清除，并且不大可能誘發(fā)疫苗癥(Vaccinemia)，菌株構(gòu)建野生型毒性傷寒沙門氏Ty2(E1型)和ISP1820(46型)菌株，按Curtiss和Kelly(1987)在Infect.Immun 553035-3043描述的經(jīng)典遺傳方法從遺傳學(xué)上進行改性。鼠傷寒沙門氏菌缺失突變體，當(dāng)缺少腺苷酸環(huán)化酶和環(huán)AMP受體蛋白時是無毒的和致免疫的(Infect.Immun.553035-3043(1))。該方法包括方便地轉(zhuǎn)導(dǎo)crp-cdt(稱為Δcrp-10)和cya基因的缺失，所述基因已分離出、已鑒定特征(在鼠傷寒沙門氏菌SL1344中)，放轉(zhuǎn)座子Tn10(編碼四環(huán)素抗性)靠近cya或crp缺失處。因此，我們分別使用了與Δcrp-10連接的zhc-1431∷Tn10和與Δcya-12連接的zid-62∷Tn10，并且用P22HTint共轉(zhuǎn)導(dǎo)該連接特性入高毒性傷寒沙門氏菌Ty2和ISP1820菌株，同時選擇四環(huán)素抗性和篩選麥芽糖陰性表型。
首先在含Δcrp-10 zhc-1431∷Tn10突變的鼠傷寒沙門氏菌菌株X3712上制成高滴度的噬菌體P22HTint溶胞產(chǎn)物和在含Δcya-12 zid-62∷Tn10突變的鼠傷寒沙門菌菌株X3711上制成另一溶胞產(chǎn)物，帶連接轉(zhuǎn)座子的基因缺失轉(zhuǎn)導(dǎo)便很方便地進行。然后將所得到的P22HTint溶胞產(chǎn)物用于感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳特性致受體鼠傷寒沙門氏菌Ty2(X3769)和ISP1820(X3744)菌株，其感染復(fù)制率為10。
在鼠傷寒沙門氏菌X3712(Δcrp-10 zhc-1431∷Tn10)上繁殖的P22HTint用于轉(zhuǎn)導(dǎo)有毒的傷寒沙門氏菌Ty2和ISP1820菌株成為Mal-、Tetr。噬菌體細(xì)菌感染混合物，先于37℃保溫20分鐘，再將100μl樣品涂于含1%麥芽糖(最終濃度)并補充以12.5μg四環(huán)素/ml的MacConkey瓊脂(Difco實驗室Detroit，MI)上。在37℃下保溫大約26-36小時后，取出轉(zhuǎn)導(dǎo)體，并于同樣培養(yǎng)基上純化。所得到的Ty2衍生物稱為X3792而ISP1820衍生物稱為X4324。兩者都具有基因型Δcrp-10 zhc-1431∷Tn10，菌株X3992和X4324在Lucria液體培養(yǎng)基+12.5μg四環(huán)素/ml中培養(yǎng)、并且每一種都用具明膠的緩沖發(fā)理鹽水(BSG)以1∶10的比例稀釋。將每種菌株的100ml樣品涂布于含鐮孢菌酸(FA)的培養(yǎng)基上(Maloy和Nunn(1981)，J.Bacterial 1451110-1112)，該平板在37℃保溫約36小時。將每種菌株的鐮孢菌酸抗性菌落放入0.5ml BSG中，再于FA培養(yǎng)基上用劃線法純化。純化過的鐮孢菌酸抗性菌落放入Luria液體培養(yǎng)基上再于37℃培養(yǎng)至混濁、然后驗證Tn10缺失(四環(huán)素敏感性)、完全LPS、Vi抗原和精氨酸，半胱氨酸及色氨酸的營養(yǎng)缺陷。新菌株稱為X3803(Ty2)和X4325(ISP1820)。它們具有基因基Δcrp-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10。
附注1Luria液體培養(yǎng)基每升含10g的Nacl，而Lennox液體培養(yǎng)基每升含5g Nacl?，F(xiàn)已證明在高滲透性培養(yǎng)基中生長的沙門氏菌細(xì)胞顯示侵入組織培養(yǎng)細(xì)胞的能力，增加了(Galan和Curtiss，Infect，Immnn.(1990)581879-1885);為侵入所必須的沙門氏菌基因的表達，可通過DNA超卷曲的改變來調(diào)節(jié))。因此增加Luria液體培養(yǎng)基中的Nacl濃度能保證疫苗菌株的最佳效果。
由于cya-和crp-/cdt-突變體的表型是一樣的(Mal-、Stl-、Mtl-等)，因此質(zhì)粒pSD110、載帶克隆野生型crp+基因與其啟動子一起(Schroeoler和Dobrogosz(1986)，J.Bacteriol 167616-622)被暫時用于補充染色體中的Δcrp突變(因此菌株恢復(fù)成野生型表型)、并且能在轉(zhuǎn)導(dǎo)后鑒定具有Δcya突變的菌株、X3803和X4325的Luria液體培養(yǎng)物用在鼠傷寒沙門氏菌X3670上繁殖的P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中含有質(zhì)粒pSD110。選擇是在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml上進行的。26小時后，挑出每種菌株的氨芐青霉素-抗性的。Mal+菌落并于MacConkey瓊脂+1%麥芽糖瓊脂上純化稱為X3824(Ty2)和X4331(ISP1820)，它們有基因型Δcrp-10Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+。
菌株X3824和X4331在L液體培養(yǎng)基+100μg氨芐青霉素/ml中生長并且每株獨立用X3712上繁殖的P22HTint轉(zhuǎn)導(dǎo)引入Δcya-12和連接zid-62∷Tn10突變。選擇麥芽糖陰性，四環(huán)素抗性，氨芐青霉素抗性表型是在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml上進行的。氨芐青霉素-抗性(pSD110+)、四環(huán)素-抗性(zid-62∷Tn10)、Mal-(Δcya)菌落挑選出并在MacConkey瓊脂+1%麥芽糖+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml上純化。純化過的菌落放入Luria液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至混濁后驗證菌株完全LPS、Vi抗原和精氨酸、半胱氨酸和色氨酸的營養(yǎng)缺陷，正確表型的分離株稱為X3919(Ty2)和X4340(ISP1820)，它們具有基因型Δcrp-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10。X3919和X4340的培養(yǎng)物在L液體培養(yǎng)基+100μg氨芐青霉素/ml+12.5μg四環(huán)素/ml內(nèi)生長至混濁，用BSG按1∶10稀釋，并將每種培養(yǎng)物100μl的樣品涂布于含鐮孢菌酸的培養(yǎng)基上，再于37℃下保溫大約36小時。挑出每種菌株的鐮孢菌酸-抗性菌落并于FA培養(yǎng)基上純化。純化后的FA-抗性菌落挑出放入Luria液體培養(yǎng)基中，生長至混濁后再驗證Tn10的缺失(四環(huán)素敏感性)、完全LPB、Vi抗原和對精氨酸、半胱氨酸和色氨酸的營養(yǎng)缺陷型。pSD110質(zhì)粒在菌株生長期在缺乏氨芐青霉素的條件下自然喪失。最終的氨芐青霉素敏感的且無質(zhì)粒的菌株稱為X3924(Ty2)和X4345(ISP1820)，它們具有基因型Δcrp-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕。由于具有能動表現(xiàn)的鞭毛合成，部份取決于功能性cya和crp基因以及由于鞭毛是重要的抗原，所以我們選擇具有抑制基因突變(cfs)(它允許鞭毛合成并且功能與cya和crp基因功能無關(guān))的X3924和X4346的衍生物。X4073被挑選作為X3924的鞭毛陽性衍生物，而X4346作為X4345的鞭毛陽性衍生物被挑選出來。表10列出野生型親代菌株及其Δcya Δcrp衍生物。
通過下列表型的特征，菌株X4073和X4346很容易與其野生型親代菌株區(qū)分，不能在碳源麥芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、蜜二糖和木糖中發(fā)酵或生長，不能產(chǎn)生H2S，增長了生殖時間和顯著提高鼠類LD50值。
表10細(xì)菌菌株X3769，S.typhi Ty2E1型，野生型，Vi+從華盛頓，哥倫比亞特區(qū)(DC)，L.Baron，Walter Reed Army 研究所作為Ty2得到的。
X4073S.typhi Ty2Δcrp-10〔Zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔Zid-62∷Tn10〕;X3769的Crp-Cdt-cya-Arg-衍生物。
X3744S.typhi ISP182046型，野生型，Vi+從巴爾的摩，MD，M.Levine，疫苗發(fā)展中心，作為ISP1820得到的，來源于智利病人1983分離株。
X4346S.typhi ISP1820Δcrp-10 Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔Zid-62∷Tn10〕;X3744的crp-cdt-Cya-Arg-衍生物。
X3744、X3769、X4073和X4346的生長條件將每種菌株的細(xì)胞從瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)挑出放入2ml Luria液體培養(yǎng)基內(nèi)。按靜止培養(yǎng)于37℃保溫約14小時。當(dāng)培養(yǎng)物能看出混濁時(OD600≥0.5)，將每種培養(yǎng)物的全環(huán)劃上線在表11所列的培養(yǎng)基上分離菌落以驗證某些表型。也檢測培養(yǎng)物對噬菌體的敏感性、抗菌素的敏感度、產(chǎn)生野生型LPS的能力、營養(yǎng)缺陷、能動性、產(chǎn)生大腸桿菌素的無能、質(zhì)粒DNA的缺失、平均生殖時間以及通過抗血清的凝集作用鑒定傷寒沙門菌的O、H和Vi抗原(見表11)就Δcya Δcrp菌株X4346和X4073生長明顯比其親代野生型慢這點來說，所有菌株的表型性質(zhì)正如所予料的。
表11傷寒沙門氏菌野生型和Δcrp-10 Δcya-12菌株的表型特征表型MacConkey 基質(zhì)瓊脂+X3744X4346X3769X40731%麥芽糖 + - + -1%山梨糖醇 + - + -1%甘露糖醇 + - + -1%蜜二糖 + - + -1%鼠李糖 - - - -1%檸檬酸 - - - -1%阿拉伯糖 - - - -1%甘露糖 + + + +1%木糖 + - + -1%葡萄糖 + + + +基本瓊脂a+0.5%葡萄糖 + + + +0.5山梨糖醇 + - + -0.5%甘露糖醇 + - + -0.5%蜜二糖 + - + -
表11(續(xù))傷寒沙門氏菌野生型和Δcrp-10 Δcya-12菌株的表型特征表型MacConkey基質(zhì)瓊脂+X3744X4346X3769X40730.5%鼠李糖 - - - -0.5%檸檬酸 - - - -0.5%阿拉伯糖 - - - -0.5%甘露糖 + + + +0.5木糖 + - + -a基本培養(yǎng)基配方已附上過;補充物包括L-精氨酸HCl 22μg/ml，L-半胱氨酸HCl 22μg/ml，L-色氨酸20μg/ml。
表11(續(xù))表型X3744X4346X3769X4073三倍糖鐵培養(yǎng)基-H2S + - + -產(chǎn)生堿性斜面培養(yǎng)- Lac-Lac-Lac-Lac-Glu+Glu+Glu+Glu+Suc-Suc-Suc-Suc-吲哚發(fā)酵檢驗 - - - -噬菌體敏感性cViⅡ S S S SFelix-O S S S Sp22HTint S S S SPiL4R R R RL R R R RKB1 R R R R通過SDE-PAGE(銀 完全 完全 完全 完全染色)的LPB外形(comp.
=Complete)能動性d+ + + +大腸桿菌素產(chǎn)生 - - - -c 噬菌體敏感性的檢驗是按軟瓊脂涂復(fù)技術(shù)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)進行的。S＝敏感的;R＝抗性的。
d 能動性的測定是通過將靜止過夜的Luria液體培養(yǎng)物的菌環(huán)穿刺放入含1.0%酪蛋白、0.5%NaCl、0.5%Difco瓊脂和50μg/ml三苯基-四唑嗡氯化物的培養(yǎng)基;于37℃下保溫并于24小時和48小時記錄能動性。
表11(續(xù))表征X3744X4346X3769X4073MGTe26.6 36.5 24.3 34.5質(zhì)粒含量 無 無 無 無營養(yǎng)缺陷型 Cys-Cys-Cys-Cys-Trp-Trp-Trp-Trp-Arg+Arg+Arg+Arg+MICf四環(huán)素 4 4 ＜2 4鏈霉 素 6464168氨芐青霉素 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2慶大霉素 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2氯霉素 4 4 4 4新霉素 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2利福平 8 16 8 8萘啶酮酸＜2 4 ＜2 4放線壯觀素 32 32 32 16卡那霉素 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2
e 平均生殖時間(分)＝37℃下用通氣法(150rpm新型Srunswick平板式搖動器)在Luria液體培養(yǎng)基中測定。
f.抗菌素標(biāo)準(zhǔn)抑制濃度(μg/ml)的測定是在含規(guī)定濃度的抗菌素瓊脂上，通過將每種菌株劃線靜止過夜培養(yǎng)。
表11(續(xù))表型X3744X4345X3769X4073以Difco抗血精凝集鞭毛抗原H∶1 + + + +鞭毛抗原H∶2 + + + +群D因子9 + + + +群D因子12 + + + +群D(O-1，9.12) + + + +瓊脂培養(yǎng)基上的生長特征菌株于37℃下按靜止過夜培養(yǎng)在Luria液體培養(yǎng)基內(nèi)生長，稀釋于緩沖的生理鹽水和明膠(BSG)內(nèi)并涂布于含1%麥芽糖的MacConkey瓊脂培養(yǎng)基上以達到形成離體菌落單位(cfu)。所有給定菌株的菌落在其大小和顏色方面表現(xiàn)出是均勻的。由于ΔcyaΔcrp菌株生長速度與其野生型親代相比較慢，需在37℃的MacConkey培養(yǎng)基上生長～36+小時才可以看見X4073和X4366的菌落。
突變體表型的穩(wěn)定性X4073和X4346濃縮50倍的培養(yǎng)物和各種稀度(-109、107、105、103cfu/平板)的培養(yǎng)物涂布于含0.5%麥芽糖、蜜二糖、木糖、甘油糖或鼠李糖之一(不助其生長的)的基本瓊脂培養(yǎng)基上(補充以22μg L-精氨酸/ml，22μg L-半胱氨酸/ml和20μg L-色氨酸/ml)。一套復(fù)制平板置于UV-照射之下(5焦耳/米2/秒)并在黑暗中于37℃下保溫。另外一套用照明于37℃下保溫。48小時生長期之后未檢測出回復(fù)突變體和/或突變體。
菌株的儲存每種菌株維持在1%胨-5%甘油懸浮液態(tài)并于-70℃下儲存。
動物實驗接種物的制備下面是生長用的標(biāo)準(zhǔn)原始細(xì)胞(protocol)和小鼠腹腔(i.P.)接種用的各疫苗菌株及其親代的懸浮液。
雌性CFM小鼠(18-20g)(charles River，Wilmington，MA)用于測定野生型傷寒沙門氏菌的LD50值和Δcrp-10 Δcya-12衍生物的毒性。靜置過夜培養(yǎng)(37℃)用予熱的Luria液體培養(yǎng)基以1∶20的比例稀釋，并于37℃下通氣(150rpm)至到OD600≤0.08。野生型和Δcrp-10 Δcya-12傷寒沙門氏菌細(xì)胞懸浮于15%(wt/vol)的豬胃粘蛋白中(American Laboratories，Omaha，NB)15%粘蛋白懸浮液按如下方法配制，中和至PH7，于15p.s.i下120°F高壓滅菌10分鐘，在添加適當(dāng)稀釋過的傷寒沙門菌細(xì)胞之前，還要加入3μg新制備的消毒檸檬鐵銨/ml(Sigma，St.Louis，MO)。然后，用23計量針將細(xì)胞懸浮液500μl對小鼠腹腔給藥。記錄72小時內(nèi)的死亡率數(shù)據(jù)后，測定野生型親代和Δcrp-10 Δcya-12衍生物的LD50值。相對于野生型親代傷寒沙門氏菌突變體的毒性結(jié)果見表12。
表12ISP1820和Ty2傷寒沙門氏菌野生型和Δcrp-11 Δcrp-10菌株的毒性菌株號基因型 LD150CFUX3744ISP1820野生型 32X4200Δcrp-11Δ〔Zhx-1431∷Tn10〕 600X4300Δcrp-11Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕/107pSD110+2X4323Δcrp-11Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 ＞2.8×103Δcya-12Δ〔Zid-62∷Tn10〕X4325Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 ＞3.2×106X4331Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕/＞2.3×105pSD110+X4346Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 4.4×105Δcya-12Δ〔Zid-62∷Tn10〕X3769Ty2野生型 54X3878ΔcrP-11Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 1.0×103X3880Δcrp-11Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕/＜19pSD110+X3927Δcrp-11Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 1.1×104Δcya-12Δ〔Zid-62∷Tn10〕X3803Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 1.5×105
表12(續(xù))ISP1820和Ty2傷寒沙門氏菌野生型和Δcrp-11 Δcrp-10菌株的毒性菌株號基因型 LD150CFUX3824Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕/＞1.9×106pSD110+X4073Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 ＞1.0×105Δcya-12Δ〔Zid-62∷Tn10〕1按Reed和Muench法(1938.Am.J.Hyg.21493-497)的方法計算LD50，收集72小時期間的發(fā)病率和死亡率。
2pSD110(Schroeder，C.J.，和W.J.Dobrogosz.1986，J.Bacteriol.167616-622)是一種pBR322的衍生物，它含有野生型crp+基因及來自鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)的啟動子。予先毒性檢驗表明該質(zhì)粒能補充豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)和傷寒沙門氏菌(S.typhi)中的crp突變并恢復(fù)野生型的毒性水平。
哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的粘附和侵入檢驗Δcrp-10 Δcya-12和Δcrp-11 Δcya-12菌株粘附和侵入CHO細(xì)胞的能力與野生型親代菌株對比數(shù)據(jù)列于表13。傷寒沙門氏菌突變體與野生型親代菌株相比，在37℃下分別于2小時和4小時間隔范圍內(nèi)粘附和/或侵入CHO細(xì)胞的單層能力下降。
與野生型親代相比突變體在正常人血清內(nèi)的生長和持久性完成正常人血清中的生長曲線，該血清予先吸附有野生型傷寒沙門氏菌，每ml的血清中加入大約106cfu的傷寒沙門氏菌Δcya Δcrp和野生型菌株，該血清已在5%CO2侖內(nèi)于37℃下以HEPES平衡過。補體介導(dǎo)溶菌作用的活性由在60℃下，10分鐘時間失活血清證實，60分鐘后驗證大腸桿菌K-12的生長。在正常的血清中，大腸桿菌K-12細(xì)胞60分鐘后死去。
更具體說來，X3744(ISP1820野生型)，X3769(Ty2野生型)、X4073(Ty2 Δcya-12 Δ〔crp-cysG〕-10)、X4346(ISP1829 Δcya-12 Δ〔crp-cysG〕-10)和X289(E.coli K-12)于37℃，在Luria液體培養(yǎng)基內(nèi)靜止過夜培養(yǎng)生長。人血清分別以同源的野生型傷寒沙門氏菌Ty2和ISP1820菌株X3769和X3744吸附，用20mM HEPES緩沖，再于5個大氣壓的CO2中保溫以供檢測。大腸桿菌K-12X289菌株表示補體介導(dǎo)溶菌作用的陽性對照，而同種菌株當(dāng)在加熱失活血清內(nèi)生長時則作為陰性對照(因其凈生長明顯)。
圖5表示各菌株在24小時的范圍內(nèi)于37℃下的凈生長和/或持久性。
菌株的寄存下面所列材料是按布達佩斯條約的條款寄存，寄存單位為美國典型培養(yǎng)物收集中心(馬里蘭州，Rockville.Parklawn Drive 12301)。所示登記號是完成存活試驗同時交付所需費用后給定的。在專利申請未決期間按規(guī)定條款37CFR1、14和35USC122，由被授權(quán)的行政管理官員批準(zhǔn)，人們可以得到所述培養(yǎng)物。一旦根據(jù)該申請授與專利權(quán)后，公眾獲得所述培養(yǎng)物的一切限制，將不可改變地撤消。而且指定寄存物自寄存之日起可維持30年，或者距最后一個索取者5年之后，或者按該美國專利的實施年限定(以其中時間較長者計)。如果一種培養(yǎng)物變得不能再生存，或由于疏忽而被毀壞，或當(dāng)菌株含質(zhì)粒時，而質(zhì)粒失去，則將允許用分類學(xué)上同一種類的存活培養(yǎng)物來代替。本文提到的寄存物只為方便，并不要求根據(jù)本文的描述，去實施本發(fā)明，另外，這些物質(zhì)作為參考編入本文。
菌株 寄存日期 ATCC No.
X39581990.11.2 55224X43231990.11.2 55115X39261990.11.2 55112X39271990.11.2 55117X42971990.11.2 55111X43461990.11.2 55113X39401990.11.2 55119X40731990.11.2 55118ISP2822 1990.11.2 55114ISP1820 1990.11.2 55116X44171991.11.6 55249X44351991.11.6 55250X40731991.11.6 55248(X4073是復(fù)制培養(yǎng))
工業(yè)利用本發(fā)明提供的菌株直間和間接適用于生產(chǎn)致免疫組合物，包括疫苗、予防由傷寒沙門氏菌和其它腸細(xì)菌(這些細(xì)菌與對傷寒沙門菌的抗體交叉反應(yīng))引起的疫病。這些菌株也可用作載體微生物，用于生產(chǎn)在細(xì)菌細(xì)胞中于重組基因上編碼的表達產(chǎn)物。另外，借助于安全性提高，這些菌株適于生產(chǎn)抗體、單克隆和多克隆，以抗傷寒沙門氏菌以及在無毒傷寒沙門氏菌中表達的抗原。
權(quán)利要求
1.一種適于個體免疫接種的致免疫組合物，包含傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)的無毒衍生物，所述衍生物的cya基因含有一突變，所述組合物在一種生理上允許的賦形劑中。
2.按照權(quán)利要求1的致免疫組合物，其中無毒衍生物能表達重組基因，該基因是由對所述個體致病的因子衍生出來的以產(chǎn)生能在，所述脊椎動物門中誘導(dǎo)出抗所述病原體的免疫應(yīng)答的抗原。
3.一種刺激免疫系統(tǒng)對傷寒沙門氏菌(S.typhi)致免疫抗原產(chǎn)生應(yīng)答的方法，包括向所述個體施用權(quán)利要求1的疫苗。
4.一種刺激免疫系統(tǒng)對病原體致免疫抗原產(chǎn)生應(yīng)答的方法，包含向所述個體施用權(quán)利要求2的疫苗。
5.一種傷寒沙門氏菌(S.typhi)分離無毒菌株包含在cya基因中的突變。
6.權(quán)利要求5的傷寒沙門氏菌(S.typhi)分離無毒菌株，能表達重組基因，該基因是由對所述個體致病的因子衍生出來的，以產(chǎn)生能在所述脊椎動物門對所述病原體誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原。
7.按權(quán)利要求6的菌株，其中傷寒沙門氏菌(S.typhi)含有的染色體突變是致死的，由補充致死突變的載體基因所平衡，以構(gòu)成平衡致死寄主載體(balanced lethal host vector)系統(tǒng)。
8.按權(quán)利要求7的菌株，其中菌株的細(xì)胞a)缺少編碼β一天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的功能性天然染色體基因;b)已存在編碼功能性Asd多肽的重組基因，該多肽補充染色體asd突變，但它不能通過重組替代有缺陷的染色體基因;(c)編碼功能性Asd多肽的重組基因和致免疫抗原間具有物理連接，當(dāng)細(xì)胞所在環(huán)境中，因功能性Asd缺失引起細(xì)胞溶解時，其中編碼功能性Asd多肽的重組基因的缺失也能引起細(xì)胞溶解。
9.一種個體免疫接種的致免疫組合物含傷寒沙門氏菌(S.typhi)無毒的衍生物，該衍生物包含在crp基因中的突變。
10.按權(quán)利要求9個體免疫接種的致免疫組合物，其中所述無毒衍生物能表達重組基因，該基因是由對所述個體是致病的因子衍生出來的，以產(chǎn)生在所述脊椎動物門中對所述病原體能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原。
11.一種刺激免疫系統(tǒng)對傷寒沙門氏菌(S.typhi)的致免疫抗原產(chǎn)生應(yīng)答的方法，包括向所述個體施用權(quán)利要求9的致免疫組合物。
12.一種刺激免疫系統(tǒng)對病原體的致免疫抗體產(chǎn)生應(yīng)答的方法包括向所述個體施用權(quán)利要求10的致免疫組合物。
13.一種傷寒沙門氏菌(S.typhi)的分離無毒菌株包含在crp基因中的突變。
14.一種權(quán)利要求13的傷寒沙門氏菌(S.typhi)的分離無毒菌株能表達重組基因，該基因是由對所述個體是致病的因子衍生出來的，以產(chǎn)生在所述脊椎動物門中對所述病原體能誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答的抗原。
15.按權(quán)利要求14的菌株，其中傷寒沙門氏菌(S.typhi)含有的染色體突變是致死的，由補充致死突變的載體基因所平衡，以構(gòu)成平衡-致死寄主-載體(balanced-lethal host-Vector)系統(tǒng)。
16.按權(quán)利要求15的菌株，其中菌株的細(xì)胞(a)缺少編碼β-天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的功能性天然染色體基因;(b)已存在編碼功能性Asd多肽的重組基因該多肽補充染色體asd突變，但是它不能通過重組替代有缺陷的染色體基因;(c)在編碼功能性Asd多肽的重組基因和致免疫基因之間具有物理連接，當(dāng)細(xì)胞所在環(huán)境中因功能性Asd缺失引起細(xì)菌溶解時，其中編碼功能性Asd多肽的重組基因缺失，也能引起細(xì)胞溶解。
17.一種個體免疫接種的致免疫組合物包含傷寒沙門氏菌(S.typhi)無毒衍生物，所述衍生物在cya基因中含有突變而在crp基因中也含有突變。
18.按權(quán)利要求17的致免疫組合物，其中所述無毒衍生物能表達重組基因，所述基因是由對所述個體致病的因子衍生出來的，以產(chǎn)生在所述脊椎動物門中對所述病原體能誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答的抗原。
19.一種刺激免疫系統(tǒng)對傷寒沙門氏菌(S.typhi)致免疫抗原應(yīng)答的方法包括向所述個體施用權(quán)利要求17的致免疫組合物。
20.一種刺激免疫系統(tǒng)對病原體致免疫抗原產(chǎn)生應(yīng)答的方法包括向所述個體施用權(quán)利要求18的致免疫組合物。
21.一種傷寒沙門氏菌(S.typhi)的分離無毒菌株，包含在cya基因和crp基因中的突變。
22.權(quán)利要求21的傷寒沙門氏菌(S.typhi)分離的無毒菌株，能表達重組基因，所述基因是由對所述個體致病的因子衍生出來的，以產(chǎn)生在所述脊椎動物門中對所述病原體能誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答的抗原。
23.一種按權(quán)利要求22的菌株，其中傷寒沙門氏菌(S.typhi)含有的染色體突變是致死的，為補充致死突變的載體基因所平衡，從而構(gòu)成平衡-致死寄主-載體(balanced-lethal host-Vector)系統(tǒng)。
24.一種按權(quán)利要求23的菌株，其中菌株的細(xì)胞a)缺少編碼β-天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的功能性天然染色體基因;b)已存在編碼功能性Asd多肽的重組基因，該多肽能補充染色體asd突變，但它不能通過重組替代有缺陷的染色體基因;c)在編碼功能性Asd多肽的重組基因和致免疫抗原之間有物理連接，當(dāng)細(xì)胞所在的環(huán)境中因功能性Asd缺失引起細(xì)胞溶解時，其中編碼功能性Asd多肽的重組基因的缺失也能引起細(xì)胞溶解。
25.一種個體免疫接種的致免疫組合物包含沙門氏菌屬(Salmonella)無毒衍生物，該衍生物含在cdt基因中的突變。
26.一種按權(quán)利要求25的個體免疫接種的致免疫組合物，其中所述無毒衍生物能表達重組基因，所述基因是由對所述個體致病的因子衍生出來的，以產(chǎn)生能在所述脊椎動物門中對所述病原體誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答的抗原。
27.一種刺激個體免疫系統(tǒng)對沙門氏菌屬(Salmonella)的致免疫抗原產(chǎn)生應(yīng)答的方法，包括向所述個體施用權(quán)利要求25的致免疫組合物。
28.一種刺激免疫系統(tǒng)對病原體致免疫抗原產(chǎn)生應(yīng)答的方法，包括對所述個體施用權(quán)利要求26的致免疫組合物。
29.一種沙門氏菌屬(Salmonella)的分離無毒菌株包含在cdt基因中的突變。
30.權(quán)利要求29的沙門氏菌屬(Salmonella)的分離無毒菌株能表達重組基因，該基因是由對所述個體致病的因子衍生出來的，產(chǎn)生在所述脊椎動物門內(nèi)對所述病原體能誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答的抗原。
31.一種按權(quán)利要求30的菌株，其中沙門氏菌屬(Salmonella)含有的染色體突變是致死的，為補充致死的突變的載體基因所平衡，從而構(gòu)成平衡-致死寄主-載體系統(tǒng)。
32.一種按權(quán)利要求30的菌株，其中菌株的細(xì)胞a)缺少編碼β-天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的功能性天然染色體基因;b)已存在編碼功能性Asd多肽的重組基因，該多肽補充染色asd突變，但它不能通過重組替代有缺陷的染色體基因;c)在編碼功能性Asd多肽的重組基因和致免疫抗原之間有物理連接，其中當(dāng)細(xì)胞所在環(huán)境中因功能性Asd缺乏引起細(xì)胞溶解時，編碼功能性Asd多肽的重組基因的缺乏也能引起細(xì)胞溶解。
33.按權(quán)利要求25的致免疫組合物，其中無毒衍生物有crp基因中的突變。
34.按權(quán)利要求25的致免疫組合物，其中無毒衍生物有cya基因中的突變。
35.按權(quán)利要求33的致免疫組合物，其中無毒衍生物也有cya基因內(nèi)的突變。
36.按權(quán)利要求29的沙門氏菌屬的分離無毒菌株，它包含選自cya和crp基因中的一個基因的突變。
37.按權(quán)利要求29的沙門氏菌屬(Salmonella)的分離無毒菌株，它含有在cya基因和crp基因中的突變。
38.一種致免疫組合物含有權(quán)利要求37的菌株和藥理上允許的賦形劑。
39.一種分離菌株選自菌株X3958、X4323、X3926、X3927、X4297、X4346、X3940、X4073、X4417和X4435組成的一組及其衍生物。
40.一種含在cya基因中的突變的無毒傷寒沙門氏菌(S.typhi)的菌株的使用方法，該法包括通過懸浮菌株于生理上允許的賦形劑來制備致免疫組合物。
41.一種含在crp基因內(nèi)的突變的無毒傷寒沙門氏菌(S.typhi)的菌株的使用方法，該法包括通過懸浮菌株于生理上允許的賦形劑來制備致免疫組合物。
42.一種含在cdt基因中的突變的無毒沙門氏菌屬(Salmonella)的菌株利用方法，該法包括通過懸浮菌株于生理上允許的賦形劑來制備致免疫組合物。
43.一種按照權(quán)利要求41的方法，其中菌株還含有在cya基因中的突變。
44.一種按照權(quán)利要求43的方法，其中菌株還含有在cdt基因中的突變。
45.一種傷寒沙門氏菌(S.typhi)的分離菌株，它是一種cdt突變體。
全文摘要
本發(fā)明提供具有傷寒沙門氏菌(S、typhi)無毒衍生物的對脊椎動物門和非脊椎動物門免疫接種的致免疫組合物。該衍生物具有cya和/或crp和/或cdt基因的一種突變。本發(fā)明還提供具有上述類型無毒衍生物的對脊椎動物和非脊椎動物免疫接種用的致免疫組合物。所述類型衍生物能表達一種重組基因，該重組基因來源于所說脊椎動物或非脊椎動物個體的病原體，對所述病原體能誘發(fā)出免疫應(yīng)答的抗原。本發(fā)明的其它實施方案包括由這些菌株制備致免疫組合物的方法，和在制備致免疫組合物中有用的菌株，以及通過施用致免疫組合物刺激免疫系統(tǒng)以對傷寒沙門氏菌的致免疫抗原產(chǎn)生應(yīng)答的方法。
文檔編號C12N15/00GK1063416SQ9111187
公開日1992年8月12日 申請日期1991年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1990年11月9日
發(fā)明者柯蒂斯Ⅲ·羅伊, 凱利·桑德拉M 申請人:華盛頓大學(xué)