測(cè)定人NEFL基因rs2979704位點(diǎn)多態(tài)性的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及測(cè)定單核苷酸多態(tài)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] SNP(單核苷酸多態(tài)性）是指單個(gè)核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基 的置換、插入和缺失等形式?；蚨鄳B(tài)性是個(gè)體與生倶來(lái)的遺傳特征，不隨環(huán)境發(fā)生變化， 也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現(xiàn)，因此其應(yīng)用并不存在診斷和治療作用。
[0003] 基因多態(tài)性檢測(cè)在遺傳學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，舉例如下：1.研究物種起 源和進(jìn)化等遺傳學(xué)現(xiàn)象。根據(jù)基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進(jìn)化歷史， 闡明物種進(jìn)化關(guān)系。應(yīng)用于考古學(xué)中以確定古人類(lèi)遺傳變異特征以及不同種群的親緣關(guān) 系。2.研究多態(tài)與種群未緣關(guān)系等遺傳學(xué)研究。多態(tài)亦與各種人體特征密切相關(guān)，包括身 高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可以用于疾病預(yù)防措施。通過(guò)研究人體 對(duì)毒物的耐受性，發(fā)現(xiàn)易于對(duì)某種毒物發(fā)生毒性作用的個(gè)體，及時(shí)避免該個(gè)體與毒物接觸， 保護(hù)該易感人群。例如，對(duì)準(zhǔn)備從事接觸苯等有機(jī)溶劑的人群進(jìn)行多態(tài)檢測(cè)，篩查出容易出 現(xiàn)血液毒性、神經(jīng)毒性等反應(yīng)的個(gè)體，令其遠(yuǎn)離苯等有機(jī)溶劑，保護(hù)此類(lèi)易感人群免受毒物 侵害。4.藥理學(xué)中可以用于藥物選擇以及劑量確定。通過(guò)多態(tài)檢測(cè)可以判斷患病個(gè)體對(duì)某 種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物以免除其毒性作用。通過(guò)判斷個(gè)體對(duì)藥物效 果的反應(yīng)程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。
[0004] 神經(jīng)纖維絲（Neurofilaments,NFS)是真核生物細(xì)胞中主要的細(xì)胞骨架元素，主 要存在于神經(jīng)元中。其按分子量不同可分為三種亞單元，即分子量為68kd的低分子量 神經(jīng)纖維絲（Neurofilment,lightpolypeptide,NEFL)，150kd大小的中等大小分子量 神經(jīng)纖維絲（Neurofilament,mediumpolypeptide,NEFM),和 200kd的高分子量神經(jīng)絲 (Neurofilament,heavypolypeptid,NEFH)。每種亞單元都是單個(gè)基因產(chǎn)物，在細(xì)胞骨架中 起到重要的作用。
[0005] 低分子量神經(jīng)纖維絲基因又稱(chēng)為神經(jīng)纖維絲輕鏈基因，是近年來(lái)研究較多的一種 細(xì)胞骨架基因，定位于染色體8p21，有4個(gè)外顯子。有研究表明NEFL基因多態(tài)性可能與其 編碼的蛋白功能有關(guān)。NEFL基因rs2979704位點(diǎn)位于UTR-3區(qū)域，有研究表明該多態(tài)可能 影響NEFL的功能。
[0006] NEFL基因rs2979704位點(diǎn)多態(tài)，在人群中存在兩種等位基因C和T，形成三種NEFL 基因的基因型：CC型（人體基因組rs2979704多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為C)，CT型 (人體基因組rs2979704多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基分別為C和T)和TT型（人體基因 組rs2979704多態(tài)位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因堿基均為T(mén))。
[0007] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)（PCR-RFLP)技術(shù)是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn) 確、低成本測(cè)定SNP(單核苷酸多態(tài)性）基因型的經(jīng)典方法。該方法通過(guò)引物來(lái)對(duì)模板進(jìn) 行擴(kuò)增反應(yīng)，形成足夠數(shù)量和穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切和檢測(cè)酶切產(chǎn)物的 片段長(zhǎng)度，最終測(cè)定出SNP。目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有限制性?xún)?nèi)切酶可以識(shí)別含NEFL基因 rs2979704多態(tài)位點(diǎn)的堿基序列，不能采取PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。因此需要開(kāi)發(fā)新的 檢測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的測(cè)定人NEFL基因 rs2979704位點(diǎn)多態(tài)性的可靠手段。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種測(cè)定人NEFL基因rs2979704位點(diǎn)多態(tài)性的方 法，包括：
[0010] 提供待測(cè)人基因組DNA;
[0011] 提供擴(kuò)增人NEFL基因rs2979704位點(diǎn)附近序列的上游引物和下游引物，其中上游 引物具有錯(cuò)配喊基G;
[0012] 以所述待測(cè)人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)以 獲得含AGATYT片段或GATY片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中Y為人NEFL基因rs2979704位點(diǎn)上的待 定堿基C或T;
[0013] 提供限制性?xún)?nèi)切酶；
[0014] 利用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切（反應(yīng)）以獲得相應(yīng)的酶切產(chǎn)物；以 及
[0015] 根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來(lái)確定人NEFL基因rs2979704位點(diǎn)上的待定堿基Y是C還是 T，其中，限制性?xún)?nèi)切酶為僅能夠切開(kāi)AGATCT片段與AGATTT片段之一的限制性?xún)?nèi)切酶，或?yàn)?僅能夠切開(kāi)GATC或GATT片段之一的限制性?xún)?nèi)切酶。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物的錯(cuò)配堿基G與Y之間相隔兩 個(gè)堿基AT。令人驚訝的是，如此設(shè)置錯(cuò)配堿基將使酶切反應(yīng)進(jìn)行得極其順利，不會(huì)出現(xiàn)酶切 不充分等現(xiàn)象。并且，如此設(shè)置上游引物錯(cuò)配堿基使PCR反應(yīng)進(jìn)行順利，提高了PCR的靈敏 度和特異度，這可能與錯(cuò)配堿基后使得擴(kuò)增序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)可選實(shí)施例中，在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基與Y相鄰。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在所得擴(kuò)增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基不與Y相 鄰。例如，上游引物末端可以是……GAT、……GA等結(jié)構(gòu)。難以想象，具有這種設(shè)計(jì)的上游 引物竟然會(huì)進(jìn)一步大大促進(jìn)酶切反應(yīng)，這可能與擴(kuò)增結(jié)合力有某種關(guān)聯(lián)。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，限制性?xún)?nèi)切酶可以采用僅能切開(kāi)AGATCT片段的 BglII或其同裂酶。這類(lèi)BglII酶價(jià)格低廉，能大大降低測(cè)定成本。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所得酶切產(chǎn)物包括三種片段類(lèi)型：具有總片段長(zhǎng)度的未切 斷擴(kuò)增產(chǎn)物、切斷后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物以及切斷后具有較短片段的擴(kuò)增產(chǎn)物（較短 片段通常不能有效觀(guān)測(cè)到）。通過(guò)觀(guān)測(cè)（判斷）酶切產(chǎn)物所包含的片段類(lèi)型來(lái)確定人NEFL 基因rs2979704位點(diǎn)上的待定堿基是C還是T。例如，在采用Bglll酶的情況下，根據(jù)總片 段和切斷后較長(zhǎng)片段這兩個(gè)片段的觀(guān)察結(jié)果來(lái)進(jìn)行判斷：如果觀(guān)察到酶切產(chǎn)物只有一種具 有總片段長(zhǎng)度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物，則待定堿基為T(mén);如果觀(guān)察到酶切產(chǎn)物只有一種具有較 長(zhǎng)片段（小于總片段長(zhǎng)度）的切斷產(chǎn)物，則待定堿基為C;如果觀(guān)察到上述二者，則待定堿 基既包括C又包括T。
[0021] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，判斷（或觀(guān)測(cè)）酶切產(chǎn)物所包含的片段類(lèi)型是通過(guò)凝 膠電泳聯(lián)合紫外燈拍照后與參照?qǐng)D對(duì)比來(lái)進(jìn)行的。這種情況下，優(yōu)選參照?qǐng)D是擴(kuò)增產(chǎn)物在 凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定時(shí)間后經(jīng)紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照?qǐng)D像位置和第二參照?qǐng)D 像位置，其中第一參照?qǐng)D像位置針對(duì)的是未切斷的總片段長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物，而第二參照?qǐng)D 像位置則針對(duì)的是切斷后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，本發(fā)明采用的參照?qǐng)D是由合成 的156bp和121bp兩個(gè)堿基片段同時(shí)經(jīng)凝膠電泳相同時(shí)間后紫外燈拍照而成。與常規(guī)DNA ladder的復(fù)合參照?qǐng)D相比，由于采用了僅具有兩個(gè)特定參照?qǐng)D像位置的參照?qǐng)D，本發(fā)明的 這種方法能夠直觀(guān)快速地觀(guān)測(cè)或判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類(lèi)型，同時(shí)最大限度地避免了 誤判。酶切反應(yīng)后優(yōu)選將酶切產(chǎn)物濃縮1~2倍濃度后進(jìn)行電泳，增加圖像亮度，提高判斷 準(zhǔn)確性。
[0022] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)設(shè)計(jì)上游引物和下游引物的長(zhǎng)度而使得擴(kuò)增產(chǎn)物 的總片段長(zhǎng)度在100至300bp之間，并且上游引物的片段長(zhǎng)度至少為35bp，優(yōu)選長(zhǎng)度40~ 60bp(在該優(yōu)選區(qū)間擴(kuò)增反應(yīng)尤其順利充分），使得酶切切掉部分片段長(zhǎng)度占總片段長(zhǎng)度 的百分比超過(guò)20%。本發(fā)明的這種設(shè)計(jì)可以使得具有總片段長(zhǎng)度的未切斷擴(kuò)增產(chǎn)物與切斷 后具有較長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳紫外照片的位置區(qū)別顯著。但是，如果總片段過(guò)長(zhǎng)，則電 泳位移將不明顯；過(guò)短則圖像會(huì)變得模糊一片，無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分。上游引物的片段長(zhǎng)度范圍保 證了PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠順利進(jìn)行，避免了錯(cuò)配堿基時(shí)會(huì)出現(xiàn)的擴(kuò)增不足現(xiàn)象。
[0023] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)控制PCR擴(kuò)增程序中退火溫度的范圍在55~70°C 之間，優(yōu)選溫度60~69°C(該溫度可提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性），使得設(shè)計(jì)的PCR產(chǎn)物純度 較高。本發(fā)明的這種設(shè)計(jì)可以使得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清楚，無(wú)雜帶出現(xiàn)，易于電泳識(shí)別。但 是，如果溫度過(guò)低，則特異條帶少且雜帶過(guò)多，電泳后難以區(qū)分判斷；如果溫度過(guò)高，則影響 PCR擴(kuò)增效率使得特定擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)少，影響觀(guān)察效果。
[0024] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)控制PCR擴(kuò)增程序中延伸時(shí)間的范圍在10~60s 之間，優(yōu)選時(shí)間15~30s(該時(shí)間可提高擴(kuò)增反應(yīng)的效率和擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性），使得設(shè)計(jì) 的PCR反應(yīng)時(shí)間較短，擴(kuò)增產(chǎn)物純度較高。本發(fā)明的這種設(shè)計(jì)可以使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清 楚，無(wú)雜帶出現(xiàn)，易于電泳識(shí)別，而且PCR時(shí)間較短。但是，如果時(shí)間過(guò)短，則特異條帶不能 完全擴(kuò)增而使得擴(kuò)增產(chǎn)物較少，電泳后難以區(qū)分判斷；如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則增加非特異條帶的 出現(xiàn)幾率，出現(xiàn)雜帶影響觀(guān)察效果。
[0025] 在本發(fā)明中，PCR反應(yīng)成分可以包含DNA模板、上下游引物、TaqDNA polymerase(DNA聚合酶或亦可稱(chēng)作"Taq酶"）、緩沖液、Mg2+等。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例 中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)中可以使用TaqDNApolymerase及其TaqAntibody。TaqAntibody是 TaqDNApolymerase的單克隆抗體，其與TaqDNApolymerase結(jié)合后抑制DNA聚合酶活 性，兩者的親和力非常高，即使在65°C下仍然可以封閉TaqDNApolymerase的活性，因此 可以非常有效地抑制引物的非特異性退火及引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，具有極高的 擴(kuò)增靈敏度和特異性。TaqAntibody只需要在95°C加熱30s即可完全失活，釋放TaqDNA polymerase活性，保證了后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠順利進(jìn)行。