專利名稱：一種用于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶dna抽提方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家蠶DNA的抽提方法，具體涉及到一種適合于限制片段長(zhǎng) 度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽提方法。
背景技術(shù)：
限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類的研 究。這一技術(shù)的開展需要以個(gè)體作為研究對(duì)象，即需要抽提出個(gè)體內(nèi)髙純度和 髙濃度的DNA,用于RFLP的相關(guān)研究。
家蠶(So邁byx邁ori L.)是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是用于遺傳學(xué)及分子生物 學(xué)研究的模式昆蟲?，F(xiàn)有技術(shù)中，提取家蠶的DNA用于RFLP研究的技術(shù)主要 有以下幾種
(1) 常規(guī)的DNA抽提方法是將家蠶整頭一起進(jìn)行研磨。 由于蠶體含有大量蛋白、脂類及色素，抽提出的DNA純度較低(0026。/28。<
1.8)，進(jìn)行RFLP檢測(cè)時(shí)，限制性酶切往往切不徹底，不能進(jìn)行RFLP研究。
(2) 將多頭家蠶的后部絲腺混在一起進(jìn)行DNA抽提。
雖然DNA的量是達(dá)到了 RFLP研究的要求，但RFLP的研究需要DNA樣品來 源于個(gè)體而不是群體。
(3) 目前國(guó)內(nèi)有些實(shí)驗(yàn)室也嘗試從家蠶個(gè)體后部絲腺抽提DNA做RFLP,但 由于傳統(tǒng)的抽提方法在抽提過程DNA損失量過大，只有10[ig左右，不能對(duì)結(jié) 果進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，DNA的樣就用完了。
要開展對(duì)個(gè)體作為研究對(duì)象的RFLP檢測(cè)，需要優(yōu)化DNA的抽提方法，抽 提出高質(zhì)量(0026。/28。>1.9)的足夠多(100 Pg以上)的DNA樣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種適合于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽提方法，該方法能夠抽提出髙質(zhì)量，髙純度的家蠶DNA樣品用于RFLP研究。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種適合于限制片段長(zhǎng)度多 態(tài)性研究的家蠶DNA抽提的方法，包括解剖家蠶取出后部絲腺，從家蠶個(gè)體 的后部絲腺抽提DNA，再采用RNase酶消解RNA,所述解剖家蠶取出后部絲 腺的具體步驟為在無菌條件下解剖家蠶，取后部絲腺，經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗， 將后部絲腺研磨至粉末；其中，從后部絲腺抽提DNA和采用RNase酶消解 RNA的具體步驟為
(1) 采用DNA酶解緩沖液融化后部絲腺粉末，混勻后將溶液于48 55C水 浴裂解6 8小時(shí)；
(2) 加入與步驟(1)中溶液等體積的飽和酚，混勻后離心，取上清液；取與上 清液等體積的正丁醇與上清液混勻，離心后棄上清液，重復(fù)離心棄上清液的過 程至少1次，濃縮至O.lml以下；采用無水乙醇和醋酸鈉析出DNA，然后用 TE緩沖液溶解DNA，混勻后至少放置0.5小時(shí)
(3) 于35 39C水浴中，采用RNase酶處理步驟(2)中的DNA溶液，消解去 除RNA;加入與DNA溶液等體積的飽和酚，混勻后離心，除去下層的酚層， 再加入同樣體積的飽和酚，混勻后離心，取上清液；
(4) 取與步驟(3)中的飽和酚等體積的酚氯仿，與步驟(3)所得的上清液混勻后
離心，再取上清液，并取與之等體積的正丁醇混合均勻，離心后棄上清，重復(fù) 離心棄上清的過程至少1次，濃縮至0.1ml以下；采用無水乙醇和醋酸鈉析出 DNA,用70 75%的乙醇洗滌，溶解于TE緩沖液中。
上述技術(shù)方案中，所述磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)的成分和濃度為
氯化鈉NaCl 137mmol/L,
氯化鉀KC1 2.7mmol/L，
磷酸氫二鈉Na2HP04 4.3mmol/L,
磷酸二氫鉀KH2P04 1.4mmol/L;
所述DNA酶解緩沖液的組分和濃度為
蛋白酶K 0.2 mg/ml，
十二烷基硫酸鈉SDS 0.5% (重量比)，四乙酸二氨基乙烯EDTA 0.05M;
蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，它具有很髙的比活性， 可以用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解螯合劑EDTA等或SDS等去垢劑不 能使蛋白酶K失活，該酶在較廣的pH范圍內(nèi)(pH4 12.5)均有活性；上述方 案中的DNA酶解緩沖液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。
上述技術(shù)方案中，所述TE緩沖液的配置方法為在800ml水中依次加入 10ml的lmol/L的Tris-HCl(pH 8.0), 2ml的0.5 mol/L的EDTA (pH 8.0)，加 水定容至1L，分裝后髙壓滅菌。
上述技術(shù)方案中，所述混合操作使用的儀器為DNA混勻儀，轉(zhuǎn)速為10 rpm/min ，混合時(shí)間為10 30 min : 所述離心操作的轉(zhuǎn)速為4000 12000rpm/min，操作溫度為4'C ,離心時(shí)間為10min。
上述技術(shù)方案中，步驟(l)為DNA酶解過程，加入的DNA酶解緩沖液的 量為5ml，步驟(l)過程中每一個(gè)小時(shí)上下顛倒5 8次混勻樣品。
上述技術(shù)方案中，步驟(2)中用于析出DNA的無水乙醇和醋酸鈉為2.5ml 的-20'C的冰凍無水乙醇和O.lml的3mol/L的醋酸鈉；用于溶解DNA的TE 緩沖液為1.2ml;步驟(2)完成，即DNA抽提完成后，不能立即進(jìn)行RNase處 理時(shí)，需要放置0.5小時(shí)以上。
上述技術(shù)方案中，步驟(3)中采用RNase酶消解RNA時(shí)，于37'C水浴1 小時(shí)；RNase的濃度為10 mg/mL, RNase的量為1PL。
上述技術(shù)方案中，步驟(4)中所述酚氯仿中酚和氯仿的體積比為1: 1;用 于析出DNA的無水乙醇和醋酸鈉為0.25 ml的-20C的冰凍無水乙醇和IO叱 的3mol/L的醋酸鈉。步驟(4)完成后，將DNA樣品置于-20'C下保存，可長(zhǎng)期 保存；最后DNA樣品的濃度可通過測(cè)定OD26。進(jìn)行計(jì)算。
上述技術(shù)方案中，所述的酚(分子式C6H60， MW: 94.11)都是Tris 飽和酚(在酚中加了抗氧化劑8-羥基喹啉)。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
1. 本發(fā)明選取的材料是個(gè)體家蠶的后部絲腺，抽提出的DNA既具有個(gè)體 代表性，DNA的純度髙(OD26o,28。〉1.9);
2. 本發(fā)明在DNA抽提過程中，嚴(yán)格控制減少DNA的損失量，抽出的DNA量可達(dá)200 jig，可用于RFLP檢測(cè)200次。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實(shí)施例一 一種適合于RFLP研究的家蠶DNA抽提方法
(1) 解剖器材的準(zhǔn)備，包括，
醫(yī)用鑷子(12.5 cm)、解剖刀(12號(hào))、培養(yǎng)皿(9 cm)、離心管(15 mL)、 移液器及Tip頭、Eppendorf管(1.5mL)。
(2) 試劑的配制
DNA酶解緩沖液(0.2 mg/mL蛋白酶K， 0.5% SDS， 0.05M EDTA) PBS緩沖液(NaCl 137mmol/L， KC1 2.7mmol/L， Na2HP04 4.3mmol/L，
KH2P04 1.4mmol/L)
TE緩沖液(在800 mL水中依次加入1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 10 mL，
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 2 mL，加水定容至1 L，分裝后高壓滅菌。)
(3) 解剖
在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將經(jīng)72%乙醇消毒5分鐘的5齡第5天家蠶解剖，取 后部絲腺經(jīng)無菌PBS緩沖液沖洗后，放入已滅菌的研缽內(nèi)。
(4) DNA抽提
加入液氮至研缽容量的2/3，快速研磨至粉末。在研缽內(nèi)加入配制好的 DNA裂解緩沖液5 mL,完全融化后將混合液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，上下顛倒 5 8次混勻，置50'C水浴裂解6 8 h。
加入等體積飽和酚，經(jīng)DNA混勻儀混勻(10 rpm/min) 30 min后，12000 rpm/min 4"離心10 min后，將上清轉(zhuǎn)移至另 一新離心管中。
加入等體積的正丁醇后，經(jīng)DNA混勻儀混勻(10rpm/min) 10 min后， 4000 rpm/min 4'C離心10 min，棄上清，重復(fù)3次濃縮體系到lmL以下。
加入2.5mL冰凍(-20'C)的無水乙醇和0.1 mL 3M NaAc后，用玻璃棒鉤出 絮狀DNA沉淀，溶于1.2mlTE緩沖液，經(jīng)DNA混勾儀混勻(10rpm/min) 1 h后進(jìn)行RNA酶(RNase)處理。
(5) RNase處理將1.2 mL DNA溶液分成兩個(gè)1.5 mL的Eppendorf管(各0.6 mL)。加入 RNase ( 10 mg/mL)ljiL后，37"水浴lh。
加入0.6 mL飽和酚，經(jīng)DNA混勻儀混勻(10 rpm/min)30 min后，12000 rpm/min 4'C離心10 min后，吸去下層酚，再加入0.6 mL飽和酚重復(fù)一次， 取上清轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管。
加入新配的酚氯仿(體積比為1 : 1)混合液0.6 mL,經(jīng)DNA混勻儀混勻 (10 rpm/min) 30 min后，12000 rpm/min 4'C離心10 min后，取上清轉(zhuǎn)移至 新的Eppendorf管。
加入等體積的正丁醇后，經(jīng)DNA混勻儀混勻10 min后，4000 rpm/min 4 'C離心10min，棄上清，重復(fù)3次至體系到O.lmL以下。
加入0.25 mL冰凍的無水乙醇和10 3M NaAc后，用力震蕩Eppendorf 管，使DNA析出，玻璃鉤鉤出DNA沉淀，經(jīng)70。/。乙醇洗鹽兩次后，溶于0.2 mLTE, -20"0保存?zhèn)溆谩?br> (6)DNA的樣品濃度通過測(cè)定OD26。進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式如下
DNA濃度(U g / ml)= OD26。X稀釋倍數(shù)X50/1000
當(dāng)OD260=1.0
稀釋倍數(shù)=4000倍時(shí)
DNA濃度(li g / ml)=200 U g / ml
本發(fā)明選用最適合于DNA抽提的組織、采用的抽提方法科學(xué)、合理，減 少在抽提過程中DNA的損失，可從每頭蠶體抽提出髙純度(0026()/280 > 1.9)DNA 200 pg，可用于RFLP檢測(cè)200次，解決了目前以家蠶為材料的RFLP 研究DNA質(zhì)量不髙和抽提的DNA量過少的問題。
權(quán)利要求
1.一種用于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽提方法，包括解剖家蠶取出后部絲腺，從家蠶個(gè)體的后部絲腺抽提DNA，再采用RNA酶消解RNA，所述解剖家蠶取出后部絲腺的具體步驟為，在無菌條件下解剖家蠶，取后部絲腺，經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗，將后部絲腺研磨至粉末；其特征在于從后部絲腺抽提DNA和采用RNase酶消解RNA的具體步驟為(1)采用DNA酶解緩沖液融化后部絲腺粉末，混勻后將溶液于48～55℃水浴裂解6～8小時(shí)；(2)加入與步驟(1)中溶液等體積的飽和酚，混勻后離心，取上清液，提取DNA；取與上清液等體積的正丁醇與上清液混勻，離心后棄上清液，重復(fù)離心棄上清液的過程至少1次，濃縮至步驟(1)中溶液體積的 id="icf0001" file="A2008100968570002C1.tif" wi="4" he="10" top= "102" left = "139" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>以下；采用無水乙醇和醋酸鈉析出DNA，然后用TE緩沖液溶解DNA，混勻后至少放置0.5小時(shí)；(3)于35～39℃水浴中，采用RNase酶處理步驟(2)中的DNA溶液，消解去除RNA；加入與DNA溶液等體積的飽和酚，混勻后離心，除去下層的酚層，再加入同樣體積的飽和酚，混勻后離心，取上清液；(4)取與步驟(3)中的飽和酚等體積的酚氯仿，與步驟(3)所得的上清液混勻后離心，取上清液，并取與之等體積的正丁醇混合均勻，離心后棄上清，重復(fù)離心后棄上清的過程至少1次，濃縮至步驟(2)中的DNA溶液體積的 id="icf0002" file="A2008100968570002C2.tif" wi="4" he="10" top= "163" left = "164" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>以下；采用無水乙醇和醋酸鈉析出DNA，用70～75％的乙醇洗鹽洗滌，溶解于TE緩沖液中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽 提方法，其特征在于步驟(l)中加入的DNA酶解緩沖液的量為5ml，步驟(l) 的水浴裂解過程中每一個(gè)小時(shí)上下顛倒5 8次混勻樣品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽 提方法，其特征在于所述混合操作使用的儀器為DNA混勻儀，轉(zhuǎn)速為10 rpm/min,混合時(shí)間為10 30
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽 提方法，其特征在于所述離心操作的轉(zhuǎn)速為4000 12000rpm/min，操作溫 度為4'C，離心時(shí)間為10min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽提方法，其特征在于用于析出DNA的無水乙醇和醋酸鈉為-20'C的冰凍無水 乙醇和3mol/L的醋酸鈉，冰凍無水乙醇與醋酸鈉的體積比為25: 1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽 提方法，其特征在于步驟(2)中用于溶解DNA的TE緩沖液為1.2ml。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽 提方法，其特征在于步驟(3)中采用RNase酶消解RNA時(shí)，于37'C水浴1 小時(shí)RNase的濃度為10 mg/mL， RNase的量為1PL。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽 提方法，其特征在于步驟(4)中所述酚氯仿中酚和氯仿的體積比為1: 1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性研究的家蠶DNA抽提方法，以家蠶個(gè)體為研究對(duì)象，解剖后取后部絲腺；加入液氮后經(jīng)充分研磨后，充分酶解后，用酚進(jìn)行抽提后，用正丁醇濃縮后用乙醇進(jìn)行沉淀；RNase處理后，經(jīng)酚、氯仿抽提后，用正丁醇濃縮后用乙醇進(jìn)行沉淀。嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，每頭家蠶可抽提高純度DNA(OD_260/280＞1.9)200μg，可用于200次RFLP檢測(cè)。該發(fā)明解決了目前以家蠶為材料的RFLP研究DNA純度不高和抽提的DNA量過少的問題。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101314774SQ20081009685
公開日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2008年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日
發(fā)明者衛(wèi)正國(guó), 兵 李, 沈衛(wèi)德, 許雅香, 陳玉華 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)