基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)快速檢測(cè)試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)快速檢測(cè)試 劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指由于轉(zhuǎn)換、顛 換、插入、缺失等原因，使不同個(gè)體在基因組DNA某特定核苷酸位置上存在不同種類堿基 的多態(tài)性。SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上。位于編碼 區(qū)內(nèi)的SNP(coding SNP，cSNP)比較少，但它在遺傳性疾病研宄中卻具有重要意義，因此 cSNP的研宄更受關(guān)注。從對(duì)生物的遺傳性狀的影響上來(lái)看，cSNP又可分為2種：一種是同 義cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的 氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymous cSNP)，指堿基序列的改變可使以其為模板翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì) 的功能。這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因?？赏ㄟ^(guò)研宄SNP的性狀，判定疾病 的類型。
[0003] 研宄發(fā)現(xiàn)，SNP與許多疾病相關(guān)，決定了人類疾病的易感性和藥物反應(yīng)的差異性。 SNP對(duì)群體遺傳學(xué)、制藥業(yè)、法醫(yī)學(xué)、癌癥及遺傳性疾病甚至進(jìn)化的研宄都將產(chǎn)生不可估量 的影響。通過(guò)研宄SNP圖譜，可以更深刻地認(rèn)識(shí)癌癥、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾 病等發(fā)病率高的多基因疾病的發(fā)生機(jī)制。
[0004] 分子信標(biāo)（molecularbeacon)是一種在5'和3'末端自身形成一個(gè)8個(gè)喊基左 右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的 熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。在這種結(jié)構(gòu)下，熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的 光子被淬滅劑淬滅，所以不會(huì)產(chǎn)生熒光。在高溫變性或之后的退火雜交過(guò)程中，這種結(jié)構(gòu)被 破壞，導(dǎo)致熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，熒光便能被激發(fā)和探測(cè)到。
[0005] 目前檢測(cè)SNP的方法主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài) (SSCP)、等位基因特異的寡核苷酸（AS0)雜交、基因芯片、探針?lè)ā⒔沽姿岱?、直接測(cè)序法 等。這些技術(shù)檢測(cè)的樣本都要求提取純化的DNA作為模板，而不能直接加入細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)， 提取純化的DNA，增加了抽取血液和提取血液DNA的步驟。從抽血到提取純化DNA至少需 要4個(gè)小時(shí)；并且限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)、等位基因特異的寡核苷酸雜交、 基因芯片、焦磷酸法、直接測(cè)序法等技術(shù)操作時(shí)需要多個(gè)步驟，操作復(fù)雜，耗時(shí)耗力，檢測(cè)周 期至少需要一周時(shí)間。
[0006] 目前用于臨床檢測(cè)SNP的方法多用探針?lè)?，利用分子信?biāo)標(biāo)記提取純化的DNA，檢 測(cè)SNP的性狀，從而判定疾病的類型，但是，提取純化的DNA作為模板，檢測(cè)一次最快也要8 個(gè)小時(shí)，檢測(cè)的效率低，難以滿足指導(dǎo)臨床用藥的快速診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種監(jiān)測(cè)效率高、方便臨床用藥的快速診斷基因 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)快 速檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)混合液，PCR反應(yīng)混合液原料包括DNA聚合酶、dNTPs、上游引 物、下游引物、突變型分子信標(biāo)、野生型分子信標(biāo)、MgCl 2、PCR緩沖液和細(xì)胞裂解液。
[0009] 采用本發(fā)明技術(shù)方案的基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)快速檢測(cè)試劑盒，本PCR混合液 中的PCR緩沖液有助于酶的穩(wěn)定，是給聚合酶提供一個(gè)最適合的催化反應(yīng)條件；
[0010] dNTP 是 deoxy-ribonucleoside triphosphate (脫氧核糖核苷三磷酸）的縮寫， dNTPs則是由四種脫氧核苷酸（dATP、dGTP、dTTP、dCTP)以相同的比例混合而成，是DNA復(fù) 制的原料；
[0011] MgCl2的作用是提供Mg 2+與dNTP以及DNA模板結(jié)合形成復(fù)合體，只有這種復(fù)合體 才能被DNA聚合酶識(shí)別；
[0012] DNA聚合酶，以DNA為復(fù)制模板，從DNA由5'端點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制到3'端的酶。
[0013] 上游引物、下游引物作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，由于在DNA合成中DNA聚合酶僅僅可 以把新的核苷酸加到已有的DNA鏈上，無(wú)法指定起始點(diǎn)，因此，在核酸合成反應(yīng)時(shí)，上游引 物、下游引物作為每個(gè)多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用。
[0014] 細(xì)胞裂解液的作用是溶解細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，破壞分子間許多微弱的化學(xué)鍵，分解 一些蛋白酶，降低細(xì)胞裂解之后產(chǎn)生的雜質(zhì)對(duì)PCR反應(yīng)的影響。因此，由于上述PCR反應(yīng)混 合液中含有細(xì)胞裂解液，所以加入口腔細(xì)胞作為模板就可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的檢測(cè)。上游引物 和下游引物是在基因檢測(cè)位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)的特異性引物，突變型分子信標(biāo)特意地與突變序列 結(jié)合，而野生型分子信標(biāo)與正常的基因特異結(jié)合。
[0015] 本發(fā)明的檢測(cè)原理為：在基因突變位點(diǎn)兩側(cè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并在突變位 點(diǎn)序列處設(shè)計(jì)兩個(gè)分子信標(biāo)，突變型分子信標(biāo)、野生型分子信標(biāo)，野生型分子信標(biāo)與未突變 序列結(jié)合，突變型分子信標(biāo)與突變位點(diǎn)序列結(jié)合。兩個(gè)分子信標(biāo)分別用不同顏色的熒光基 團(tuán)標(biāo)記，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，在PCR退火階段，野生型分子信標(biāo)與未突變的序列結(jié) 合，而突變型分子信標(biāo)與有突變位點(diǎn)的序列結(jié)合，在結(jié)合后，熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，此時(shí) 發(fā)出的熒光被實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)儀記錄下來(lái)，通過(guò)熒光值增長(zhǎng)曲線來(lái)判斷所檢測(cè)基因的基 因型。此方法也可以多加幾對(duì)引物和探針對(duì)多個(gè)SNP位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒中的PCR 反應(yīng)混合物中包括有細(xì)胞裂解液，通常，PCR反應(yīng)都是以細(xì)胞中提取純化的DNA作為模板， 如果直接加入細(xì)胞提供模板，則在PCR過(guò)程中細(xì)胞裂解不徹底，并且細(xì)胞裂解之后的細(xì)胞 碎片以及一些蛋白酶會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)造成阻礙，容易造成實(shí)驗(yàn)失敗。而發(fā)明人在通過(guò)多次試 驗(yàn)，把細(xì)胞裂解液的成分以一定的比例混合加在PCR反應(yīng)混合液中，實(shí)現(xiàn)了直接以口腔細(xì) 胞為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而可在PCR反應(yīng)的過(guò)程中省略提純DNA的步驟，且避免污染樣 品，從而節(jié)約時(shí)間。細(xì)胞裂解液的作用是溶解細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，破壞分子間許多微弱的化學(xué) 鍵，分解一些蛋白酶，降低細(xì)胞裂解之后產(chǎn)生的雜質(zhì)對(duì)PCR反應(yīng)的影響，因此，在檢測(cè)時(shí)，可 直接取得口腔細(xì)胞作為模板進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞裂解液將口腔細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)溶解后， 分解蛋白酶并破壞化學(xué)鍵，得到所需DNA，這個(gè)過(guò)程僅需要約lh，可快速檢測(cè)出結(jié)果進(jìn)行分 析，進(jìn)而為臨床的快速診斷帶來(lái)依據(jù)，減小患者疾病治療風(fēng)險(xiǎn)。
[0016] 進(jìn)一步，所述的細(xì)胞裂解液的原料由十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚組成。 聚乙二醇辛基苯基醚是一種非離子型表面活性劑，十二烷基硫酸鈉是一種能夠使蛋白質(zhì)變 性的強(qiáng)陰離子去污劑。在細(xì)胞和分子生物學(xué)領(lǐng)域，十二烷基硫酸鈉，簡(jiǎn)稱SDS，經(jīng)常被用于核 酸抽提操作中破壞細(xì)胞壁及裂解核酸與蛋白復(fù)合物，在較高溫度下，破壞蛋白質(zhì)與DNA的 結(jié)合，使DNA釋放出來(lái)。聚乙二醇辛基苯基醚簡(jiǎn)稱Triton X-100,被用于分解蛋白酶，聚乙 二醇辛基苯基醚在基因工程中還用作限制性內(nèi)切酶的緩沖液的成分之一，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā) 明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)SDS和Triton X-100混合組成，可快速解決溶解樣品的問(wèn)題。
[0017] 進(jìn)一步，所述的 PCR 緩沖液為 5x Colorless Reaction Buffer。5x Reaction Buffer稱為5x無(wú)色反應(yīng)緩沖液。
[0018] 進(jìn)一步，PCR反應(yīng)混合液原料的終濃度為：
[0019] DNA聚合酶 0? 04-0.lU/uldNTPs0.l-〇. 5mM
[0020] 上游引物 0.2-0. 5uM
[0021] 下游引物 0.2-0. 5uM
[0022] 突變型分子信標(biāo)0? 2-0. 5uM
[0023] 野生型分子信標(biāo)0? 2-0. 5uM
[0024] 5x Colorless Reaction Buffer 0.5-1. 5x
[0025] MgC12 1-2. 5mM
[0026] 細(xì)胞裂解液的原料終濃度為：
[0027] 十二烷基硫酸鈉 0.005-0. 015 % w/v
[0028] 聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0. 03% w/v。
[0029] 由實(shí)驗(yàn)可知PCR反應(yīng)混合液的原料為上述范圍時(shí)，均可完成檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn) 確。
[0030] 進(jìn)一步，所述的PCR反應(yīng)混合液原料的終濃度為：
[0031] DNA 聚合酶 0? 08U/uldNTPs 0? 3mM
[0032] 上游引物0.4uM
[0033] 下游引物0.4uM
[0034] 突變型分子信標(biāo)0. 4uM
[0035] 野生型分子信標(biāo)0. 3uM
[0036] 5x Colorless Reaction Buffer lx
[0037] MgCl2 2mM
[0038] 細(xì)胞裂解液的原料