人PON1基因rs854560位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及測(cè)定單核巧酸多態(tài)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] SNP(單核巧酸多態(tài)性）是指單個(gè)核巧酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基 的置換、插入和缺失等形式?；蚨鄳B(tài)性是個(gè)體與生俱來的遺傳特征，不隨環(huán)境發(fā)生變化， 也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現(xiàn)，因此其應(yīng)用并不存在診斷和治療作用。
[0003] 基因多態(tài)性檢測(cè)在遺傳學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，舉例如下：1.研究物種起 源和進(jìn)化等遺傳學(xué)現(xiàn)象。根據(jù)基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進(jìn)化歷史， 闡明物種進(jìn)化關(guān)系。應(yīng)用于考古學(xué)中W確定古人類遺傳變異特征W及不同種群的親緣關(guān) 系。2.研究多態(tài)與種群親緣關(guān)系等遺傳學(xué)研究。多態(tài)亦與各種人體特征密切相關(guān)，包括身 高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可W用于疾病預(yù)防措施。通過研究人體 對(duì)毒物的耐受性，發(fā)現(xiàn)易于對(duì)某種毒物發(fā)生毒性作用的個(gè)體，及時(shí)避免該個(gè)體與毒物接觸， 保護(hù)該易感人群。例如，對(duì)準(zhǔn)備從事接觸苯等有機(jī)溶劑的人群進(jìn)行多態(tài)檢測(cè)，篩查出容易出 現(xiàn)血液毒性、神經(jīng)毒性等反應(yīng)的個(gè)體，令其遠(yuǎn)離苯等有機(jī)溶劑，保護(hù)此類易感人群免受毒物 侵害。4.藥理學(xué)中可W用于藥物選擇W及劑量確定。通過多態(tài)檢測(cè)可W判斷患病個(gè)體對(duì)某 種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物W免除其毒性作用。通過判斷個(gè)體對(duì)藥物效 果的反應(yīng)程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。
[0004] 對(duì)氧憐酶（paraoxonase，P0N)基因家族包括Ξ個(gè)成員：P0N1、P0N2和P0N3。其中 P0N1基因位于染色體7q21. 3,其表達(dá)的蛋白質(zhì)能水解對(duì)氮憐類有機(jī)憐化合物和高密度脂 蛋白上的氧化型憐脂。P0N1基因rs854560位點(diǎn)多態(tài)，在人群中存在兩種等位基因A和T， 形成Ξ種P0N1基因的基因型：AA型（人體基因組rs854560多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基 均為A)，AT型（人體基因組rs854560多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基分別為A和T)和TT 型（人體基因組rs854560多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為T)。 陽0化]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)（PCR-RFL巧技術(shù)是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn) 確、低成本測(cè)定SNP(單核巧酸多態(tài)性）基因型的經(jīng)典方法。該方法通過引物來對(duì)模板進(jìn)行 擴(kuò)增反應(yīng)，形成足夠數(shù)量和穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切和檢測(cè)酶切產(chǎn)物的片 段長(zhǎng)度，最終測(cè)定出SNP。P0N1基因rs854560多態(tài)位點(diǎn)采取PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，所 需內(nèi)切酶為化tl，CviAII，Nlalll等，其價(jià)格較昂貴，因此需要開發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的測(cè)定人P0N1基因rs854560 位點(diǎn)多態(tài)性的可靠手段。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種測(cè)定人P0N1基因rs854560位點(diǎn)多態(tài)性的方 法，包括：
[0008] 提供待測(cè)人基因組DNA;
[0009] 提供擴(kuò)增人PONl基因rs854560位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游 引物具有錯(cuò)配堿基C;
[0010] W所述待測(cè)人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)W 獲得含CCXTGG片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中X燈或A)為人P0N1基因rs854560位點(diǎn)上待定堿基 W(A或T)的互補(bǔ)堿基；
[0011] 提供限制性內(nèi)切酶；
[0012] 利用限制性內(nèi)切酶對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切（反應(yīng)）W獲得相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；W 及
[0013] 根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來確定人P0N1基因rs854560位點(diǎn)上的待定堿基W是A還是T，
[0014] 其中，限制性內(nèi)切酶為僅能夠切開CCATGG片段與CCTTGG片段之一的限制性內(nèi)切 酶。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物的錯(cuò)配堿基C與多態(tài)堿基W的 互補(bǔ)堿基X之間相隔一個(gè)堿基C。令人驚訝的是，如此設(shè)置錯(cuò)配堿基將使酶切反應(yīng)進(jìn)行得極 其順利，不會(huì)出現(xiàn)酶切不充分等現(xiàn)象。并且，如此設(shè)置上游引物錯(cuò)配堿基使PCR反應(yīng)進(jìn)行順 利，提高了PCR的靈敏度和特異度，運(yùn)可能與錯(cuò)配堿基后使得擴(kuò)增序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變有 關(guān)。
[0016] 在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基與W相鄰。例 如，下游引物末端可W是……CC等結(jié)構(gòu)。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，限制性內(nèi)切酶可W采用僅能切開CCATGG片段的 化〇1或其同裂酶。運(yùn)類化〇1酶價(jià)格低廉，能大大降低測(cè)定成本。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所得酶切產(chǎn)物包括Ξ種片段類型：具有總片段長(zhǎng)度的未切 斷擴(kuò)增產(chǎn)物、切斷后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物W及切斷后具有較短片段的擴(kuò)增產(chǎn)物（較短 片段通常不能有效觀測(cè)到）。通過觀測(cè)（判斷）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型來確定人P0N1 基因rs854560位點(diǎn)上的待定堿基W是A還是T。例如，在采用化〇1酶的情況下，根據(jù)總片 段和切斷后較長(zhǎng)片段運(yùn)兩個(gè)片段的觀察結(jié)果來進(jìn)行判斷：如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具 有總片段長(zhǎng)度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物，則待定堿基為A;如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具有較 長(zhǎng)片段（小于總片段長(zhǎng)度）的切斷產(chǎn)物，則待定堿基為T;如果觀察到上述二者，則待定堿 基既包括A又包括T。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，判斷（或觀測(cè)）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型是通過凝 膠電泳聯(lián)合紫外燈拍照后與參照?qǐng)D對(duì)比來進(jìn)行的。運(yùn)種情況下，優(yōu)選參照?qǐng)D是擴(kuò)增產(chǎn)物在 凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定時(shí)間后經(jīng)紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照?qǐng)D像位置和第二參照?qǐng)D 像位置，其中第一參照?qǐng)D像位置針對(duì)的是未切斷的總片段長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物，而第二參照?qǐng)D 像位置則針對(duì)的是切斷后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，本發(fā)明采用的參照?qǐng)D是由合成 的190bp和15化P兩個(gè)堿基片段同時(shí)經(jīng)凝膠電泳相同時(shí)間后紫外燈拍照而成。與常規(guī)DNA ladder的復(fù)合參照?qǐng)D相比，由于采用了僅具有兩個(gè)特定參照?qǐng)D像位置的參照?qǐng)D，本發(fā)明的 運(yùn)種方法能夠直觀快速地觀測(cè)或判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型，同時(shí)最大限度地避免了 誤判。酶切反應(yīng)后優(yōu)選將酶切產(chǎn)物濃縮1~2倍濃度后進(jìn)行電泳，增加圖像亮度，提高判斷 準(zhǔn)確性。
[0020] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過設(shè)計(jì)上游引物和下游引物的長(zhǎng)度而使得擴(kuò)增產(chǎn) 物的總片段長(zhǎng)度在lOObp至300bp之間，并且上游引物的片段長(zhǎng)度至少為35bp，優(yōu)選長(zhǎng)度 40~60bp(在該優(yōu)選區(qū)間擴(kuò)增反應(yīng)尤其順利充分），使得酶切切掉部分片段長(zhǎng)度占總片段 長(zhǎng)度的百分比超過20%。本發(fā)明的運(yùn)種設(shè)計(jì)可W使得具有總片段長(zhǎng)度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物 與切斷后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳紫外照片的位置區(qū)別顯著。但是，如果總片段過 長(zhǎng)，則電泳位移將不明顯；過短則圖像會(huì)變得模糊一片，無法準(zhǔn)確區(qū)分。上游引物的片段長(zhǎng) 度范圍保證了PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠順利進(jìn)行，避免了錯(cuò)配堿基時(shí)會(huì)出現(xiàn)的擴(kuò)增不足現(xiàn)象。 [002U 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過控制PCR擴(kuò)增程序中退火溫度的范圍在55~70°C 之間，優(yōu)選溫度60~69°C(該溫度可提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性），使得設(shè)計(jì)的PCR產(chǎn)物純度 較高。本發(fā)明的運(yùn)種設(shè)計(jì)可W使得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識(shí)別。但 是，如果溫度過低，則特異條帶少且雜帶過多，電泳后難W區(qū)分判斷；如果溫度過高，則影響 PCR擴(kuò)增效率使得特定擴(kuò)增產(chǎn)物過少，影響觀察效果。
[0022] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過控制PCR擴(kuò)增程序中延伸時(shí)間的范圍在10~60s 之間，優(yōu)選時(shí)間15~30s(該時(shí)間可提高擴(kuò)增反應(yīng)的效率和擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性），使得設(shè)計(jì) 的PCR反應(yīng)時(shí)間較短，擴(kuò)增產(chǎn)物純度較高。本發(fā)明的運(yùn)種設(shè)計(jì)可W使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清 楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識(shí)別，而且PCR時(shí)間較短。但是，如果時(shí)間過短，則特異條帶不能 完全擴(kuò)增