專利名稱：非接觸式電導(dǎo)法實現(xiàn)pcr反應(yīng)過程的實時檢測系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非接觸式電導(dǎo)法實現(xiàn)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過程的實時檢測系統(tǒng)和方法，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)微芯片、非接觸式電導(dǎo)電化學(xué)檢測電極、高靈敏度讀出電路和分析方法等，屬電化學(xué)傳感技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
致病微生物的快速檢測和分析是食品安全、環(huán)境監(jiān)測、公共衛(wèi)生等領(lǐng)域迫切需求的技術(shù)，實時熒光定量PCR技術(shù)為微生物的檢測分析提供了有效的工具，該技術(shù)的主要優(yōu)點是在核酸的擴(kuò)增過程中對核酸進(jìn)行定量分析，從而縮短了常規(guī)終點檢測法所需要的時間。然而，目前所有的實時定量PCR均是基于光學(xué)檢測方法，需要進(jìn)行熒光標(biāo)記同時需要復(fù)雜和昂貴的光學(xué)檢測系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測，儀器構(gòu)造復(fù)雜，難以小型化，只適合在中心實驗室進(jìn)行，因此目前尚缺乏適合于現(xiàn)場微生物快速測定的手段和儀器。電化學(xué)檢測方法的原理是以脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的擴(kuò)增產(chǎn)物為敏感對象，電化學(xué)電極為信號轉(zhuǎn)換器，以電勢、電流或電導(dǎo)等為特征檢測信號，實現(xiàn)實時檢測PCR反應(yīng)過程。檢測的依據(jù)在于1)DNA的一些組分在一定電勢窗口下有電化學(xué)活性的 (例如鳥嘌呤)，可直接在電極表面實現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移；2)通過外部的一些氧化還原媒介(如亞甲基藍(lán)、Hoechst 33258、道諾霉素和棘霉素等)來實現(xiàn)電子傳遞，借助于這些與DNA選擇性結(jié)合的有電化學(xué)活性的指示劑來進(jìn)行雜交檢測。以納米金顆粒做標(biāo)記物不僅有更好的生物相容性，它的表面可以催化銀顆粒的沉積，增加了信噪比。近年來的電化學(xué)檢測法已經(jīng)達(dá)到了較高的靈敏度，如靈敏度達(dá)ng/uL級或用ssDNA探針標(biāo)記雜交甚至可以達(dá)到單分子檢測水平。相比較于熒光法的背景光干擾多，電化學(xué)法的背景噪聲較小，檢測效率較高。如上所述，電化學(xué)檢測具有靈敏度高、成本低、易于集成化、微型化等優(yōu)點，若能將電化學(xué)檢測方法與先進(jìn)的微機(jī)械加工技術(shù)相匹配，具有實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的潛力，因此采用電化學(xué)方法對PCR 過程進(jìn)行實時檢測，不僅能得到可與熒光定量PCR媲美的檢測結(jié)果，且電化學(xué)檢測所需的設(shè)備簡單，操作方便，可在條件簡陋的場合應(yīng)用且不需要專業(yè)人員操作。雖然片上的DNA擴(kuò)增分析的電化學(xué)技術(shù)已經(jīng)較成熟，目前文獻(xiàn)報道的電化學(xué)檢測實時PCR過程均采用接觸式電極直接測定，不管是用非標(biāo)記法還是標(biāo)記法，基于的原理都是檢測終產(chǎn)物在電極表面富集或引起電極表面離子濃度變化而引起電流或電阻抗的變化。 因此電極表面會有殘留物，它的二次檢測遠(yuǎn)達(dá)不到第一次檢測時的性能。雖然可以在二次檢測前對電極進(jìn)行清洗處理，但是這樣的過程就復(fù)雜化了，且效果不能十分明顯。若使用一次性電極，則增加了檢測的成本和資源的浪費。接觸法檢測的優(yōu)點是分辨率較高，但是表面吸附易飽和，檢測范圍受限，易污染，復(fù)用性不高，使用壽命短。且電極加壓后對溶液中分子有電離水解作用，不利于敏感檢測。在使用標(biāo)記法的過程中，標(biāo)記物與目標(biāo)DNA雜交，其空間結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化，發(fā)生空間阻礙效應(yīng)，從而影響結(jié)合效率
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種非接觸式電導(dǎo)法實現(xiàn)PCR反應(yīng)過程的實時檢測系統(tǒng)和方法，本發(fā)明的特征是用非傳統(tǒng)的非接觸式電導(dǎo)檢測方法(capacitively-coupled, contactless conductivity detection, C4D)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的接觸式電化學(xué)方法,實現(xiàn)集成芯片上的PCR過程的實時檢測系統(tǒng)。非接觸式方法因為電極不與電解液直接接觸，大大小減小了背景噪聲，可以達(dá)到更小的檢測限。另外也無直接接觸導(dǎo)致的電極表面產(chǎn)生氣泡的問題。易集成，且電極和溶液都不易被污染，電極的復(fù)用性很高。目前文獻(xiàn)報道應(yīng)用于電泳芯片的非接觸式電極系統(tǒng)可達(dá)的檢測限在5X 10_8和1X10_7M之間。本發(fā)明是將非接觸式概念引入到集成的PCR擴(kuò)增及檢測芯片中，不僅大大簡化了 PCR擴(kuò)增的體系(無需標(biāo)記物和探針)，而且又提高了電極的使用壽命，由此減少了設(shè)備的成本。而且系統(tǒng)所需的設(shè)備都十分簡單，易集成，可在條件簡陋的現(xiàn)場使用及便攜式應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下措施來達(dá)到基于微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)設(shè)計制造PCR 微芯片，并集成非接觸式電導(dǎo)檢測器，設(shè)計制作微米級甚至納米級介電絕緣層，顯著提高電導(dǎo)檢測器的靈敏度；PCR微芯片同時集成溫度傳感電極和加熱電極，基于差分信號放大原理和溫度補(bǔ)償原理，顯著提高讀出電路的分辨率和抗干擾能力；工作電極采用的是叉指電極結(jié)構(gòu)，每根電極均作為工作電極，因此它感應(yīng)的總體信號要遠(yuǎn)大于單電極，具有更高的檢測靈敏度和分辨率；本發(fā)明采用實際樣本進(jìn)行分析和驗證所建立PCR反應(yīng)過程的非接觸式電導(dǎo)檢測方法。本發(fā)明提供了一種有效的檢測實時核酸擴(kuò)增過程的電化學(xué)檢測方法，通過該方法可以檢測待測核酸的初始濃度，且能在PC機(jī)上實時監(jiān)測核酸擴(kuò)增過程。用厚度為100 μ m 的蓋玻片作絕緣層做初步的實驗，在以純化的DNA水溶液為檢測對象的實驗中，只需10 μ L 的樣品體積，可達(dá)到O. Ipg/μ L的檢測下限和O. 5pg/yL的分辨率，且可區(qū)分單鏈或雙鏈 DNA (單鏈DNA的阻抗比雙鏈DNA大，同濃度雙鏈DNA產(chǎn)生的電壓差大于單鏈DNA)。隨著絕緣層厚度的減小和材料的優(yōu)化(納米級厚的氮化硅或二氧化硅)，該非接觸式檢測系統(tǒng)的靈敏度和分辨率預(yù)計可被改善到fg/ U L級以下。相應(yīng)地，fg/ μ L級水平的模板初始濃度的PCR反應(yīng)預(yù)計在溫度循環(huán)5min以內(nèi)即可定性檢測到明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物增加引起的電壓變化，非常快速有效。用已知的不同初始濃度的模板進(jìn)行一系列的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，記錄相同循環(huán)數(shù)內(nèi)產(chǎn)生的電壓差變化，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可作為定量PCR的依據(jù)。實現(xiàn)該方法的系統(tǒng)易控制，操作簡便，易集成，體積小，功耗小，成本低，檢測電極使用壽命長。實現(xiàn)該方法的集成系統(tǒng)因為體積小，可將多個反應(yīng)腔和控制系統(tǒng)做在同一個裝置上，實現(xiàn)高通量并行檢測多個樣本，且易便攜化，可在現(xiàn)場應(yīng)用，有非常廣的應(yīng)用范圍。所述實時檢測系統(tǒng)包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激勵電源、電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路、溫度傳感電路、加熱電路、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換接口 DAQ及上位的Labview控制中心；其中，交流激勵電源連接PCR微芯片中的電化學(xué)檢測電極；加熱控制電路連接PCR微芯片中的加熱電極；電化學(xué)檢測電極另一端則與電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路連接；溫度傳感電路連接PCR微芯片中的溫度傳感電極；溫度傳感電路、電流轉(zhuǎn)電壓放大電路又與模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換接口 DAQ連接，模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換接口 DAQ分別與上位機(jī)的Labview控制中心及加熱控制電路連接，所述的集成PCR微芯片集成了微反應(yīng)腔、溫度傳感電極和加熱電極以及電化學(xué)檢測電極，硅基底正面刻蝕微反應(yīng)腔，背面集成加熱電極和溫度傳感電極；電化學(xué)檢測電極為叉指電極，通過絕緣層與硅基底鍵合，與微反應(yīng)腔形成密閉結(jié)構(gòu)，通過控制硅基底背面的溫度傳感器電極和解熱電極實現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)所需的溫度循環(huán)。本發(fā)明提供的非接觸式電導(dǎo)檢測實時核酸擴(kuò)增過程的方法與傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增電化學(xué)檢測法具有以下特點I、本發(fā)明采用非接觸式電導(dǎo)檢測，避免了檢測電極和待測對象之間的相互污染， 無需電極清洗重生等復(fù)雜步驟，操作簡便，電極復(fù)用性高，使用壽命長，且檢測結(jié)果可靠性聞。2、本發(fā)明電化學(xué)檢測電極采用叉指電極作為工作電極，檢測效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通的單工作電極。叉指電極的工作性能由叉指長度、叉指間距、叉指數(shù)、有效工作面積等多種參數(shù)決定，通過多種方式的優(yōu)化都可再大大改進(jìn)叉指電極的檢測分辨率和靈敏度，升級方便。3、本發(fā)明采用等離子體增強(qiáng)化學(xué)汽相沉積(PECVD)技術(shù)濺射二氧化硅或氮化硅薄膜代替?zhèn)鹘y(tǒng)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料和普通玻片來作電極的電介質(zhì)層和絕緣層， 既可起到隔離作用，又可使溶液和電極非常接近，減小絕緣層本身對電化學(xué)電導(dǎo)的貢獻(xiàn)，以提高靈敏度和分辨率，同時材料表面特性更適合PCR擴(kuò)增過程。4、本發(fā)明的單個反應(yīng)集成系統(tǒng)體積小、功耗小，將多個反應(yīng)腔和控制系統(tǒng)集成，可同時擴(kuò)增檢測多個DNA樣品，縮短檢測分析的時間，提高了檢測的信息通量。5、本發(fā)明的實現(xiàn)可采用微型化的電源和電路裝置，結(jié)構(gòu)簡單，功耗低，電壓要求低，是一種便攜化檢測分析設(shè)備。6、本發(fā)明所述的溫度控制系統(tǒng)采用Labview完成，測溫電極的電阻信號轉(zhuǎn)換成電壓信號經(jīng)放大，該電壓信號通過數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換成為數(shù)字電壓信號，并由Labivew 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析生成反饋信號，經(jīng)由數(shù)據(jù)卡的D/A功能輸出電壓控制加熱電極溫度的上升或下降。反饋信號可采用PID運算控制等算法，可提高溫度控制的準(zhǔn)確性和智能化。7、本發(fā)明采用同時具有數(shù)模轉(zhuǎn)換和模數(shù)轉(zhuǎn)換功能的多功能數(shù)據(jù)卡，將電導(dǎo)信號、 溫度信號和溫度反饋信號與PC機(jī)的通訊集成在一起，簡化整個系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。8、本發(fā)明由于采用了微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)制造微反應(yīng)室、加熱電極、溫度傳感器和非接觸式電導(dǎo)檢測器，其溫度控制裝置結(jié)構(gòu)和溫度控制程序簡單，擴(kuò)增反應(yīng)迅速，電導(dǎo)檢測分辨率和靈敏度高，并且可由PC機(jī)控制軟件實現(xiàn)了整個反應(yīng)過程的程序化、智能化， 圖形化操作界面友好便于人機(jī)對話。


圖I.本發(fā)明的系統(tǒng)設(shè)計結(jié)構(gòu)示意圖。圖2.微集成芯片的結(jié)構(gòu)圖。其中，(A)PCR微芯片的截面示意圖；(B)反應(yīng)腔體結(jié)構(gòu)；(C)集成的溫度傳感器電極加熱電極結(jié)構(gòu)；(D)CD4用的叉指電極結(jié)構(gòu)。圖3.本發(fā)明中的信號轉(zhuǎn)換和調(diào)理電路。㈧溫度信號轉(zhuǎn)換及放大電路，Rsensor為溫度傳感器的電阻，Vsensor為溫度信號轉(zhuǎn)化并放大后的電壓信號，該端直接與DAQ的模數(shù)轉(zhuǎn)換輸入口相連；⑶芯片加熱控制電路，中間矩形框為電壓調(diào)節(jié)器芯片，Vlfeatw為直接加載在加熱電極兩端的加熱電壓，V_tMl為控制電壓調(diào)節(jié)器芯片電壓開斷的信號，與DAQ的數(shù)模轉(zhuǎn)換接口相連；(C)叉指電極的輸出信號轉(zhuǎn)換電路，Ii為叉指電極的輸出電流，V。為電流轉(zhuǎn)換并放大后的電壓信號，與DAQ的模數(shù)轉(zhuǎn)換接口相連。圖4. PC軟件控制的操作界面。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖描述本發(fā)明的具體實施方式
。圖I顯示的為本發(fā)明的整個系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)裝置示意圖。該系統(tǒng)包括集成的PCR微芯片(虛線框內(nèi))、交流激勵電源、電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路、溫度控制電路(傳感器信號轉(zhuǎn)換及放大和加熱控制)、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換接口(DAQ)及上位機(jī)的Labview控制中心。其中，集成的PCR微芯片結(jié)構(gòu)，集成了微反應(yīng)腔(B)、溫度傳感器電極和加熱電極 (C)、電化學(xué)檢測電極⑶等模塊(如圖2所示)。圖2中，㈧為結(jié)構(gòu)示意圖，該尺寸并非實際的尺寸，實際的集成的PCR微芯片平面尺寸為15_X12mm。各層中檢測電極、PCR反應(yīng)所在的腔體和集成的溫度控制電極的實際結(jié)構(gòu)和尺寸分別對應(yīng)(B)、(C)、(D)。(B)中反應(yīng)腔中心面積約為50mm2,2個圓形進(jìn)樣口半徑為Imm,微流體管道寬50μηι。(C)中的電極材料為金屬鉬。⑶中的叉指電極材料為金屬金，叉指寬3mm, 60mm長,相鄰叉指間距為9mm,圓形進(jìn)樣口半徑為2mm，鍵合時與⑶中的進(jìn)樣口對準(zhǔn)。圖㈧顯示共有兩層基底構(gòu)成。制作的方法是首先在雙拋光氧化的硅基底一面用光刻膠AZ4620將掩模板圖形化，顯影后用HF 溶液溶解裸露的SiO2,同時用膠或者藍(lán)膜保護(hù)未光刻的另外一面SiO2層；將腔體圖形表面的Si基底暴露出來，再用50% KOH在50°C恒溫水浴槽中刻蝕出具有一定深度的腔體。用丙酮除膠并重新干凈硅基底，另外一面用lift-off工藝制作Pt金屬電極(C)，作為集成的加熱電極和溫度傳感電極，用于實時精確的溫度控制。在電極支撐物(例如普通玻璃片) 表面用同樣的lift-off工藝制作金電極作為電化學(xué)檢測電極(D)并打孔作為進(jìn)出樣口，然后用標(biāo)準(zhǔn)工藝在此電極表面生長很簿的Si3N4或SiO2層作為絕緣層。叉指電極面與硅基底的微反應(yīng)腔體面通過紫外膠鍵合，兩基底的圓形進(jìn)樣口分別對準(zhǔn)，這樣就可與微反應(yīng)室形成密閉結(jié)構(gòu)。(C)和(D)中電極通過焊接點上的金屬引線與外圍控制電路相連。在實際檢測中，兩個微集成芯片同時進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)并實時檢測兩路的電導(dǎo)信號。如圖I中所示，交流激勵源產(chǎn)生35kHz、IOV的正弦電壓，接入叉指電極使其產(chǎn)生感應(yīng)電流。此感應(yīng)電流不能直接被數(shù)據(jù)卡采集，因此需要通過簡單的運算放大器電路(圖3C) 轉(zhuǎn)換成電壓信號。因為電容耦合產(chǎn)生的電流較小，轉(zhuǎn)換成的電壓信號也較微弱，不能直接測量。通過調(diào)節(jié)圖3C的電阻R阻值實現(xiàn)合適倍數(shù)的放大，這樣轉(zhuǎn)化后的電壓才能控制在數(shù)據(jù)采集卡的采樣范圍和采樣精度之內(nèi)。為避免高頻交流信號之間互相干擾，叉指電極的激勵信號線與信號讀出線盡量遠(yuǎn)離并相互隔離。調(diào)理后的電壓信號通過高性能接口 DAQ(采樣頻率至少為500kHz,幅度-IOV 10V)采樣被傳輸至上位機(jī)的Labview控制中心,進(jìn)行去噪、濾波、波形檢測等數(shù)字處理，最后以極微小的延時顯示當(dāng)前的微芯片中溶液的電導(dǎo)變化引起的電壓變化。檢測樣品中，PCR擴(kuò)增的進(jìn)行同時引起各種離子的釋放，從而引起溶液電導(dǎo)的變化，產(chǎn)生感應(yīng)電流的差值。所以上位機(jī)的Labview控制中心顯示的信號差實時反應(yīng)了 PCR擴(kuò)增情況。圖I中的溫度控制模塊實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)換和信號調(diào)理功能，由圖3A的橋式電路及信號放大電路組成。隨著芯片溫度的變化，芯片上的Pt溫度傳感器電阻也產(chǎn)生線性變化，該電阻變化通過橋式電路轉(zhuǎn)化成電壓信號。但是該電壓信號較微弱，不能直接測量，因此電壓信號同樣需要放大到DAQ的采樣范圍和精度之內(nèi)；上位機(jī)的Labview控制中心對經(jīng)DAQ 采集的溫度信號進(jìn)一步通過低通濾波電路去除背景噪聲，提高了電壓信號的信噪比；最終將處理過的數(shù)字電壓將信號還原成溫度傳感器檢測的溫度信號，從而實現(xiàn)對芯片溫度的測定。接著上位機(jī)的Labview控制中心以此溫度信號為輸入反饋信號，根據(jù)標(biāo)定的溫度循環(huán)的要求計算，通過脈沖調(diào)制算法(PWM)得到電極加熱的控制信號，經(jīng)過DAQ形成模擬信號供給電壓調(diào)節(jié)器(圖3B);電壓調(diào)節(jié)器控制加載在加熱電極兩端的電壓開斷時間，從而調(diào)節(jié)功率，實現(xiàn)不同速率的溫度升降。PWM算法可以保證溫度的快速升溫，防止溫度過沖并穩(wěn)定溫度。直流電源由集成的DC/DC模塊直接供電。系統(tǒng)的模擬電路部分(圖3)都集成在一個約15cmX IOcm大的PCB板上，并通過屏蔽盒與外界隔離，有效抵制外界干擾。圖4顯示的是本發(fā)明中上位機(jī)的Labview控制中心操作界面。叉指電極的信號流與溫度調(diào)控信號通過同一個多路DAQ與上位機(jī)相連,并由Labview控制中心對數(shù)據(jù)采集卡實現(xiàn)分時復(fù)用功能，保證多通道工作的前提下又能在單通道實現(xiàn)較高采樣率。數(shù)字信號的濾波、計算等處理都在Labview程序后端平臺進(jìn)行，并未在操作界面顯示?？刂平缑嬗糜跍囟瓤刂频膯印嶋H溫度的顯示和PCR過程電壓變化的實時顯示及存儲等操作，非常直觀且操作非常簡便。系統(tǒng)操作步驟I、微反應(yīng)腔體先用O. 5% (質(zhì)量)的BSA溶液注滿半封閉I小時，可以減少PCR反應(yīng)物的被吸附，提高芯片PCR的反應(yīng)效率。2、將BSA抽取干凈，用氣動進(jìn)樣方式將反應(yīng)混合物注入微反應(yīng)腔，進(jìn)出口用石蠟油或PDMS密封，防止溫度循環(huán)過程中樣品的揮發(fā)。一個微芯片加入帶有模 板的PCR反應(yīng)混合物。另外一個微芯片加不帶模板的PCR反應(yīng)混合物，作為陰性對照樣本。進(jìn)樣品用石蠟油或礦物油密封。3、運行Labview程序，看到穩(wěn)定的溫度和電壓波形顯示后，選擇存儲的文件地址， 然后啟動溫度控制功能，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并將實時檢測的電導(dǎo)信號變化顯示及存儲。PCR擴(kuò)增反應(yīng)無需標(biāo)記物和探針。4、可根據(jù)反應(yīng)結(jié)果自主選擇反應(yīng)結(jié)束的時間。停止溫度控制后，將反應(yīng)混合物從微腔體中抽取，再用緩沖液和去離子水多次清洗微腔。因為電極不與檢測樣本直接接觸，所以電極的性能一直保持不變，則腔體清洗后的芯片即可用于下一次的檢測。
權(quán)利要求
1.一種非接觸式電導(dǎo)法實現(xiàn)PCR過程的實時檢測系統(tǒng)，其特征在于包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激勵電源、電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路、溫度傳感電路、加熱電路、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換接口 DAQ及上位的Labview控制中心；其中，交流激勵電源連接PCR微芯片中的電化學(xué)檢測電極；加熱控制電路連接PCR微芯片中的加熱電極；電化學(xué)檢測電極另一端則與電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路連接；溫度傳感電路連接PCR微芯片中的溫度傳感電極；溫度傳感電路、電流轉(zhuǎn)電壓放大電路又與模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換接口 DAQ連接，模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換接口 DAQ分別與上位機(jī)的Labview控制中心和加熱控制電路連接，所述的集成PCR微芯片集成了微反應(yīng)腔、溫度傳感電極和加熱電極以及電化學(xué)檢測電極，硅基底正面刻蝕微反應(yīng)腔，背面集成加熱電極和溫度傳感電極；電化學(xué)檢測電極為叉指電極，通過絕緣層與硅基底鍵合，與微反應(yīng)腔形成密閉結(jié)構(gòu)，通過控制硅基底背面的溫度傳感器電極和加熱電極實現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)所需的溫度循環(huán)。
2.按權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于電化學(xué)檢測電極與硅基體的微反應(yīng)腔體通過紫外膠鍵合，兩基底的圓形進(jìn)口分別對準(zhǔn)，叉指電極通過焊接點上的金屬引線與外圍電流轉(zhuǎn)電壓放大電路相連。
3.按權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于①交流激勵電源產(chǎn)生35KHz、10V的正弦電壓，接入叉指電極產(chǎn)生感應(yīng)電流；感應(yīng)電流信號通過電流轉(zhuǎn)電壓電路轉(zhuǎn)換并放大成可被數(shù)據(jù)采集卡檢測的電壓信號；②所述的接口DAQ采樣頻率至少為500KHz，幅度為-IOV 10V。
4.按權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于(a)所述的集成的PCR微芯片尺寸為15mmX12mm ；(b)所述的微反應(yīng)腔的面積為50mm2,微流體管道寬50μ m。
5.按權(quán)利要求I或2所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的叉指電極材料為金，叉指寬為 3mm,長為60mm,相鄰叉指間距為9mm,圓形進(jìn)樣口半徑為2mm,鍵合時與反應(yīng)腔體進(jìn)樣口對準(zhǔn)。
6.按權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其特征在于檢測的電壓信號被送入上位機(jī)的Labview控制中心，進(jìn)行去噪、濾波、波形檢測處理，最后以極微小的延時顯示當(dāng)前的微芯片中溶液的電導(dǎo)變化引起的電壓變化；檢測中，PCR擴(kuò)增的進(jìn)行同時引起各種離子的釋放，從而引起溶液電導(dǎo)的變化，產(chǎn)生感應(yīng)電流的差值，上位機(jī)的Labview控制中心顯示的信號差實時反應(yīng)了 PCR擴(kuò)增情況。
7.按權(quán)利要求I或6所述的系統(tǒng),其特征在于上位機(jī)的Labview控制中心采集到溫度信號后，根據(jù)標(biāo)定的溫度循環(huán)的要求，通過PWM脈沖調(diào)制算法，給出加熱電極的電壓控制； PWM算法保證溫度的快速升溫，防止溫度過沖并穩(wěn)定溫度。
8.使用按權(quán)利要求1-6中任一項所述的系統(tǒng)的方法，其特征在于操作步驟是(1)微反應(yīng)腔膠體先用O.5%的BSA注滿半封閉I小時，減少PCR反應(yīng)物的被吸附，提高芯片PCR的反應(yīng)效率；(2)將BSA抽取干凈，用氣動進(jìn)樣方式將反應(yīng)混合物注入微反應(yīng)腔，進(jìn)出口用石蠟油或 PDMS密封，防止溫度循環(huán)過程中樣品的揮發(fā)；一個微芯片加入帶有模板的PCR反應(yīng)混合物； 另外一個微芯片加不帶模板的PCR反應(yīng)混合物，作為陰性對照樣本；進(jìn)樣品用石蠟油或礦物油密封；(3)運行上位機(jī)的Labview控制中心，當(dāng)顯示穩(wěn)定的溫度和電壓波形后，選擇存儲的文件地址，然后啟動溫度控制功能，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并將實時檢測的電導(dǎo)信號變化顯示及存儲；(4)根據(jù)反應(yīng)結(jié)果自主選擇反應(yīng)結(jié)束的時間；停止溫度控制后，將反應(yīng)混合物從微腔體中抽取，再用緩沖液和去離子水多次清洗微腔；因為電極不與檢測樣本直接接觸，所以電極的性能一直保持不變，則腔體清洗后的芯片即可用于下一次的檢測。
9.按權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)使用方法，其特征在于步驟(3)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)無需標(biāo)記物和探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及非接觸式電導(dǎo)法實現(xiàn)PCR過程的實時檢測系統(tǒng)和方法，其特征在于所述系統(tǒng)包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激勵電源、電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路、溫度傳感電路、加熱電路、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換接口DAQ及上位的Labview控制中心；所述的集成PCR微芯片集成了微反應(yīng)腔、溫度傳感電極和加熱電極以及電化學(xué)檢測電極，硅基底正面刻蝕微反應(yīng)腔，背面集成加熱電極和溫度傳感電極；電化學(xué)檢測電極為叉指電極，通過絕緣層與硅基底鍵合，與微反應(yīng)腔形成密閉結(jié)構(gòu)，通過控制硅基底背面的溫度傳感電極和加熱電極實現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)所需的溫度循環(huán)。本發(fā)明所述的檢測系統(tǒng)的靈敏度和分辨率可達(dá)fg/μL以下，電極復(fù)用性高，使用壽命長、檢測結(jié)果可靠性高。
文檔編號C12M1/34GK102604827SQ20121009310
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者張洹千, 方新心, 景奉香, 趙建龍, 金慶輝 申請人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所