專利名稱：一種檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌的rt-lamp試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)涉及一種檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌的逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)試劑盒。
背景技術(shù)：
甲型副傷寒沙門菌(S. Paratyphi A)是引起甲型副傷寒的病原菌，甲型副傷寒與傷寒在臨床癥狀上非常相似，難以區(qū)分，均以急起高熱為主要癥狀，是一種急性全身系統(tǒng)性傳染病。該病傳染性強(qiáng)，病程長(zhǎng)，可反復(fù)發(fā)作，患者需住院隔離治療，是我國(guó)《傳染病防治法》中規(guī)定報(bào)告的乙類傳染病之一，也是全球特別是發(fā)展中國(guó)家共同面臨的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前，甲型副傷寒沙門菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法為血分離培養(yǎng)及血清學(xué)診斷。血分離培 養(yǎng)需時(shí)較長(zhǎng)，約3-5天，且檢出率易受病程，采血量及患者是否服用抗生素等因素的影響，難以達(dá)到快速的要求；血清學(xué)診斷存在特異性、準(zhǔn)確性差的問(wèn)題，臨床上，單憑癥狀難以區(qū)分傷寒和副傷寒。因此有必要開(kāi)發(fā)靈敏的早期檢測(cè)方法。目前，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用和病原體本身耐藥、變異等諸多因素的影響，近年甲型副傷寒的復(fù)發(fā)率增高，臨床表現(xiàn)很不典型，給早期臨床診斷和治療帶來(lái)很大的困難。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前已有多種PCR方法用于甲型副傷寒沙門菌的檢測(cè)，雖在靈敏度方面有所改進(jìn)，但由于需要精密儀器的配套使用，同樣也無(wú)法滿足基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisotherm amplification,LAMP)是由Notomi于2000年開(kāi)發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和兩對(duì)特殊的引物,特異地識(shí)別祀序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域,在等溫條件下(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。近年來(lái)，國(guó)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)。Hong TC等人(2004)根據(jù)LAMP的原理設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)定量RT-LAMP方法，以快速檢測(cè)SARS-CoV，結(jié)果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(2007)建立了快速診斷H5N1禽流感病毒的RT-LAMP檢測(cè)體系。LAMP還可以檢測(cè)細(xì)菌、真菌等病原微生物，其靈敏度和特異性都有很好的體驗(yàn)。但目前尚未見(jiàn)該方法在甲型副傷寒沙門菌檢測(cè)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌(S. Paratyphi A)的特異性RT-LAMP引物組。本發(fā)明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、操作簡(jiǎn)單的LAMP檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過(guò)對(duì)分離到的48株甲型副傷寒沙門菌hsdM基因和NCBI已報(bào)道的hsdM基因序列比對(duì)，通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行序列同源性分析，找到特異性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 7所示。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，該序列的特異性片段也可以作為檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌的靶序列。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供用于特異性擴(kuò)增上述靶序列的引物組合。本發(fā)明提供用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌的特異性RT-LAMP引物組合，包括以下6條引物F3 :5’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’ ；
B3 :5， -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3，；FIP :5’ -CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’ ；RIP :5’ -A ACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3，；LF :5，-TGAGGTTGGATTCCAT-3，LB :5，-ATTGAGTGGGTTAACAAA-3’本發(fā)明提供了上述引物組在制備甲型副傷寒沙門菌的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種含有上述6條引物的檢測(cè)試劑。本發(fā)明提供了一種含有上述6條引物的甲型副傷寒沙門菌的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的試劑盒還包含RT-LAMP反應(yīng)液，與RT-LAMP弓丨物共同構(gòu)成LAMP檢測(cè)體系；25 ii L RT-LAMP檢測(cè)體系的具體配置為10 y M的F3、B3各0. 25 y L ; 10 y M的FIP、BIP各 L ;10iiM 的 LF、LB 各 I ii L ;2X 反應(yīng)混合 buffer 12. L，其含 40mM Tris-HCl, pH
8.8,20mM KCl, 16mM MgS04，20mM(NH4)2S04，0. 2% Tween20，I. 6M甜菜堿和 2. 8mM dNTPs, I u I的Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合物，5uL的模板RNA。所述試劑盒的檢測(cè)反應(yīng)條件為65°C恒溫lh，然后終止反應(yīng)。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌(S. Paratyphi A)的方法，用上述6條引物進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，將比濁度> 0. I的擴(kuò)增結(jié)果判定為RT-LAMP反應(yīng)陽(yáng)性其中，RT-LAMP反應(yīng)條件為65°C恒溫Ih。結(jié)果判定方法為對(duì)于比濁度彡0. I的擴(kuò)增結(jié)果判定為RT-LAMP反應(yīng)陽(yáng)性。本發(fā)明的甲型副傷寒沙門菌的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒利用35個(gè)血清型的純培養(yǎng)甲型副傷寒和非傷寒沙門菌菌株、常見(jiàn)非沙門致腹瀉病原菌以及發(fā)熱為主要癥狀常見(jiàn)病原菌RNA評(píng)價(jià)該方法的特異性及敏感性，同時(shí)對(duì)甲型副傷寒沙門菌全血模擬標(biāo)本及糞便模擬標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)下限確定。結(jié)果顯示，利用該方法檢測(cè)48株甲型副傷寒沙門菌均陽(yáng)性，其余34種非傷寒沙門菌血清型、致腹瀉的其他5種腸道致病菌以及發(fā)熱為主要癥狀的8種常見(jiàn)非沙門菌均擴(kuò)增陰性，說(shuō)明該方法的特異性良好，達(dá)100%。在對(duì)純菌總RNA檢測(cè)中，RT-LAMP的最低檢測(cè)限為50pg/反應(yīng)，約為19000個(gè)拷貝/反應(yīng)。在以全血模擬樣品提取核酸為模板的檢測(cè)中，最低檢測(cè)限達(dá)80cfu/mL。對(duì)糞便模擬標(biāo)本的檢測(cè)中，對(duì)增菌前樣品即原始樣品檢測(cè)下限為500cfu/g ;增菌后樣品檢測(cè)下限為0. 8cfu/g，說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒具有很高的靈敏度。本發(fā)明RT-LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌整個(gè)試驗(yàn)只需要Ih左右即可，相對(duì)于常規(guī)PCR反應(yīng)要4 5h才能完成檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間；在特異性和重復(fù)性檢驗(yàn)中，該方法有很高的可靠性，并且操作簡(jiǎn)單。 利用發(fā)明的甲型副傷寒沙門菌RT-LAMP快速檢測(cè)試劑盒對(duì)甲型副傷寒沙門菌進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)到100%，在設(shè)計(jì)引物時(shí)候特別選取了甲型副傷寒沙門菌hsdM基因的保守區(qū)，所以該試劑盒可快速、靈敏地檢測(cè)出甲型副傷寒沙門菌，其操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及臨床標(biāo)本的檢測(cè)，易于大范圍推廣應(yīng)用。


圖I為不同引物濃度下RT-LAMP擴(kuò)增曲線圖；其中a F3和B3各5pmol, FIP和BIP 各 40pmol ；b F3 和 B3 各 5pmol，F(xiàn)IP 和 BIP 各 20pmol ；c F3 和 B3 各 IOpmol，F(xiàn)IP 和 BIP各 40pmol ；d F3 和 B3 各 10pmol，F(xiàn)IP 和 BIP 各 20pmol ；e :F3 和 B3 各 5pmol，F(xiàn)IP 和 BIP 各IOpmol ；NC :陰性對(duì)照。圖2為RT-LAMP檢測(cè)純菌RNA擴(kuò)增曲線圖；模板濃度分別為a 5000pg/反應(yīng)；b 500pg/反應(yīng)；c 50pg/反應(yīng)；d 5pg/反應(yīng)；e :0. 5pg反應(yīng)；NC :陰性對(duì)照。圖3為RT_LAMP檢測(cè)模擬血標(biāo)本擴(kuò)增曲線圖；模板濃度分別為a I. 6X 104cfu/ml ；b I. 6 X 103cfu/ml ；c I. 6 X 102cfu/ml ；d 8 X IO1CfuZml ；e 4 X IO1CfuZml ；f 2 X IO1CfuAil ；NC :陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明所用的菌種沙門菌屬菌株、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存，其中甲型副傷寒沙門菌48株，傷寒沙門菌、乙型和丙型副傷寒沙門菌以及其他31種非傷寒沙門菌血清型共57株(表I)，所有血清型均使用丹麥SSI (Statens SerumInstitut)沙門菌抗血清(購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行血清型鑒定。另外，其他腸道常見(jiàn)病原菌及引起發(fā)熱并可在血液標(biāo)本中分離到的肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、嗜肺軍團(tuán)菌、腦膜炎奈瑟菌、立克次體、布魯氏菌等菌株作為檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌的特異性及敏感性評(píng)價(jià)對(duì)比菌株，來(lái)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所。實(shí)施例I引物的設(shè)計(jì)I、特異性DNA序列查找從GenBank檢索獲得多株甲型副傷寒沙門菌基因組序列，通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行序列同源性分析找到hsdM因的特異性的保守靶序列進(jìn)行RT-LAMP引物設(shè)計(jì)，該特異性保守靶序列如SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列。2、引物的設(shè)計(jì)
針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)六條引物，包括兩條內(nèi)引物(FIP和BIP)和兩條外引物(F3和B3)和兩條環(huán)引物(LF和LB)，其核苷酸序列如下
F3 :5’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’ ；B3 :5， -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3，；FIP :5’ -CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’ ；BIP :5，-AACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3，；LF :5，-TGAGGTTGGATTCCAT-3，LB :5，-ATTGAGTGGGTTAACAAA-3’實(shí)施例2甲型副傷寒沙門菌RT-LAMP檢測(cè)方法的建立I、血模擬標(biāo)本的制備及RNA提取取新鮮培養(yǎng)4-6小時(shí)細(xì)菌(最終菌落計(jì)數(shù)為8. OX 108cfu/ml)，10倍梯度系列稀釋為IO6 IO1CfuAil,取各稀釋度菌液3. 3毫升分別與同體積新鮮人抗凝血混勻，室溫放置30分鐘后，作為全血模擬標(biāo)本。利用QIAamp UCP PurePathogen Blood fieldtestKit(QIAGEN公司)對(duì)上述模擬標(biāo)本進(jìn)行甲型副傷寒沙門菌RNA的提取，具體操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。同時(shí)以不加菌的血液作為陰性對(duì)照平行進(jìn)行RNA提取。最終提取的RNA溶解到50 ill不含RNase的無(wú)菌純水中，取其中5 作模板，進(jìn)行RT-LAMP。同時(shí)，取系列稀釋菌液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定模擬標(biāo)本中準(zhǔn)確細(xì)菌含量。2、糞便模擬標(biāo)本制備及RNA提取2. I取新鮮培養(yǎng)4-6小時(shí)細(xì)菌(最終菌落計(jì)數(shù)為8. OX 108cfu/ml)，梯度系列稀釋為IO4 10^5,1,0. 5,0. 25,0. 125cfu/ml。然后取以上菌液各500ul與3g健康人糞便混勻。2. 2 取 2. I 項(xiàng)中的混合樣品 0. 2g，加入 200ul TE(10mmol/LTris-HCl (pH 8.0)，lmmol/L EDTA’pH 8. 0)，蝸旋震蕩，IOOOrpm離心I分鐘,去掉沉淀,上清8000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用Iml TE重懸，震蕩，8000rpm 5分鐘，棄上清，保留沉淀，用IOOuITE懸菌，水煮10分鐘，8000rpm 5分鐘，保留上清，去沉淀。此上清為增菌前樣品粗提核酸。2. 3在2. I項(xiàng)中的樣品中各加入SC增菌液(亞硒酸鹽增菌液)5ml，混勻，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。第2天取增菌后樣品1ml，如步驟2. 2中，制備增菌后樣品核酸粗提品。3、純培養(yǎng)細(xì)菌RNA提取純菌RNA提取使用RNeasy Minikit (QIAGEN公司)，操作步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。4、RT-LAMP 反應(yīng)分別在不同的溫度(61°C至65°C)反應(yīng)lh，終止反應(yīng)，最終通過(guò)擴(kuò)增陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的時(shí)間，獲得最佳反應(yīng)參數(shù)。由于在65°C反應(yīng)Ih的條件下擴(kuò)增最快，優(yōu)選在此條件下進(jìn)行反應(yīng)。在65°C反應(yīng)Ih對(duì)不同濃度的內(nèi)外引物的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化反應(yīng)，通過(guò)擴(kuò)增陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的時(shí)間作為反應(yīng)的最終濃度，結(jié)果兩條外引物F3、B3濃度各為5pmoI，兩條內(nèi)引物FIP、BIP濃度各為40pmol的條件下，擴(kuò)增最快?？蓞⒁?jiàn)圖I。因此，得到優(yōu)化的檢測(cè)體系(25 U L)如下 IOuM 的 F3、B3 各 0. 25 y L ; 10 y M 的 FIP、BIP 各 L ;10iiM 的 LF、LB 各I U L ；2X 反應(yīng)混合 buffer 12. 5 y L，其含 40mM Tris-HCl, pH8. 8,20mM KCl, 16mM MgSO4,20mM(NH4)2SO4jO. 2% Tween20,1. 6M 甜菜堿和 2. 8mM dNTPs, I ii I 的 Bst DNA 聚合酶和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合物，5 u L的模板RNA I ii L酶，5 ii L模板檢測(cè)反應(yīng)條件65°C恒溫Ih,終止反應(yīng)。使用Loopamp RNA Amplification Kit (日本榮研公司)試劑進(jìn)行 RT-LAMP反應(yīng)體系的設(shè)立，總反應(yīng)體系為25 u I,其中2Xreaction mix buffer 12. 5 u I (含40mMTris-HCl [pH 8. 8], 20mM KCl, 16mMMgS04, 20mM (NH4) 2S04,0.2% Tween20，I. 6M 甜菜堿和
2.8mMdNTPs)，兩條外引物F3、B3各5pmol，兩條內(nèi)引物FIP、BIP各40pmol，兩條環(huán)引物各20pmol, I Ul的Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合物，5 U I的模板RNA。在日本榮研公司的Realtime Turbidimeter LA-320C儀器上進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)并記錄結(jié)果，本研究甲型副傷寒沙門菌RT-LAMP反應(yīng)條件為65°C，60分鐘，對(duì)于比濁度彡0. I的擴(kuò)增結(jié)果判定為RT-LAMP反應(yīng)陽(yáng)性。實(shí)施例3 RT-LAMP檢測(cè)試劑盒特性評(píng)價(jià)I、RT-LAMP擴(kuò)增特異性和敏感性利用本發(fā)明的試劑盒共進(jìn)行了 48種136株細(xì)菌的RT-LAMP檢測(cè)(見(jiàn)表I)，其中48株甲型副傷寒沙門菌均陽(yáng)性。沙門菌屬其他34種血清型均擴(kuò)增陰性。對(duì)其他常見(jiàn)腹瀉病原(霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀菌、致瀉性大腸埃希菌)亦擴(kuò)增陰性。而且，臨床其他常見(jiàn)發(fā)熱病原菌包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、嗜肺軍團(tuán)菌、腦膜炎奈瑟氏菌、立克次體、布魯氏菌均擴(kuò)增陰性，說(shuō)明本研究篩選到的RT-LAMP引物以及由這些引物組裝的檢測(cè)試劑盒具有較高的菌種和血清型特異性及敏感性，均達(dá)100%。表I甲型副傷寒沙門菌RT-LAMP特異性及敏感性檢
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌(s. Paratyphi A)的靶序列，其具有SEQ ID NO. 7所示的序列或其特異性片段。
2.用于擴(kuò)增權(quán)利要求2所述靶序列的特異性引物組合。
3.如權(quán)利要求2所述的引物組合，其為特異性RT-LAMP引物組，包括以下6條引物 F3 :5’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’ ；B3 :5’ -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’ ；FIP :5， -CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’ ；BIP :5’ -AACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3’ ；LF :5’ -TGAGGTTGGATTCCAT-3’ ；LB :5， -ATTGAGTGGGTTAACAAA-3，。
4.權(quán)利要求3所述的引物組合在制備甲型副傷寒沙門菌的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
5.一種含有權(quán)利要求3所述引物組合的檢測(cè)試劑。
6.一種含有權(quán)利要求3所述引物組合的甲型副傷寒沙門菌的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包含RT-LAMP反應(yīng)液，與RT-LAMP引物共同構(gòu)成LAMP檢測(cè)體系；25iiL RT-LAMP檢測(cè)體系的具體配置為10 y M的F3、B3各0. 25u L ;10iiM 的 FIP、BIP 各 L ; 10 y M 的 LF、LB 各 I y L ；2X 反應(yīng)混合 bufferl2. 5 y L，其含 40mM Tris-HCl，pH 8. 8,20mM KCl, 16mM MgSO4, 20mM(NH4) 2S04,0. 2% Tween20,1. 6M 菜堿和2. 8mM dNTPs, I yl的BstDNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合物，5u L的模板RNA。
8.—種檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌(S. Paratyphi A)的方法,其特征在于,用權(quán)利要求3所述的引物組進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，將比濁度彡0. I的擴(kuò)增結(jié)果判定為RT-LAMP反應(yīng)陽(yáng)性。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，RT-LAMP反應(yīng)條件為65°C恒溫lh。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌(S.Paratyphi A)的RT-LAMP試劑盒，所述試劑盒包含有六條RT-LAMP引物，與RT-LAMP反應(yīng)液一起構(gòu)成檢測(cè)體系，本發(fā)明的六條RT-LAMP引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-6所示。本發(fā)明的試劑盒可快速、靈敏地檢測(cè)目前流行的甲型副傷寒沙門菌，在對(duì)純菌總RNA檢測(cè)中，本發(fā)明試劑盒的最低檢測(cè)限為50pg/反應(yīng)。其操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及臨床標(biāo)本的檢測(cè)，易于大范圍推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102643901SQ20121009334
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者樊粉霞, 閆梅英, 闞飆 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所