專利名稱：用BsrI鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定單核苷酸多態(tài)性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的方法。
背景技術(shù)：
SNP(單核苷酸多態(tài)性)是指單個核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基的置換、插入和缺失等形式。SNP現(xiàn)已廣泛用于簡單和復(fù)雜疾病的遺傳連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析及疾病易感基因的定位，指導(dǎo)易感基因克隆。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長度多態(tài)(PCR-RFLP)技術(shù)是一種快速、簡便、準(zhǔn)確、低成本檢測SNP基因型的經(jīng)典方法。該方法原理是限制性內(nèi)切酶是一類識別DNA特異位點(通常4 6bp)，并在特異位點進行切割的酶類。酶切位點的特異性意味著對特定DNA等位基因的完全消化會產(chǎn)生同樣的片段序列。而堿基的替換或插入、缺失可以產(chǎn)生或消除一個特定酶切位點，從而改變酶切割后產(chǎn)生片段的大小和數(shù)目。這些酶切片段帶型的不同稱為限制性片段長度多態(tài)性。如果SNP產(chǎn)生和消除了某個限制性內(nèi)切酶位點，則可以通過對PCR產(chǎn)物進行酶切、電泳加以檢測。該方法主要優(yōu)點在于操作簡便，快速，終點判斷準(zhǔn)確。主要缺點在于酶切位點的選擇，并不是所有的SNP 位點都可以使用該方法來鑒別，且部分內(nèi)切酶價格昂貴。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是一種重要的葉酸代謝酶，體內(nèi)催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為體內(nèi)最主要的甲基供體5-甲基四氫葉酸，具有重要的生理功能。目前研究發(fā)現(xiàn)編碼該蛋白的基因缺陷與動脈硬化性血管阻塞性疾病密切相關(guān)，還是胎兒神經(jīng)管畸形及癌癥發(fā)生的遺傳因素。人MTHFR基因定位于染色體1P36. 3，該基因第十二外顯子A/G堿基變異可引起第594位氨基酸變異(Gln/Arg)，文獻(xiàn)中常記為1793A/G多態(tài)，該多態(tài)可能影響MTHFR的功能。美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學(xué)圖書館生物信息技術(shù)中心(http://www. ncbi.nlm.nih. gov)可查閱MTHFR基因及其多態(tài)序列和相關(guān)信息，該多態(tài)在SNP數(shù)據(jù)庫中編號為rs2274976。因此，通常該多態(tài)在人群中存在三種MTHFR基因的基因型GG型(人體基因組rs2274976多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為G) ,AG型(人體基因組rs2274976多態(tài)位點的兩個等位基因堿基分別為G和A)和AA型(人體基因組rs2274976多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為A)。目前人MTHFR基因多態(tài)rs2274976的鑒定常采用PCR-RFLP方法。目前鑒定人MTHFR基因多態(tài)rs2274976時常使用內(nèi)切酶BsrBI進行鑒定，該內(nèi)切酶的價格昂貴(關(guān)于部分內(nèi)切酶的參考價格可以參考后面的表I)，影響了實驗的費用，難以在實驗室中普及使用。并且由于傳統(tǒng)PCR-RFLP方法的固有缺陷，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常難以選擇其他限制性內(nèi)切酶對人MTHFR基因多態(tài)rs2274976進行鑒定。因此，本領(lǐng)域存在對操作簡單，成本低，使用范圍廣的新型檢測SNP的方法的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種操作簡單，成本低，使用范圍廣的鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的方法，其 包括以下步驟a)提供待測人基因組DNA ；b)使用擴增人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976位點附近序列的正向引物和反向引物，以所述待測人基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)，獲得擴增產(chǎn)物；c)使用限制性內(nèi)切酶對所述擴增產(chǎn)物進行酶切，獲得酶切產(chǎn)物；以及d)對所述酶切產(chǎn)物進行電泳，以鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976，其中，所述正向引物其3’末端倒數(shù)第一位堿基與多態(tài)rs2274976堿基相鄰，倒數(shù)第二位堿基為錯配堿基C，以便在擴增產(chǎn)物中與多態(tài)G等位基因形成CCGG (第一個堿基C為錯配堿基，第三個堿基G為多態(tài)等位基因)或ACCGGT (第二個堿基C為錯配堿基，第四個堿基G為多態(tài)等位基因)結(jié)構(gòu)，或者與多態(tài)A等位基因形成CCAGT (第一個堿基C為錯配堿基，第三個堿基A為多態(tài)等位基因)結(jié)構(gòu)。通過本發(fā)明的方法可以通過引物上的錯配堿基將SNP附近的序列改變?yōu)榭杀活A(yù)先確定的限制性內(nèi)切酶識別的序列，因此，可以克服現(xiàn)有PCR-RFLP方法所存在的需要采用昂貴內(nèi)切酶的缺陷，進而大大降低了檢測SNP的成本。具體而言，由于在該正向引物序列中倒數(shù)第二位堿基C為錯配堿基(該堿基在人MTHFR基因序列中的相應(yīng)位置為G)，因此，錯配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由AGCGGT或AGCAGT更改為ACCGGT或ACCAGT (其中第二個堿基為錯配堿基，第四個堿基為A/G多態(tài)位點)，因此擴增產(chǎn)物中G等位基因片段可被識別CCGG序列的限制性內(nèi)切酶或者識別ACCGGT序列的限制性內(nèi)切酶識別(即G等位基因片段可被內(nèi)切酶切開)。同樣錯配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由GCGGT或GCAGT更改為CCAGT或CCGGT (其中第一個堿基為錯配堿基，第四個堿基為A/G多態(tài)位點)，因此擴增產(chǎn)物中A等位基因片段可被識別CCAGT序列的限制性內(nèi)切酶識別(即A等位基因片段可被內(nèi)切酶切開)。進而，可以根據(jù)片段切開情況來判斷多態(tài)基因型。更具體地，經(jīng)序列分析可知，基因原始序列中A/G多態(tài)可由表I中前四種內(nèi)切酶識別。如通過堿基錯配PCR將多態(tài)位點前面第二位堿基G替換為C，則該多態(tài)為G等位基因時經(jīng)PCR擴增后含CCGG序列可被識別CCGG序列的內(nèi)切酶識別(如MspI、HpaII)，含有ACCGGT序列可被識別ACCGGT序列的內(nèi)切酶識別(如BsrFI、BsaWI、AgeI)。同樣可被上述內(nèi)切酶的同裂酶(isoschizomer,來源于不同物種但能識別相同DNA序列的限制性內(nèi)切酶)識別并切開，而A等位基因不能切開。通過堿基錯配PCR將多態(tài)位點前面第二位堿基G替換為C，則當(dāng)該多態(tài)為A等位基因時該多態(tài)經(jīng)PCR擴增后含CCAGT序列可被識別ACTGG序列(互補序列為CCAGT)的內(nèi)切酶識別(如BsrI)。同樣可被BsrI的同裂酶識別并切開，而G等位基因不能切開。下表I中提供了 NEB公司內(nèi)切酶價格信息(從111^口://\￥￥￥.11613-(311；[1^.(301]1獲取)作為限制性內(nèi)切酶識別位點和價格的參考。表INEB公司幾種內(nèi)切酶識別序列及其價格內(nèi)切酶識別序列價格BtsI GCAGTG679 元/500u
AciI CaCGC3,079 元/IOOOu
BsrBI CCGaCTC 629 元/IOOOuTspRI NNCASTGNNA 739 元/IOOOuBsrFI RaCCGGY 679 元/IOOOu
BsaWI WaCCGGW 739 元/IOOu^
AgeI ACCGGT679 tl/250u
HpaII CaCGG289 元/IOOOu
MspI CaCGG569 元/5000u
BsrI ACTGGNa 679 元/IOOOu在本發(fā)明的一個實施方案中，正向引物由選自下列的核苷酸序列構(gòu)成SEQ IDNO I (ctttgccctg tggattgacc)和 SEQ NO :11 (tttgccctgtggattgacc)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，反向引物由選自下列的核苷酸序列構(gòu)成SEQ IDNO 2(gcagttgtcc agtgggaagtca)、SEQ ID NO 7 (aatgtgtctt ccaccacctgc)和 SEQ NO 12 (tctcgcattc tgggtggg)。正向和反向引物的設(shè)計主要考慮引物對PCR擴增的靈敏度、特異度和擴增效率的影響。通常按照堿基互補配對原則設(shè)計引物，引物與模板的序列要緊密互補。長度為15-30bp，過短或過長可導(dǎo)致特異性差，過長亦會導(dǎo)致其延伸溫度大于74°C而不利于PCR反應(yīng)。正向引物的確定必須除了上述原則外必須含有倒數(shù)第二位末端錯配堿基C。正向引物在其3’末端倒數(shù)第二位含有錯配堿基C，以便在擴增產(chǎn)物中與多態(tài)G等位基因形成ACCGGT (第二個堿基C為錯配堿基，第四個堿基G為多態(tài)等位基因)結(jié)構(gòu)，與多態(tài)A等位基因形成CCAGT (第一個堿基C為錯配堿基，第三個堿基A為多態(tài)等位基因)結(jié)構(gòu)。從而可以被相應(yīng)的內(nèi)切酶識別。擴增產(chǎn)物的長度主要是由反向引物所決定的(因為正向引物位于多態(tài)位點上游附近，其位置大致已確定)，通常擴增產(chǎn)物長度為100-200bp之間，這樣即利于PCR產(chǎn)物擴增，又利于后續(xù)的酶切鑒定。否則，如果產(chǎn)物過短則不利于擴增，過長則酶切后片段長度差異較小，不利于分辨。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，利用SEQ ID NO :1的核苷酸序列作為正向引物以及SEQ ID NO 2的核苷酸序列作為反向引物的PCR反應(yīng)可以獲得如下擴增產(chǎn)物ctttgccctg tggattgacc rgtggggaaa gctgtatgag gaggagtccc cgtcccgcac 60catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac ctggtggaca atgacttccc 120actggacaac tgc 133 (SEQ ID NO 4)擴增后產(chǎn)物序列中下劃線部分分別為正向、反向引物所對應(yīng)的序列，21bp處r代表A/G多態(tài)即SNP位點rs2274976。該擴增產(chǎn)物長度為133bp。經(jīng)MspI酶切后可出現(xiàn)133bp、 114bp(該片段下游序列相比上游序列由于MspI酶切產(chǎn)生粘性末端減少兩個單鏈堿基)、19bp (該片段下游序列相比上游序列由于MspI酶切產(chǎn)生粘性末端增加兩個單鏈堿基)三種片斷(其中19bp電泳圖中不能看到)。酶切后基因型判斷GG為114bp，AG有133bp和114bp兩種片段，AA為133bp。對于酶切產(chǎn)物的鑒定，通常使用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，基于成本和便利性考慮，使用瓊脂糖凝膠電泳更為常見。在本發(fā)明中，對于上述133bp的擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳的條件是將酶切產(chǎn)物在2. 5% -4%瓊脂糖凝膠中3-8V/cm條件下，電泳40-80分鐘，于紫外燈下拍照鑒定。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述限制性內(nèi)切酶選自MspI、HpaII, BsrFI,BsrI、BsaWI、AgeI以及它們的同裂酶，更優(yōu)選所述限制性內(nèi)切酶為MspI。這主要是基于成本和切割效率的綜合考慮。在本發(fā)明中，PCR擴增反應(yīng)的條件并不受到特別的限制，只要能夠獲得擴增產(chǎn)物即可。PCR的主要參數(shù)-退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶序列的長度。如果PCR退火溫度過低則易出現(xiàn)非特異產(chǎn)物，過高則影響擴增產(chǎn)物產(chǎn)量，最終需要憑實驗確定。PCR延伸時間根據(jù)產(chǎn)物長度確定，通常20s-60s即可。為了能夠提高PCR擴增 效率，進而進一步提高鑒定效率，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所采用的PCR擴增條件是95°C變性3分鐘；35個循環(huán)95°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸50秒；以及上述35個循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin。對于待測DNA的選擇，本發(fā)明并沒有特別的限制。既可以是從人體的體液或者組織獲得基因組DNA，還可以是經(jīng)過預(yù)先降解處理的基因組。為了方便實施，通常優(yōu)選從血液提取的基因組DNA。其中所述的組織包括人體中含有全部或至少MTHFR基因的組織，而與是否表達(dá)該MTHFR基因無關(guān)。從體液和/或組織中提取DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可以參考常用的分子生物學(xué)手冊，例如《分子克隆》第2版進行。另外，在本發(fā)明還提供了一種用于鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的試劑盒，包含擴增人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976位點附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端倒數(shù)第一位堿基與rs2274976多態(tài)堿基相鄰，倒數(shù)第二位為錯配堿基C，以便在擴增產(chǎn)物中與多態(tài)A等位基因形成CCAGT結(jié)構(gòu)，所述的正向引物為SEQ ID NO:I或者SEQ NO :11，反向引物為SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :7或SEQ NO : 12 ;所述的試劑盒還包括限制性內(nèi)切酶BsrI ;并且所述試劑盒還包括用于實施鑒定的說明書。如前所述，該試劑盒操作簡單，成本低，使用范圍廣。在本發(fā)明的一個實施方案中，正向引物由選自下列的核苷酸序列構(gòu)成SEQID NO:I (ctttgccctg tggattgacc)和 SEQ NO : 11 (tttgccctgtggattgacc)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，反向引物由選自下列的核苷酸序列構(gòu)成SEQ IDNO 2(gcagttgtcc agtgggaagtca)、SEQ ID NO 7 (aatgtgtctt ccaccacctgc)和 SEQ NO 12 (tctcgcattc tgggtggg)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述試劑盒中還包括MspI、HpaII> BsrI、BsrFI> BsaffI> AgeI等限制性內(nèi)切酶以及它們的同裂酶，這樣可以方便對擴增產(chǎn)物的檢測。進一步，優(yōu)選所述限制性內(nèi)切酶是BsrI。這主要是基于限制性內(nèi)切酶的成本和切割效率的綜合考慮。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在試劑盒中還可以包括其他成分，例如用于實施鑒定的說明書等。


圖I描述了實施例I中人MTHFR基因(rs2274976)多態(tài)PCR產(chǎn)物經(jīng)MspI酶切后電泳照片。其中M是DNA分子量標(biāo)志物；泳道I :GG型樣品的電泳結(jié)果；泳道2 AA型的電泳結(jié)果；泳道3 :AG型樣品的電泳結(jié)果。
具體實施例方式下面通過本發(fā)明的具體實施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細(xì)描述。其中，需要說明的是，本發(fā)明并不以任何方式受限于下面所述的具體實施方式
和實施例。下面利用SEQ ID NO :1的核苷酸序列作為正向引物以及SEQ ID NO :2的核苷酸序列作為反向引物作為例子，對本發(fā)明的概念進行詳細(xì)地描述。在本發(fā)明一個實施方案中，本發(fā)明檢測人MTHFR基因多態(tài)rs2274976的方法，步驟是I、提取待測人基因組DNA模板，所述人基因組DNA模板為人體任何部分取得的人基因組DNA ；2、PCR擴增基因組DNA，對提取的模板基因組DNA進行PCR擴增，獲得含多態(tài)附近序列的PCR產(chǎn)物；3、對PCR擴增產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)，得酶切產(chǎn)物；以及4、對酶切后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定人MTHFR基因多態(tài)rs2274976。下面對各個主要步驟進行詳細(xì)描述(I)引物設(shè)計與合成在美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學(xué)圖書館生物信息技術(shù)中心http://www. ncbi.nlm. nih. gov (NCBI)網(wǎng)站查找MTHFR基因序列和SNP信息，確定MTHFR多態(tài)位點堿基變異數(shù)據(jù)；含MTHFR 多態(tài) rs2274976 的部分基因序列(SEQ ID NO 3)cttccctggg cgagagatca tccagcccac cgtagtggat cccgtcagct tcatgttctg 60gaaggtaaag gagccggggg caagcttgcc ccgcccacct ggaaaaccgt ggggagggat 120tgggaccaag tcccaagcgt gtgctgaagg ccacactgga cccagccttc agggcacacc 180cagctctgac tcacccatgt cactgctgat gcagggtgtt tatttctggg caggggtggg 240aagtgatact ggcagtgggc cttgttctat tccgggaaat gtcctgttga gcagagccct 300tggagagccc tgttaatctt gcctctgtgt gtgtgtgcat gtgtgcgtgt gtgcgggggt 360atgtgtgtgt aggacgaggc ctttgccctg tggattgagc rgtggggaaa gctgtatgag 420gaggagtccc cgtcccgcac catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac 480ctggtggaca atgacttccc actggacaac tgcctctggc aggtggtgga agacacattg 540gagcttctca acaggcccac ccagaatgcg agagaaacgg aggctccatg accctgcgtc 600ctgacgccct gcgttggagc cactcctgtc ccgccttcct cctccacagt gctgcttctc 660ttgggaactc cactctcctt cgtgtctctc ccaccccggc ctccactccc ccacctgaca 720atggcagcta gactggagtg aggcttccag gctcttcctg g761基因序列中401bp處r代表A/G多態(tài)即SNP位點rs2274976 ；根據(jù)上述序列設(shè)計引入錯配堿基的引物，根據(jù)序列情況確定正向和反向引物的位置與長度，具體如下正向引物序列為5’ -CTTTGCCCTGTGGAITGACC-3’ (SEQ ID N0:1)， 反向引物序列為5’ -GCAGITGTCCAGTGGGAAGTCA-3’ (SEQ ID NO 2)；
其中正向引物序列中倒數(shù)第二位堿基C為錯配堿基(該堿基在原序列中應(yīng)為G)，錯配后PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列由AGCGGT或AGCAGT(其中第四個堿基為A/G多態(tài))更改為ACCGGT或ACCAGT，因此擴增產(chǎn)物中G等位基因片段可被識別CCGG序列的限制性內(nèi)切酶或者識別ACCGGT序列的限制性內(nèi)切酶識別(即G等位基因片段可被內(nèi)切酶切開)。同樣錯配后當(dāng)該多態(tài)為A等位基因時PCR擴增后含CCAGT (第三個堿基A為多態(tài))序列可被識別ACTGG序列(互補序列為CCAGT)的內(nèi)切酶識別。根據(jù)片段切開情況判斷多態(tài)基因型；按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，合成所述弓I物可以使用本領(lǐng)域中公知的方法，例如固相合成法，也可以委托生物工程公司合成并檢測正向和反向引物。將合成的正向、反向引物稀釋為ΙΟμπιοΙ/L濃度備用； (2)制備PCR擴增產(chǎn)物PCR擴增使用15-100 μ I的反應(yīng)體系為2XPCR MIX用量為PCR擴增反應(yīng)體系體積的一半即7. 5-50μ l、50-2000ng所述待檢測人基因組DNA和10 μ mol/L正向、反向引物各O. 1-10 μ 1，用滅菌雙蒸水補充至15-100 μ 1，混勻，即得PCR擴增反應(yīng)體系；其中，所述的2 XPCR MIX是2倍濃度的PCR反應(yīng)用的混合液制成；將PCR擴增反應(yīng)體系在94-95 V預(yù)變性3_5分鐘后；進行30_35個如下循環(huán)94-95 °C 變性 20-60s，50-65 °C 退火 20_60s，72°C 延伸 20_60s ;30-35 個循環(huán)結(jié)束后 72°C 延伸5-10min，即得PCR擴增產(chǎn)物，其位置相對應(yīng)含MTHFR多態(tài)rs2274976的部分基因序列中喊基 381bp-513bp 處；擴增后產(chǎn)物序列為(SEQ ID NO 4)ctttRccctR tRRattRacc rgtggggaaa gctgtatgag gaggagtccc cgtcccgcac 60catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac ctggtggaca atgacttccc 120actRRacaac tRC133bp序列擴增后產(chǎn)物序列中下劃線部分為正向、反向引物所對應(yīng)的序列，21bp處r代表A/G多態(tài)即SNP位點rs2274976。(3)酶切反應(yīng)將PCR擴增產(chǎn)物在10-30 μ I酶切體系中進行酶切反應(yīng)，所述的10_30 μ I酶切體系為2-15 μ I的PCR擴增產(chǎn)物、識別CCGG序列或者識別ACCGGT序列或者識別CCAGT序列的限制性內(nèi)切酶1-10U和IOX酶切緩沖液占總體積的1/10，滅菌雙蒸水補充至10-30μ 1，混勻，得酶切體系，將酶切體系于37°C水浴4-16小時，即得酶切產(chǎn)物；所述識別CCGG序列的限制性內(nèi)切酶為內(nèi)切酶MspI、HpaII及其同裂酶；所述識別ACCGGT序列的限制性內(nèi)切酶為內(nèi)切酶BsrFI、BsaffI.Agel及其同裂酶；所述識別CCAGT序列的限制性內(nèi)切酶為內(nèi)切酶BsrI及其同裂酶；根據(jù)價格因素選擇MspI或HpaII進行酶切鑒定;該多態(tài)位點含有G等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段114bp (該片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列減少兩個堿基)序列(SEQ IDNO 5)crgtggggaa agctgtatga ggaggagtcc ccgtcccgca ccatcatcca gtacatccac 60gacaactact tcctggtcaa cctggtggac aatRacttcc cactRRacaa CtRC 114酶切后切開片段114bp序列中下劃線部分為反向引物所對應(yīng)的序列，2bp處代表A/G 多態(tài)即 SNP 位點 rs2274976 ；該多態(tài)位點含有G等位基因時PCR產(chǎn)物酶切后可形成切開片段19bp (該片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加兩個堿基)序列(SEQ ID N06)ctttgccctg tggattgac 19。(2)瓊脂糖凝膠電泳，確定基因多態(tài)性將酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中3-8V/cm條件下，電泳40_80分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，對于不同的基因型，MTHFR位點擴增后出現(xiàn)133bp片斷，經(jīng)酶切后電泳會出現(xiàn)133bp、114bp、19bp三種片斷，依據(jù)133bp和114bp片段的有無判斷來判斷基因型GG型為114bp 一個片段，AG型有133bp和114bp兩種片段，AA型為133bp —個片段；經(jīng)測序鑒定，測序結(jié)果和使用現(xiàn)有技術(shù)檢測所得的結(jié)果完全相同。下面是實施本發(fā)明的若干實施例。實施例II材料與方法I. I主要試劑及儀器試劑2XPCR mix (MBI公司)，限制性內(nèi)切酶MspI (MBI公司)，瓊脂糖(BBI公司)，引物由上海Sangon公司合成。儀器9600型 PCR 儀(PE 公司)，微型電泳槽(Pharmacia Biotech, EPS1000), GelDoc 2000凝膠成像儀(Bio-RAD公司)。PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程有限公司完成。I. 2序列查找及引物設(shè)計在NCBI網(wǎng)站查找MTHFR基因序列和SNP信息，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)確定MTHFR多態(tài)位點堿基變異信息，設(shè)計引物，具體如下正向引物序列為5’ -CTTTGCCCTGTGGATTGACC-3’ (SEQ ID NO 1),反向引物序列為5’ -GCAGTTGTCCAGTGGGAAGTCA-3’ (SEQ ID NO :2)。I. 3從全血標(biāo)本提取DNA作為待測DNAEDTA抗凝管采集人外周血全血血樣300 μ I，使用TIANGEN公司RelaxGene RloodDNA System血液基因組DNA提取系統(tǒng)(主要成分為細(xì)胞裂解液CL、蛋白酶K、緩沖液FG、洗脫緩沖液TB)提取全血基因組DNA為待測人基因組DNA模板300 μ I外周血轉(zhuǎn)移至離心管，加入750 μ I細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻5次;10，000r/min離心20秒，倒棄上清液；在離心管中加入150 μ I的緩沖液混合液，緩沖液混合液是由緩沖液FG與蛋白酶K以體積比100 I混合制成，渦旋混勻器混勻至溶液無團塊；然后,在65°C水浴IOmin,其間顛倒混勻5次；加入質(zhì)量濃度為99. 9%的異丙醇150 μ 1，顛倒充分混勻至出現(xiàn)絲狀或簇狀基因組 DNA ；10，000r/min離心3分鐘，倒棄上清液，將離心管倒置在干凈的吸水紙上，確保DNA
沉淀物在管中；加入質(zhì)量濃度為70%乙醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10，000r/min離心3分鐘，倒棄上清液后，再加入質(zhì)量濃度為70%乙醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10，000r/min離心3分
鐘，倒棄上清液；
將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留5分鐘，確保DNA沉淀物在管中；將離心管在室溫下靜置，干燥至所有的液體揮發(fā)干凈(至少5分鐘)；再加入200 μ I洗脫緩沖液TB，渦旋振蕩5秒，65°C加熱10分鐘至I小時，加熱時，輕彈數(shù)次助溶，即得全血基因組DNA。I. 4PCR擴增及酶切鑒定人基因組DNAlOOng (制備方法如上所述),每個引物O. 2 μ mol/L, I XPCRmix,滅菌雙蒸水補足25 μ I反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，根據(jù)引物Tm值取59°C退火20s，72 °C延伸20s，共30個循環(huán)后72 °C延伸IOmin。PCR擴增后，取PCR產(chǎn)物10μ 1，加入5U內(nèi)切酶和2 μ IlOX酶切緩沖液和滅菌雙蒸水組成20 μ I反應(yīng)體系，37°C水浴中酶切8h后，電泳后于凝膠成像儀觀察成像，結(jié)果示于圖I中。2 結(jié)果2. I酶切結(jié)果上述酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠8V/cm條件下，電泳40分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，MTHFR位點擴增后出現(xiàn)133bp片斷(以上游序列為準(zhǔn)，以下同)，經(jīng)MspI酶切后可出現(xiàn)133bp、114bp(下游序列相比上游序列由于MspI酶切產(chǎn)生粘性末端減少兩個單鏈堿基)、19bp (下游序列相比上游序列由于MspI酶切產(chǎn)生粘性末端增加兩個單鏈堿基)三種片斷(其中19bp電泳圖中不能看到)。如圖I所不。酶切后基因型判斷GG型為114bp，AG型有133bp和114bp兩種片段，AA型為133bp。2. 2MTHFR基因多態(tài)結(jié)果鑒定檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)MTHFR出現(xiàn)GG型、AG型和AA型三種基因型。另外，對MTHFR多態(tài)各類型PCR產(chǎn)物進行測序鑒定，測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致。實施例2外周血全血標(biāo)本測定人MTHFR基因rs2274976多態(tài)與實施例I的步驟基本相同，只是PCR反應(yīng)所采用的正向引物是SEQ ID NO: 1，反向引物是SEQ ID NO :7，退火溫度為59°C，并且所采用的限制性內(nèi)切酶是HpaII (NEB公司)。結(jié)果所獲得的擴增產(chǎn)物序列如下(159bp，SEQ ID NO 8)ctttgccctg tggattgacc rgtggggaaa gctgtatgag gaggagtccc cgtcccgcac 60catcatccag tacatccacg acaactactt cctggtcaac ctggtggaca atgacttccc 120actggacaac tgcctctggc aggtggtgga agacacatt159MTHFR多態(tài)含G等位基因時酶切后可形成140bp產(chǎn)物(SEQ ID NO :9)，序列如下crgtggggaa agctgtatga ggaggagtcc ccgtcccgca ccatcatcca gtacatccac 60gacaactact tcctggtcaa cctggtggac aatgacttcc cactggacaa ctgcctctgg 120caggtggtgg aagacacatt140MTHFR多態(tài)含G等位基因時酶切后可形成19bp產(chǎn)物(SEQ ID N0:10，其與SEQ IDNO 6的序列一致)，序列如下ctttgccctg tggattgac19 上述酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠6V/cm條件下，電泳50分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，MTHFR位點擴增后出現(xiàn)159bp片斷，經(jīng)酶切、電泳出現(xiàn)159bp、140bp、19bp三種片斷，基因型判斷依據(jù)159和140bp片段的有無判斷GG型為140bp，AG型有159bp和140bp兩種片段，AA型為159bp。實施例3外周血血凝塊標(biāo)本測定人MTHFR基因rs2274976多態(tài)與實施例I的步驟基本相同，只是采用下面的方法從外周血血凝塊標(biāo)本提取DNA作為待測DNA。另外,PCR反應(yīng)所采用的正向引物是SEQ NO 11 (tttgccctgtggattgacc),反向引物是SEQ NO 12 (tctcgcattc tgggtggg),退火溫度是58 。限制性內(nèi)切酶為MspI (NEB公司)。提取DNA:普通采血管采集人外周血400 μ 1，使用TIANGEN公司RelaxGene RloodDNASystem血液基因組DNA提取系統(tǒng)提取外周血血凝塊中基因組DNA為待測人基因組DNA 模板；待采血管內(nèi)血清析出后分離血清，然后按下列步驟進行將上述采血管中凝血塊研磨為勻衆(zhòng)狀后置于離心管中，加入750 μ I細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻5次；10, 000r/min離心20秒,倒棄上清液；加入150μ I緩沖液混合液，緩沖液混合液是由緩沖液FG與蛋白酶K以體積比100 I混合制成，渦旋混勻器混勻至溶液無團塊；然后，在65°C水浴lOmin，其間顛倒混勻6次；加入質(zhì)量濃度為99. 9%的異丙醇150 μ 1，顛倒充分混勻至出現(xiàn)絲狀或簇狀基因組 DNA ；10，OOOr/min離心3分鐘，倒棄上清液，將離心管倒置在干凈的吸水紙上，確保DNA
沉淀物在管中；加入質(zhì)量濃度為70%的乙醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10, OOOr/min離心3分鐘，倒棄上清液后，再加入質(zhì)量濃度為70%的乙醇150 μ 1，渦旋振蕩5秒鐘，10，OOOr/min離心3分鐘,倒棄上清液；將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留至少5分鐘，確保DNA沉淀物在管中；將離心管在室溫下靜置，干燥至所有的液體揮發(fā)干凈(至少5分鐘)；加入200 μ I洗脫緩沖液TB，渦旋振蕩5秒，65°C加熱10分鐘至I小時，加熱時，輕彈數(shù)次助溶，即得外周血血凝塊中基因組DNA。結(jié)果所獲得的擴增產(chǎn)物序列如下(192bp，SEQ ID NO :13)tttgccctgt ggattgaccr gtggggaaag ctgtatgagg aggagtcccc gtcccgcacc 60atcatccagt acatccacga caactacttc ctggtcaacc tggtggacaa tgacttccca 120ctggacaact gcctctggca ggtggtggaa gacacattgg agcttctcaa caggcccacc 180cagaatgcga ga192MTHFR多態(tài)含G等位基因時酶切后可形成174bp產(chǎn)物(SEQ ID N0:14)，序列如下crgtggggaa agctgtatga ggaggagtcc ccgtcccgca ccatcatcca gtacatccac 60gacaactact tcctggtcaa cctggtggac aatgacttcc cactggacaa ctgcctctgg 120caggtggtgg aagacacatt ggagcttctc aacaggccca cccagaatgc gaga174
MTHFR多態(tài)含G等位基因時酶切后可形成18bp產(chǎn)物(SEQ ID NO : 15)，序列如下tttgccctgt ggattgac18上述酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠5V/cm條件下，電泳60分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，MTHFR位點擴增后出現(xiàn)192bp片斷，經(jīng)酶切、電泳出現(xiàn)192bp、174bp、18bp三種片斷，基因型判斷依據(jù)192和174bp片段的有無判斷GG型為174bp，AG型有192bp和174bp兩種片段，AA型為192bp。實施例4人肺組織標(biāo)本測定人MTHFR基因rs2274976多態(tài)與實施例I的步驟基本相同，只是采用下面的方法從肺組織標(biāo)本提取DNA作為待測 DNA。使用手術(shù)切除肺組織，酚-氯仿法提取肺組織基因組DNA為待測人基因組DNA模 板將肺組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取O. lg，玻璃勻漿器研磨碎肺組織后放入I. 5ml的第一個離心管中；在第一個離心管中加入Iml DNA 提取緩沖液(lOmmol/Ltris .Cl2,0. lmol/LEDTA,20 μ g/ml胰RNA酶，0. 5 %的十二烷基硫酸鈉)混勻，再加入50 μ I質(zhì)量濃度為10 %的十二烷基硫酸鈉，濃度為20mg/ml的蛋白酶K5. O μ 1，充分混勻后，于56°C保溫5h，每2h搖I次；放置到室溫,加入飽和酹500 μ I,顛倒混勻，10000r/min離心IOmin,分離水相和有機相，吸取上層含核酸的水相置于I. 5ml的第二個離心管中；在第二個離心管中加入與管內(nèi)的含核酸的水相等體積的酚氯仿異戊醇的混合液，其中，酚氯仿異戊醇的混合液是由酚氯仿異戊醇以體積比25 24 I混合制成，顛倒混勻，10000r/min離心10分鐘，取上層液體轉(zhuǎn)移到I. 5ml第三個離心管中；第三個離心管中，加入與管內(nèi)液體等體積的氯仿異戊醇以體積比24 I混合制成的混合液，顛倒混勻，10000r/min離心10分鐘,取上層清液到I. 5ml第四個離心管中；在第四個離心管中加入管內(nèi)清液2. 5倍體積的-20°C預(yù)冷的無水乙醇，沉淀DNA，得DNA沉淀物；將DNA沉淀物，12000r/min離心10分鐘，棄乙醇；再加入_20°C的質(zhì)量濃度為75%的乙醇洗滌，10000r/min離心5分鐘，去乙醇，在55 °C下干燥，得干燥的DNA沉淀物；加入100 μ I滅菌雙蒸水溶解干燥的DNA沉淀物，_20°C保存，即得肺組織基因組DNA，備用。結(jié)果所得酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠4V/cm條件下，電泳70分鐘，于紫外燈下拍照鑒定，其中，MTHFR位點擴增后出現(xiàn)133bp片斷，經(jīng)酶切、電泳出現(xiàn)133bp、114bp、19bp三種片斷，基因型判斷依據(jù)133bp和114bp片段的有無判斷GG型為114bp —個片段，AG型有133bp和114bp兩種片段，AA型為133bp —個片段；經(jīng)測序鑒定，測序結(jié)果和使用現(xiàn)有技術(shù)檢測所得的結(jié)果完全相同。從上述實施例可以看出，本發(fā)明針對使用PCR-RFLP鑒定MTHFR多態(tài)rs2274976的缺點，即必須使用識別原多態(tài)附近序列的內(nèi)切酶，內(nèi)切酶選擇余地小，價格昂貴等因素。本發(fā)明通過設(shè)計包含酶切位點的錯配引物來克服該缺點。該方法可認(rèn)為是PCR-RFLP的特殊應(yīng)用，其原理是根據(jù)單堿基突變位點的堿基替代情況設(shè)計PCR引物，其中一條引物根據(jù)突變位點鄰近序列設(shè)計，人為引入錯配堿基，使得引物3'端和單堿基突變的一種突變型在PCR擴增后形成一個酶切位點，其PCR產(chǎn)物可用類似PCR-RFLP的方法進行分析。由于這種方法應(yīng)用了引物3'端錯配技術(shù)，PCR產(chǎn)物進行酶切電泳后即可進行基因型的鑒定工作，因此在實際運用中具有很大的靈活性，且檢測方法簡單易行，成本低，酶切結(jié)果易分辨，是一種進行基因型鑒定的較好方法。本發(fā)明通過改進實驗方法，重新設(shè)計新的引物擴增該多態(tài)序列，使擴增產(chǎn)物中該基因多態(tài)附近序列改變，能夠應(yīng)用其他內(nèi)切酶進行鑒定，從而可以選擇更為廉價的內(nèi)切酶完成檢測。
已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細(xì)地描述，要指出的是，上述僅是本發(fā)明的實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述公開的技術(shù)內(nèi)容作出修改獲得等同的技術(shù)效果，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，進而仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的試劑盒，包含擴增人MTHFR基因多 態(tài)性rs2274976位點附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端倒 數(shù)第一位堿基與rs2274976多態(tài)堿基相鄰，倒數(shù)第二位為錯配堿基C，以便在擴增產(chǎn)物中與 多態(tài)A等位基因形成CCAGT結(jié)構(gòu)，所述的正向引物為SEQ ID N0:1或者SEQ N0:11，反向引 物為SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 7或SEQ NO 12 ;所述的試劑盒還包括限制性內(nèi)切酶BsrI ； 并且所述試劑盒還包括用于實施鑒定的說明書。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述的正向引物為SEQID N0:1，反向引物為SEQ ID NO :2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述的正向引物為SEQID N0:1，反向引物為SEQ ID NO :7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述的正向引物為SEQID NO :11，反向引物為SEQ ID NO :12。
全文摘要
用BsrI鑒定人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976的試劑盒，包含擴增人MTHFR基因多態(tài)性rs2274976位點附近序列的正向引物和反向引物，其中，所述正向引物在其3’末端倒數(shù)第一位堿基與rs2274976多態(tài)堿基相鄰，倒數(shù)第二位為錯配堿基C，以便在擴增產(chǎn)物中與多態(tài)A等位基因形成CCAGT結(jié)構(gòu)，所述的正向引物為SEQ ID NO1或者SEQ NO11，反向引物為SEQ ID NO2、SEQ ID NO7或SEQ NO12；所述的試劑盒還包括限制性內(nèi)切酶BsrI；并且所述試劑盒還包括用于實施鑒定的說明書。該試劑盒操作簡單，成本低，使用范圍廣。
文檔編號C12Q1/68GK102660638SQ201210091429
公開日2012年9月12日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者姚武, 楊永利, 王威 申請人:鄭州大學(xué)