利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)篩選白棉子葉衰老相關(guān)基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用甲基化敏感擴增多態(tài)性（MSAP）技術(shù)篩選白棉子葉衰老相關(guān)基因的方法。其步驟如下：待棉花幼苗長至10d左右，兩片子葉完全展開后，選取長勢一致的幼苗，分別用300、500和700mg·L-1的乙烯利涂抹子葉，同時對照用蒸餾水涂抹，經(jīng)過乙烯利處理5d后，提取子葉的基因組DNA；再通過MSAP分析，對回收的差異條帶純化和測序繼而進行功能分析。本發(fā)明利用MSAP技術(shù)，分析棉花子葉經(jīng)乙烯利處理后CCGG位點胞嘧啶甲基化水平和模式的變化，進而分離乙烯利誘導(dǎo)的甲基化差異片段，以期從基因組水平上揭示乙烯利調(diào)控棉花衰老的調(diào)控機制提供理論依據(jù)。
【專利說明】利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)篩選白棉子葉衰老相關(guān)基 因的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的涉及利用甲基化敏感擴增多態(tài)性（MSAP)技術(shù) 分析乙烯利處理對棉花子葉DNA的甲基化水平和甲基化模式變化的影響及衰老相關(guān)基因 的篩選。 技術(shù)背景
[0002] 在棉花實際生產(chǎn)中，葉片早衰是導(dǎo)致棉花產(chǎn)量減低的主要因素之一。棉田葉片早 衰可導(dǎo)致棉花減產(chǎn)1/5以上，棉花葉片的早衰不但影響了棉花的產(chǎn)量，還導(dǎo)致棉纖維品質(zhì) 下降，進而影響棉纖維的成紗質(zhì)量。因此，研究棉花葉片衰老，具有重要的理論和實際意義。
[0003] 棉花子葉具有生長期長，且當(dāng)真葉長出后，子葉會自然衰老脫落等優(yōu)點，在棉花子 葉生命周期中，子葉的衰老是一個基因遺傳調(diào)控的程序化過程，這個過程是伴隨著衰老相 關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)生的。
[0004] DNA甲基化是表觀遺傳修飾領(lǐng)域的重點內(nèi)容之一，廣泛存在于高等植物中，能夠調(diào) 控基因表達(dá)，進而調(diào)控植物的生長發(fā)育，并在植物處于逆境時發(fā)揮重要作用。目前有關(guān)DNA 甲基化的研究多集中于醫(yī)學(xué)、動物學(xué)等領(lǐng)域，而對植物DNA甲基化的相關(guān)研究是近些年來 開始受到重視，由于DNA甲基化在調(diào)節(jié)植物生命活動中的重要性，對植物DNA甲基化的研究 已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域所關(guān)注的熱點。
[0005] 甲基化敏感擴增多態(tài)性（methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)技術(shù)是在1997年由Reyna Lopez等人第一次報道，這項技術(shù)是在AFLP分子標(biāo)記技術(shù) 的基礎(chǔ)上衍生出來的，是基于PCR擴增的DNA甲基化多態(tài)性的檢測方法，即將標(biāo)準(zhǔn)的AFLP 分子標(biāo)記分析中使用的高頻酶Mse I，替換成了一對同裂酶Hpa II和Msp I，而此對同列 酶對甲基化識別位點敏感性不同，而其余操作與AFLP完全一樣。主要操作步驟包括基因 組DNA雙酶切、人工接頭連接、MSAP預(yù)擴增反應(yīng)、MSAP選擇性擴增反應(yīng)、聚丙烯酰胺凝膠電 泳、條帶統(tǒng)計分析等。MSAP可以檢測在DNA序列沒有發(fā)生變化時，基因組DNA的甲基化修 飾水平，又能夠?qū)NA特異性位點的甲基化狀態(tài)進行檢測。該技術(shù)的優(yōu)點在于：（1)不需 要知道被檢測植物DNA的遺傳信息，可用于DNA遺傳背景未知的生物。（2)操作相對簡便， 在AFLP技術(shù)體系的基礎(chǔ)上稍加改進，即可操作。（3)MSAP技術(shù)的引物設(shè)計簡單（4)多態(tài)性 豐富，可在植物全基因組范圍內(nèi)檢測CCGG位點的胞嘧啶甲基化變化，因此可提供豐富的甲 基，化位點信息。利用該技術(shù)，前人研究了多種植物在鹽、重金屬、干旱、低溫脅迫等逆境條 件下的DNA甲基化程度和甲基化狀態(tài)，但關(guān)于由乙烯利誘導(dǎo)棉花子葉衰老的基因組DNA甲 基化方面的研究還鮮有報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用甲基化敏感擴增多態(tài)性（MSAP)技術(shù)篩選由乙烯 利誘導(dǎo)的白棉子葉衰老相關(guān)基因的方法。
[0007] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0008] 利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)篩選白棉子葉衰老相關(guān)基因的方法，按如下步驟 進行：
[〇〇〇9] A.材料的處理
[〇〇1〇] 首先棉花種子經(jīng)濃硫酸脫絨后，用無菌水沖洗干凈，并用濾紙吸干表面水分，粒選 飽滿、正常發(fā)育的種子備用，然后通過沙培的方式培養(yǎng)，將種子植于育苗盤中，28°C培養(yǎng)箱 暗培養(yǎng)2d后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是12h/d的光照時間，45 μ mol ·πΓ2 · 的光照強度，溫度（30± 1) °C。待棉花幼苗長至lOd左右，兩片子葉完全展開后，分別用300、 500和700mg · I71的乙烯利涂抹長勢一致的幼苗子葉，每天上午10點和下午4點，分別涂 抹兩次，每個處理選取10株為一組，重復(fù)三次，同時對照用蒸餾水處理；經(jīng)過乙烯利處理5d 后，將棉花幼苗的子葉用經(jīng)過消毒的刀片切下，并保存于一 80°C冰箱中備用；
[0011] B.提取步驟A中子葉的基因組DNA ;
[0012] C.對所提取的棉花子葉基因組DNA進行雙酶切；
[0013] D.對酶切后的DNA模板進行連接；
[0014] E. MSAP預(yù)擴增反應(yīng)；
[0015] F. MSAP選擇性擴增反應(yīng)；
[0016] G.反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測，特異性條帶的回收；
[0017] H.回收條帶的純化、測序；
[0018] I.差異序列的功能分析。
[0019] 本發(fā)明步驟A中的乙烯利濃度為300、500和700mg · L'
[0020] 本發(fā)明步驟B中棉花子葉的基因組DNA的提取，采用改良的CTAB法。
[0021] 本發(fā)明步驟 C 中雙酶切體系為：DNA 模板（300-500) ng，（5-10) U EcoRI (Thermo)， 2yL10XBuffer EcoRI (500mM Tris-Hcl (pH7. 5), 100mM MgCl2, lOOOmM NaCl,0. 2 % Trition X-100, lmg/ml BSA)，加 ddH20 至 20μ L，反應(yīng)混合液在 37 °C 保溫（6-12)h，然 后65 °C水浴20min ;再將上一步的酶切產(chǎn)物進行第二步酶切，酶切反應(yīng)體系（30 μ L) 為，第一步酶切產(chǎn)物2(^1^，（5-10"邱3 11(或1^?1)，3 4 1^10\81^€61'了3叩〇(33〇1111 Tris-Ac (ρΗ7· 9)，lOOmM Mg-Ac，660mM K-Ac，lmg/ml BSA)，加 ddH20 至 30 μ L，反應(yīng)混合液在 37°C保溫（6-12)h，然后 65°C (Hpall)或 80°C (MspI)水浴 20min，備用。
[0022] 本發(fā)明步驟D中連接體系為：將雙酶切產(chǎn)物，加入（3-5) U T4DNA連接酶（Thermo)， 5pmol EcoRI 接頭，50pmol Hpall/MspI 接頭，4yL10XT4DNA Ligase Buffer，加 ddH20 至 40 μ L，（21-23) °C連接（8-12) h，產(chǎn)物稀釋10倍后備用。
[0023] 本發(fā)明步驟E中MSAP預(yù)擴增反應(yīng)體系為：(0.5-2) yL的連接產(chǎn)物稀釋液， (1. 5-3) μ L 的 2. 5mM dNTPs，（2-3. 5) μ L 的 10XPCR Buffer，（0· 5-2)U 的 Taq DNA 聚合酶， 預(yù)擴增引物 E0 和 H0 各（2. 5-10) μπιο?，加 ddH20 至 25μ LoPCR 條件為 95°C 5min ;95°C 30s， 56°C lmin，72°C lmin，20輪循環(huán)；72°C 10min，4°C終止。然后把預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋（10-100) 倍以備用。
[0024] 本發(fā)明步驟F中MSAP選擇性擴增反應(yīng)體系：(0.5-2) μ L的連接產(chǎn)物稀釋液， (1. 5-3) μ L 的 2. 5mM dNTPs，（2-3. 5) μ L 的 10XPCR Buffer，（0· 5-2)U 的 Taq DNA 聚合酶， 選擇性擴增引物（El - El 1和HI - H6)各（2· 5-10) μ mol，加 ddH20至25 μ L。PCR條件 為 95°C 5min ;95°C 30s，65°C (每輪循環(huán)減少 0· 7°C ) 30s，72°C lmin，12 輪循環(huán)；95°C 30s， 56°C 30s，72°C lmin，23 輪循環(huán)；72°C 10min，4°C終止。
[0025] 以上所用引物組合如表1所示：
[0026] 表1MSAP分析采用的接頭序列和引物序列
[0027]
【權(quán)利要求】
1. 一種利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)篩選白棉子葉衰老相關(guān)基因的方法，其特征在 于，按如下步驟進行： A. 材料的處理 首先棉花種子經(jīng)濃硫酸脫絨后，用無菌水沖洗干凈，并用濾紙吸干表面水分，粒選飽 滿、正常發(fā)育的種子備用，然后通過沙培的方式培養(yǎng)，將種子植于育苗盤中，28°C培養(yǎng)箱暗 培養(yǎng)2d后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是12h/d的光照時間，45 μ mol ·πΓ2 --Γ1的 光照強度，溫度（30±1)°C。待棉花幼苗長至10d左右，兩片子葉完全展開后，分別用300、 500和700mg · I71的乙烯利涂抹長勢一致的幼苗子葉，每天上午10點和下午4點，分別涂 抹兩次，每個處理選取10株為一組，重復(fù)三次，同時對照用蒸餾水處理；經(jīng)過乙烯利處理5d 后，將棉花幼苗的子葉用經(jīng)過消毒的刀片切下，并保存于一 80°C冰箱中備用； B. 提取步驟A中子葉的基因組DNA ; C. 對所提取的棉花子葉基因組DNA進行雙酶切； D. 對酶切后的DNA模板進行連接； E. MSAP預(yù)擴增反應(yīng)； F. MSAP選擇性擴增反應(yīng)； G. 反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測，特異性條帶的回收； H. 回收條帶的純化、測序； I. 差異序列的功能分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)篩選白棉子葉衰老相關(guān)基 因的方法，其特征在于，所述步驟A中的乙烯利濃度為300、500和700mg · L'
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)篩選白棉子葉衰老相關(guān)基 因的方法，其特征在于，所述步驟B中棉花子葉的基因組DNA的提取，采用改良的CTAB法。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)篩選白棉子葉衰老相關(guān) 基因的方法，其特征在于，所述步驟C中雙酶切體系為：DNA模板（300-500)ng，（5-10) U EcoRI (Thermo) ,2 μ L10XBuffer EcoRI (500mM Tris-Hcl (pH7. 5) , lOOmM MgCl2, lOOOmM NaCl，0.2%Trition X-100，lmg/ml BSA)，加 ddH20 至 20yL，反應(yīng)混合液在 37°C 保溫（6-12)h，然后65°C水浴20min ;再將上一步的酶切產(chǎn)物進行第二步酶切，酶切反應(yīng) 體系（30yL)為，第一步酶切產(chǎn)物 20yL，（5-10)U Hpall(或 MspI)，3yL10XBuffer Tango(330mM Tris-Ac(pH7.9)，100mM Mg_Ac，660mM K_Ac，lmg/ml BSA)，加 ddH20 至 30yL， 反應(yīng)混合液在37°C保溫（6-12)h，然后65°C (Hpall)或80°C (MspI)水浴20min，備用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)篩選白棉子葉衰老相關(guān)基 因的方法，其特征在于，所述步驟D中連接體系為：將雙酶切產(chǎn)物，加入（3-5) U T4DNA連接 酶（Thermo)，5pmol EcoRI 接頭，50pmol Hpall/MspI 接頭，4 μ L10XT4DNA Ligase Buffer， 加 ddH20至40 μ L，（21-23) °C連接（8-12) h，產(chǎn)物稀釋10倍后備用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)篩選白棉子葉衰老相關(guān)基 因的方法，其特征在于，所述步驟E中MSAP預(yù)擴增反應(yīng)體系為：(0. 5-2) μ L的連接產(chǎn)物稀 釋液，（1. 5-3) μ L 的 2. 5mM dNTPs，（2-3. 5) μ L 的 lOXPCRBuffer，（0· 5-2)U 的 Taq DNA 聚 合酶，預(yù)擴增引物E0和HO各（2. 5-10) μπιο?，加 ddH20至25yL。PCR條件為95°C 5min; 95°C 30s，56°C lmin，72°C lmin，20輪循環(huán)；72°C 10min，4°C終止。然后把預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋 (10-100)倍以備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用甲基化敏感擴增多態(tài)性（MSAP)技術(shù)篩選白棉子葉衰老 相關(guān)基因的方法，其特征在于，所述步驟F中MSAP選擇性擴增反應(yīng)體系：(0. 5-2) μ L的連 接產(chǎn)物稀釋液，（1. 5-3) μ L 的 2. 5mM dNTPs，（2-3. 5) μ L 的 10XPCR Buffer，（0· 5-2)U 的 Taq DNA聚合酶，選擇性擴增引物（El - Ell和HI -H6)各（2. 5-10) μπιο?，加 ddH20至 25 μ L。PCR 條件為 95°C 5min ;95°C 30s，65°C (每輪循環(huán)減少 0· 7°C ) 30s，72°C lmin，12 輪 循環(huán)；95°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，23 輪循環(huán)；72°C 10min，4°C終止； 以上所用引物組合如下表所示：
【文檔編號】C12Q1/68GK104087656SQ201410208965
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】郭寧, 席曉廣, 林毅, 蔡永平, 樊洪泓, 孫旭 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)