一種dpyd基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種DPYD基 因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 5-氟尿嘧啶（5-FU)是抗代謝類抗腫瘤藥，對(duì)增殖細(xì)胞有殺傷作用，廣泛用于胃腸 道腫瘤、乳腺癌以及頭頸部腫瘤等實(shí)體瘤的治療。二氫嘧啶脫氫酶(DH))是5-FU降解途徑中 的起始酶和限速酶，編碼DH)的基因一 DPYD基因內(nèi)等位基因的突變（IVS14+1G>A)是引起DPD 活性缺乏的原因之一。DH)活性降低可使5-FU的代謝減少、血藥濃度升高，可能增加患者發(fā) 生不良反應(yīng)的危險(xiǎn)性。IVS14+1G>A突變體的檢測(cè)作為5-FU類藥物使用前的例行篩查，可以 減少患者嚴(yán)重毒副反應(yīng)的發(fā)生（Andre B.P.van Kuilenburg.Clinical Cancer Research.2000,6:4705-4712)〇 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0003] 本實(shí)用新型的目的：提供一種DPYD基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，能較好的應(yīng)用于 DPYD基因 IVS14+1G>A多態(tài)性檢測(cè)，體積小，便于運(yùn)輸攜帶和使用，克服了目前對(duì)DPYD檢測(cè)特 異性不強(qiáng)，檢測(cè)成本高且方法較復(fù)雜的不足之處。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采用以下技術(shù)方案：
[0005] -種DPYD基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括:盒體（1)、 襯墊(2)，所述的襯墊(2)置于盒體（1)內(nèi)，襯墊(2)上設(shè)有的容器孔裝有多個(gè)裝有試劑的離 心管，分別為裝有PCR反應(yīng)液的離心管(3)、裝有陽(yáng)性對(duì)照1的離心管(4)、裝有陽(yáng)性對(duì)照2的 離心管(5)、裝有陽(yáng)性對(duì)照3的離心管(6)、裝有陰性對(duì)照的離心管(7)。
[0006] 試劑盒結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0007] 上述的裝有PCR反應(yīng)液的離心管為2ml離心管，裝有陽(yáng)性對(duì)照1、陽(yáng)性對(duì)照2、陽(yáng)性對(duì) 照3、陰性對(duì)照的可立凍存管均為0.5ml離心管。
[0008] 上述的PCR反應(yīng)液包括DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶）、引物、探針及Mg2 +，所述的探針為TaqMan MGB探針(美國(guó)Applied Biosystems公司生產(chǎn)）。
[0009] 優(yōu)選地，所述的陽(yáng)性對(duì)照包括陽(yáng)性對(duì)照1、陽(yáng)性對(duì)照2、陽(yáng)性對(duì)照3,所述的陽(yáng)性對(duì)照 1為含野生型純合子DPYD序列的質(zhì)粒，陽(yáng)性對(duì)照2為含突變體純合子DPYD序列的質(zhì)粒，陽(yáng)性 對(duì)照3為等比例混合的陽(yáng)性對(duì)照1和陽(yáng)性對(duì)照2。
[0010]根據(jù)所述的DPYD基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其主要特點(diǎn)是，所述的檢測(cè) 方法包括：
[0011] 1、加樣準(zhǔn)備:將待檢樣本的基因組DNA取5yL加入PCR反應(yīng)液45yL中待擴(kuò)增；
[0012] 2、PCR擴(kuò)增:進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并檢測(cè)熒光信號(hào)；
[0013] 3、分析結(jié)果:在同時(shí)滿足四個(gè)對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)的情況下，分析樣本檢測(cè)結(jié)果；
[0014]其中所述的熒光檢測(cè)步驟中將Base I ine設(shè)為3~15，熒光閾值設(shè)定原則為閾值線 剛好超過陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct值顯示為Undet。
[0015] 優(yōu)選地，所述的PCR擴(kuò)增步驟包括：
[0016] 1、樣品設(shè)置:在儀器軟件的相應(yīng)樣本設(shè)置窗口內(nèi)填寫各樣本的名稱。
[0017] 2、熒光通道選擇:每個(gè)樣品選擇FAM和VIC 2個(gè)通道。參比熒光設(shè)置為none。
[0018] 3、反應(yīng)條件設(shè)定:反應(yīng)體積設(shè)定為50yL，UNG酶反應(yīng)條件為37 °C加熱5分鐘，預(yù)變性 條件為95°C加熱5分鐘，變性條件為95°C，15秒，以及退火、延伸及檢測(cè)熒光條件為60°C，1分 鐘，共40個(gè)循環(huán)。
[0019] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的四個(gè)對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0020] 陰性對(duì)照:FAM通道和VIC通道無(wú)明顯擴(kuò)增曲線，且Ct顯示為Undet。
[0021] 陽(yáng)性對(duì)照I: VIC通道有擴(kuò)增曲線，且Ct〈36;FAM通道無(wú)明顯S型擴(kuò)增曲線，且Ct顯示 為Undet〇
[0022] 陽(yáng)性對(duì)照2: FAM通道有擴(kuò)增曲線，且Ct〈36; VIC通道無(wú)明顯S型擴(kuò)增曲線，且Ct顯示 為Undet〇
[0023] 陽(yáng)性對(duì)照3:FAM、VIC通道有典型的擴(kuò)增曲線，且Ct〈36;
[0024]上述四個(gè)條件必須同時(shí)滿足，否則，本次試驗(yàn)無(wú)效。
[0025]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的DPYD的基因多態(tài)性位點(diǎn)為IVS14+1G>A位點(diǎn)。
[0026]采用了該實(shí)用新型中的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，其優(yōu)點(diǎn)在于：
[0027] 1、降低耗材的使用以便降低檢測(cè)成本，采用本實(shí)用新型的方法在操作的全過程中 需要的耗材只有擴(kuò)增使用的八連管或96孔板以及移液器吸頭。
[0028] 2、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，降低假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，在擴(kuò)增步驟加入陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照， 以此可以有效提高對(duì)假陽(yáng)性和假陰性出現(xiàn)的判斷。
[0029] 3、對(duì)實(shí)驗(yàn)污染的有效減少，a.本實(shí)用新型采用熒光探針PCR方法，既將核酸的PCR 擴(kuò)增所用試劑組分一次性加入反應(yīng)管中并采用熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，為全封閉反應(yīng)檢 測(cè)環(huán)境;b.加入U(xiǎn)NG酶并以dUTP替代dNTP等PCR污染控制措施可有效防止PCR的污染;c.采用 TaqMan MGB探針以提高檢測(cè)特異性;用于檢測(cè)DPYD基因多態(tài)性的等位基因特異性核酸引物 和用于檢測(cè)DPYD基因多態(tài)性的寡核苷酸探針，探針為TaqMan MGB探針，TaqMan MGB探針與 傳統(tǒng)的TaqMan探針相比，其在擴(kuò)增檢測(cè)過程中可有效降低背景信號(hào)的干擾，因而測(cè)定的特 異性要好于傳統(tǒng)的TaqMan探針。因此，TaqMan MGB探針更適合用于鑒定點(diǎn)突變，提高檢測(cè)性 能，涉及到的引物和探針均可特異地與DPYD的IVS14+1G>A多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行雜交。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為本實(shí)用新型的DPYD基因檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031 ]圖2為本實(shí)用新型的雜合子樣本檢測(cè)結(jié)果圖；
[0032] 圖3為本實(shí)用新型的野生型純合子樣本檢測(cè)結(jié)果圖；
[0033] 圖4為本實(shí)用新型突變型純合子樣本檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 為了能夠更清楚地描述本實(shí)用新型的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)行進(jìn)一 步的描述。
[0035]本實(shí)用新型所述的DPYD基因多態(tài)性檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒組成如下：
[0037]本實(shí)用新型所述的DPYD基因 IVS14+1G>A位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)的檢測(cè)方法如下：
[0038] 1、從實(shí)用新型試劑盒中取出PCR反應(yīng)液，室溫解凍，完全融化后，輕輕振蕩混勻，并 作短暫離心備用。
[0039] 2、取待檢測(cè)全血樣本，常規(guī)提取DNA，取5yL作為模板。
[0040] 3、反應(yīng)液分裝，反應(yīng)體系為50yL，每反應(yīng)總體積(50yL) = PCR反應(yīng)液(45yL) +模板 (5yL)〇
[0041] 4、加樣，在準(zhǔn)備好試劑的PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照、待測(cè)樣本DNA、陽(yáng)性對(duì)照 各5yL，蓋緊管蓋后，瞬時(shí)低速離心。
[0042] 5、PCR 擴(kuò)增：
[0043] 5.1、樣品設(shè)置:在儀器軟件的相應(yīng)樣本設(shè)置窗口內(nèi)填寫各樣本的名稱、類型。
[0044] 5.2、熒光通道選擇：每個(gè)樣品選擇FAM和VIC 2個(gè)通道。參比熒光（Passive Reference)設(shè)置為none 〇
[0045] 5 · 3、反應(yīng)條件設(shè)定:37 °CUNG酶反應(yīng)5分鐘，95 °C預(yù)變性5分鐘，95 °C 15秒，60 °C 1分 鐘，擴(kuò)增反應(yīng)為40個(gè)循環(huán)。
[0046] 6、結(jié)果分析
[0047] ABI 7500熒光PCR儀:將Baseline設(shè)為3-15(根據(jù)實(shí)際情況，Baseline Cycler可在 一定范圍內(nèi)變化），熒光閾值(Threshold)設(shè)定原則以閾值線剛好超過陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線 (無(wú)規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct值顯示為Undet。使用儀器配套軟件自動(dòng)分析結(jié)果。
[0048] 7、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
[0049] 7.1、陰性對(duì)照:FAM通道和VIC通道無(wú)明顯擴(kuò)增曲線，且Ct顯示為Undet。
[0050] 7.2、陽(yáng)性對(duì)照I: VIC通道有擴(kuò)增曲線，且Ct〈36; FAM通道無(wú)明顯S型擴(kuò)增曲線，且Ct 顯示為Undet。
[0051 ] 7.3、陽(yáng)性對(duì)照2: FAM通道有擴(kuò)增曲線，且Ct〈36; VIC通道無(wú)明顯S型擴(kuò)增曲線，且Ct 顯示為Undet。
[0052] 7.4、陽(yáng)性對(duì)照3: FAM、VIC通道有典型的擴(kuò)增曲線，且Ct〈36。
[0053] 7.5、上述四個(gè)條件必須同時(shí)滿足，否則，本次試驗(yàn)無(wú)效。
[0054] 8、檢驗(yàn)結(jié)果解釋
[0055]在實(shí)驗(yàn)有效的前提下，結(jié)果分析如下：
L0057J 純合于野生型陽(yáng)性對(duì)照序列：
[0058] TGGCCCTGGACAAAGCTCCTTTCTGAATATTGAGCTCATCAGTGAGAAAACGGCTGCATATTGGTGTCAAAGTGTCA CTGAACTAAAGGCTGACTTTCCAGACAACGTAAGTGTGATTTAACATCTAAAACAAGAGAATTGGCATAAGTTGGTG AATGTTTATTTAAACATCCAAT
[0059] 純合子突變體陽(yáng)性對(duì)照序列：
[0060] TGGCCCTGGACAAAGCTCCTTTCTGAATATTGAGCTCATCAGTGAGAAAACGGCTGCATATTGGTGTCAAAGTGTCA CTGAACTAAAGGCTGACTTTCCAGACAACATAAGTGTGATTTAACATCTAAAACAAGAGAATTGGCATAAGTTGGTG AATGTTTATTTAAACATCCAAT
[0061 ] PCR擴(kuò)增所使用的引物序列：
[0063] 探針序列
[0065] PCR反應(yīng)液配方：
[0067] 本實(shí)用新型中對(duì)樣本的檢測(cè)結(jié)果如圖2(雜合子）、圖3(野生型純合子）、圖4(突變 體純合子)所示，結(jié)果分析依據(jù)【具體實(shí)施方式】7、8。圖中圓圈圈定部分為FAM通道檢測(cè)曲線； 方框圈定部分為VIC通道檢測(cè)曲線。
[0068]在此說(shuō)明書中，本實(shí)用新型已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以 作出各種修改和變換而不背離本實(shí)用新型的精神和范圍。因此，說(shuō)明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是 說(shuō)明性的而非限制性的。
[0069]綜上所述，本實(shí)用新型結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、設(shè)計(jì)合理、檢測(cè)過程不易受污染，該試 劑盒在DPYD基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)具有敏感性鈣、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短、方便運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種DPYD基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括:盒體（1)、襯 墊(2)，所述的襯墊(2)置于盒體（1)內(nèi)，襯墊(2)上設(shè)有的容器孔裝有多個(gè)裝有試劑的離心 管，分別為裝有PCR反應(yīng)液的離心管(3 )、裝有陽(yáng)性對(duì)照1的離心管(4 )、裝有陽(yáng)性對(duì)照2的離 心管(5)、裝有陽(yáng)性對(duì)照3的離心管(6)、裝有陰性對(duì)照的離心管(7)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DPYD基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述襯墊 (2)上的容器孔有5個(gè)，每個(gè)容器孔分別放置有裝有PCR反應(yīng)液的離心管(3)、裝有陽(yáng)性對(duì)照1 的離心管(4)、裝有陽(yáng)性對(duì)照2的離心管(5)、裝有陽(yáng)性對(duì)照3的離心管(6)、裝有陰性對(duì)照的 離心管(7)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種DPYD基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的襯 墊(2)上的容器孔分為兩排排列。
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種DPYD基因多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒,其包括盒體(1)、襯墊(2)，所述的襯墊(2)置于盒體(1)內(nèi)，襯墊(2)上設(shè)有的容器孔裝有多個(gè)裝有試劑的離心管，分別為裝有PCR反應(yīng)液的離心管(3)、裝有陽(yáng)性對(duì)照1的離心管(4)、裝有陽(yáng)性對(duì)照2的離心管(5)、裝有陽(yáng)性對(duì)照3的離心管(6)、裝有陰性對(duì)照的離心管(7)。該試劑盒可用于檢測(cè)DPYD基因IVS14+1G>A突變多態(tài)性，所述檢測(cè)的方法有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1/68, C12M1/34
【公開號(hào)】CN205313555
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201620052230
【發(fā)明人】卿志榮, 鄭幫
【申請(qǐng)人】上海睿玻生物科技有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年1月20日