專利名稱：人類str基因型檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)產(chǎn)品，特別是涉及一種人類STR基因型檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
人類基因組DNA有3×109bp，其中10％是串聯(lián)重復(fù)序列，稱為衛(wèi)星DNA。按重復(fù)單位的長(zhǎng)短，又可分為大衛(wèi)星、中衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星。其中重復(fù)單位僅由2-7mer組成的叫微衛(wèi)星，又稱它為短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeat.STR)。不同人體基因組衛(wèi)星DNA重復(fù)單位的數(shù)目是可變的，因此，形成了極其復(fù)雜的等位基因片段長(zhǎng)度多態(tài)性。根據(jù)這一規(guī)律，近年來(lái)建立了一種嶄新的STR基因分型技術(shù)，該技術(shù)可將不同個(gè)體進(jìn)行鑒別，并可進(jìn)行個(gè)體間的遺傳學(xué)分析，從而給法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、遺傳學(xué)以及腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展帶耒了新的變革。到目前為止，只有美國(guó)的PE和Promega兩家公司先后推出了一種STR基因型檢測(cè)試劑盒，但該類STR基因型檢測(cè)試劑盒重點(diǎn)是針對(duì)白種人群的STR位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，其對(duì)黃種人的STR基因型檢測(cè)的適用性比較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、準(zhǔn)確并且更適合黃種人的人類STR基因型檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明為解決上述問(wèn)題的技術(shù)方案是該試劑盒主要由DNA提取液、HS-Taq、上樣緩沖液、反應(yīng)混合物、引物混合物、Ladder、對(duì)照模板組成。
所述的DNA提取液、HS-Taq、上樣緩沖液、反應(yīng)混合物、引物混合物、Ladder組分為DNA提取液1.20ml×2支HS-Taq 200μl×1支11×上樣緩沖液 900μl×1支5×反應(yīng)混合物1.64ml×1支10×引物混合物A組D3S1358+TH01+D13S317 210μl×1支B組.TPOX+vWA+D7S820210μl×1支C組.XY+D8S1179+FGA 210μl×1支D組.D5S818+CSF1PO+D16S539 210μl×1支E組.D6S1043+D2S1772+D7S3048210μl×1支LadderA組.D3S1358+TH01+D13S317 110μl×1支
B組.TPOX+vWA+D7S820110μl×1支C組.XY+D8S1179+FGA 110μl×1支D組.D5S818+CSF1PO+D1 6S539 110μl×1支E組.D6S1043+D2S1772+D7S3048110μl×1支所述的試劑盒還包括內(nèi)標(biāo)，所述的DNA提取液、HS-Taq、上樣緩沖液、反應(yīng)混合物、引物混合物、Ladder組分為DNA提取液1.20ml×2支HS-Taq 50μl×1支11×上樣緩沖液 220μl×1支5×反應(yīng)混合物410μl×1支10×引物混合物 210μl×1支LadderA組.標(biāo)記的熒光素為T(mén)AMRAD3S1358+TH01+D13S317+D16S539+D6S1043 110μl×1支B組.標(biāo)記的熒光素為HEXTP0X+vWA+D7S820+D5S818+D2S1772 110μl×1支C組.標(biāo)記的熒光素為FAMXY+D8S1179+CSF1PO+FGA+D7S3048 110μl×1支內(nèi)標(biāo)由100～400bp組成，每?jī)蓚€(gè)片段之間相差20bp，標(biāo)記的熒光素為ROX 110μl×1支本發(fā)明對(duì)人類STR基因型的檢測(cè)，特別是對(duì)黃種人的人類STR基因型的檢測(cè)具有以下積極效果(1)所選用的STR位點(diǎn)大部分可在國(guó)際罪犯基因庫(kù)中通用，同時(shí)增加三個(gè)更適合中國(guó)人群的位點(diǎn)(D6S1043，D2S1772，D7S3048)，從而更具有適用性；(2)DNA提取方法，簡(jiǎn)單、快速、價(jià)格便宜，而且對(duì)人體和環(huán)境無(wú)污染；(3)檢測(cè)中國(guó)漢族的結(jié)果為PM＜10-18；RCP＞99.9999％。超過(guò)了國(guó)內(nèi)外規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)為PM＜10-11；RCP＞99.73％)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一在本實(shí)施例中，本發(fā)明是采用銀染技術(shù)檢測(cè)人類STR基因型的。
本試劑盒主要由DNA提取液、HS-Taq、上樣緩沖液、反應(yīng)混合物、引物混合物、Ladder、對(duì)照模板組成，其組分為DNA提取液1.20ml×2支HS-Taq 200μl×1支11×上樣緩沖液 900μl×1支5×反應(yīng)混合物1.64ml×1支10×引物混合物A組.D3S1358+TH01+D13S317 210μl×1支
B組.TPOX+vWA+D7S820 210μl×1支C組.XY+D8S1179+FGA 210μl×1支D組.D5S818+CSF1PO+D16S539210μl×1支E組.D6S1043+D2S1772+D7S3048 210μl×1支LadderA組.D3S1358+TH01+D13S317 110μl×1支B組.TPOX+vWA+D7S820 110μl×1支C組.XY+D8S1179+FGA 110μl×1支D組.D5S818+CSF1PO+D16S539110μl×1支E組.D6S1043+D2S1772+D7S3048 110μl×1支HS-Taq的制備本專利中使用的DNA聚合酶(HS-Taq)是熱啟動(dòng)酶，該酶是在制備普通Taq酶的基礎(chǔ)上，用抗酶抗體將酶的活性基團(tuán)封閉起來(lái)，使其在常規(guī)或稍高溫度下不具有酶的活性，只有經(jīng)過(guò)90多度的高溫處理，抗體蛋白質(zhì)變性后，酶的活性才得以恢復(fù)。
11X上樣緩沖液的配制55％溴酚蘭、55％二甲苯蘭、10mM NaOH、95％甲酰腰胺。
5×反應(yīng)混合物的配制反應(yīng)混合物中各組份之間的塔配和PH值將直接影晌到擴(kuò)增產(chǎn)物量的高低以及非特異擴(kuò)增帶的多少。特別是在復(fù)合擴(kuò)增體系中，鎂離子濃度最為最要。其調(diào)整程序如下1、調(diào)整復(fù)合體系中各引物對(duì)之間的最佳濃度。
2、將調(diào)整好的引物混合物和鎂離子濃度(一般設(shè)在1～5mM之間)進(jìn)行棋盤(pán)滴定。
3、根據(jù)滴定結(jié)果，在無(wú)非特異帶出現(xiàn)的前提下，選擇擴(kuò)增產(chǎn)量最高的鎂離子濃度和引物濃度為最后選定的濃度。
各引物之間濃度的塔配為了確保在同一擴(kuò)增體系中各位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物量大致相等，而且無(wú)非特異帶被擴(kuò)增，所以各引物之間濃度的塔配至關(guān)重要。各引物間濃度的塔配程序如下1、先用超純水或TE將合成的引物溶解成100～200PM。
2、成對(duì)的引物等體積混合后，分別稀釋成0.2；0.1；0.05；0.025PM/100μl反應(yīng)體積，在相同體系中進(jìn)行擴(kuò)增。
3、選擇無(wú)非特異帶、而且特異帶較清楚的引物濃度為初篩濃度。
4、在同一復(fù)合擴(kuò)增體系中，用各位點(diǎn)引物的初篩濃度進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。
5、根據(jù)各位點(diǎn)之間擴(kuò)增的產(chǎn)物量，以及非特異帶出現(xiàn)的情況，在對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)的引物濃度進(jìn)行增減。
6、一直調(diào)到每組中所有位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物量基本相等，而且無(wú)明顯非特異帶，方為合格。
制備對(duì)照模板用基因克隆技術(shù)將某一個(gè)人在本發(fā)明中十五個(gè)位點(diǎn)的所有等位基因片段克隆出來(lái)，然后將各等位基因片段的重組質(zhì)粒等量合并后分裝，作為對(duì)照模板。
循環(huán)參數(shù)的篩選1、本擴(kuò)增體系中所用的DNA聚合酶為熱啟動(dòng)酶(HS-Taq)，因此必須經(jīng)過(guò)較高溫度和較長(zhǎng)時(shí)間之后，才能恢復(fù)酶的活性，所以本專利中選定的預(yù)變性條件為96℃，5分鐘。這也是人類巨大而復(fù)雜的染色體徹底變性所需要的條件。
2、根據(jù)本專利中所選擇的各引物的TM值，確定60℃為退火溫度。
3、根據(jù)上述原則和常規(guī)程序，設(shè)定本專利的循環(huán)參數(shù)為96℃預(yù)變性5分鐘，然后95℃變性44秒；60℃退火40秒；72℃延伸1分鐘，循環(huán)5次。緊接著92℃變性30秒；60℃退火40秒；72℃延伸1分鐘，再循環(huán)25次。最后72℃保溫10分鐘。
Ladder的制備1、提取DNA。
2、從漢族中收集無(wú)任何血緣關(guān)系的檢材200份以上，分別用單位點(diǎn)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，從中篩選出每個(gè)位點(diǎn)的所有基因片段和內(nèi)標(biāo)中所需長(zhǎng)度的擴(kuò)增片斷。
3、按《PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》中第八章的程序，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆。
4、按《分子克隆》中文版第二版第19頁(yè)上的程序提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行純度和定量測(cè)定。
5、按基因擴(kuò)增技術(shù)制備各等位基因片段，然后對(duì)各種片進(jìn)行純化和定量測(cè)定。
6、將各等位基因片段分外進(jìn)行核酸序列分析，以測(cè)定各片段的大小和串聯(lián)單位的重復(fù)次數(shù)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)各等位基因片段按國(guó)際通用的法則進(jìn)行命名。
7、將各位點(diǎn)的等位基片段等量混合后，加入穩(wěn)定劑，并按適當(dāng)量進(jìn)行分裝。
本實(shí)施的檢測(cè)步驟以下一、DNA的提取不同檢材有不同的提取方法，其提取方法如下1、從全血中提取DNA取20μl抗凝血于0.5ml無(wú)菌管中，加500μl左右的超純水，混勻后，12000rpm離心2分鐘，棄上清，(若沉淀中仍有紅細(xì)胞，需重復(fù)此操作1-2次)加入DNA提取液20μl，混勻，100℃煮5分鐘(可在擴(kuò)增儀上進(jìn)行)后12000rpm離心5分鐘，取2μl上清到20μl反應(yīng)體積中進(jìn)行擴(kuò)增。
2、從其它有核細(xì)胞中提取DNA可直接加適量的樣品提取液到裝有發(fā)根、頭屑、骨髓、精斑、血痕和組織碎片等有核細(xì)胞的管中，100℃煮5分鐘(可在擴(kuò)增儀上進(jìn)行)后，12000rpm離心5分鐘，取上清進(jìn)行擴(kuò)增。
3、從附材上提取DNA用剪刀或其它銳器將帶有人類有核細(xì)胞的布料、紙屑、泥沙等檢材分割成小米大小后，放入0.5ml塑料離心管中，再加入本試劑中提供的DNA提取液使其全部淹沒(méi)，再置100℃煮5分鐘，然后取一小片(或小粒)煮過(guò)的附材直接放入PCR管中進(jìn)行擴(kuò)增二、按以下方法配制擴(kuò)增混合物，并進(jìn)行擴(kuò)增取一支離心管，加(反應(yīng)管數(shù)+1)×[(HS-Taq 0.4μl(用前必須用手指彈勻)+5×反應(yīng)混合物4μl+10×引物混合物2μl+超純水11.6μl)]，混勻后，每個(gè)反應(yīng)管分裝18μl，然后每個(gè)反應(yīng)管分別加提取的DNA 2μl和一滴石蠟油(若模板DNA濃度太低，可適當(dāng)增加其體積，但同時(shí)要減少超純水體積，以保持總反應(yīng)體積為20μl)，稍離心后進(jìn)行擴(kuò)增。
三、加2μl上樣緩沖液到擴(kuò)增產(chǎn)物中，混勻后準(zhǔn)備電泳。
四、用95％乙醇-0.5％乙酸溶液將粘膠劑稀釋100倍，然后用脫脂棉將其涂在干凈的玻璃板上，室溫下風(fēng)于后便可用于制膠。
五、將兩個(gè)邊條分別放在兩塊玻璃之間的兩邊，玻璃和邊條均在下緣對(duì)齊，各用兩個(gè)長(zhǎng)尾夾將邊條固定在玻璃板之間，夾子的著力點(diǎn)正好在邊條之上.以防玻璃變形，然后將長(zhǎng)玻璃朝下，并水平放在一個(gè)支架上，準(zhǔn)備灌膠。
六、加3滴TEMED及6滴10％AP到裝有15ml 6％PAG的小燒杯中，邊加邊搖(不能太用力，以免產(chǎn)生氣泡)，混勻后灌入夾層玻璃中(邊灌邊用手指敲擊玻璃，以防產(chǎn)生氣泡)，并盡快放好梳子。梳子插入膠中0.5cm左右即可。
七、待膠凝固一小時(shí)后，先松開(kāi)四個(gè)長(zhǎng)尾夾，并在短玻璃上緣兩邊各放一條塑料泡沫以填充短玻璃板比長(zhǎng)玻璃板短的那一部分，然后用四個(gè)長(zhǎng)尾夾將它們固定在電泳槽上(短玻璃朝內(nèi)，長(zhǎng)玻璃朝外)。然后用300V預(yù)電泳20分鐘。
八、上樣前慢慢取下梳子，并用電泳液沖洗電泳道。取2μl 11×上樣緩沖液到20μl擴(kuò)增產(chǎn)物中，充分混勻后，每道上樣3μl，每種Ladder也各上3μl。
九、上樣后600V電泳1小時(shí)左右，即藍(lán)色指示劑跑到距離膠的下緣3cm左右時(shí)，即可銀染色。
十、取下帶膠的玻璃板到固定液中搖10分鐘，倒掉固定液，用ddH2O漂洗兩遍，再加染色液(用前將2克AgNO3溶于1000ml ddH2O中，放室溫避光保存?zhèn)溆?搖15分鐘后，在10秒內(nèi)用ddH2O漂洗一遍，再用0.75M的NaOH漂洗一遍，然后立即加顯色液(在100ml0.75M的NaOH中加入甲醛800μl，現(xiàn)配現(xiàn)用)搖至核酸帶清楚為止(約15分鐘左右)。倒掉顯色液，用自來(lái)水充分漂洗后晾干，并觀察結(jié)果。
十一、從等位基因頻率統(tǒng)計(jì)表中(見(jiàn)中國(guó)漢族等位基因頻率統(tǒng)計(jì)表)查找相應(yīng)的基因頻率，并按實(shí)施例三的方法計(jì)算相應(yīng)的PM值和實(shí)施例四的方法計(jì)算相應(yīng)的RCP值。
實(shí)施例二在本實(shí)施例中，本發(fā)明是采用熒光法檢測(cè)人類STR基因型的。
本試劑盒主要由DNA提取液、HS-Taq、上樣緩沖液、反應(yīng)混合物、引物混合物、Ladder、內(nèi)標(biāo)、對(duì)照模板組成，其組分為DNA提取液 1.20ml×2支HS-Taq50μl×1支11×上樣緩沖液220μl×1支5×反應(yīng)混合物 410μl×1支10×引物混合物210μl×1支LadderA組.標(biāo)記的熒光素為T(mén)AMRAD3S1358+TH01+D13S317+D16S539+D6S1043 110μl×1支B組.標(biāo)記的熒光素為HEXTP0X+vWA+D7S820+D5S818+D2S1772 110μl×1支
C組.標(biāo)記的熒光素為FAMXY+D8S1179+CSF1PO+FGA+D7S3048110μl×1支內(nèi)標(biāo)由100～400bp組成，每?jī)蓚€(gè)片段之間相差20bp，標(biāo)記的熒光素為ROX 110μl×1支HS-Taq的制備、11X上樣緩沖液的配制、5×反應(yīng)混合物的配制、各引物之間濃度的塔配、Ladder的制備與實(shí)施例一相同，內(nèi)標(biāo)的制備與Ladder的制備相同。
本實(shí)施的檢測(cè)步驟以下一、DNA的提取不同檢材有不同的提取方法，其提取方法如下1、從全血中提取DNA取20μl抗凝血于0.5ml無(wú)菌管中，加500μl左右的超純水，混勻后，12000rpm離心2分鐘，棄上清，(若沉淀中仍有紅細(xì)胞，需重復(fù)此操作1-2次)加入DNA提取液20μl，混勻，100℃煮5分鐘(可在擴(kuò)增儀上進(jìn)行)后12000rpm離心5分鐘，取2μl上清到20μl反應(yīng)體積中進(jìn)行擴(kuò)增。
2、從其它有核細(xì)胞中提取DNA可直接加適量的樣品提取液到裝有發(fā)根、頭屑、骨髓、精斑、血痕和組織碎片等有核細(xì)胞的管中，100℃煮5分鐘(可在擴(kuò)增儀上進(jìn)行)后，12000rpm離心5分鐘，取上清進(jìn)行擴(kuò)增。
3、從附材上提取DNA用剪刀或其它銳器將帶有人類有核細(xì)胞的布料、紙屑、泥沙等檢材分割成小米大小后，放入0.5ml塑料離心管中，再加入本試劑中提供的DNA提取液使其全部淹沒(méi)，再置100℃煮5分鐘，然后取一小片(或小粒)煮過(guò)的附材直接放入PCR管中進(jìn)行擴(kuò)增二、以下方法配制擴(kuò)增混合物，并進(jìn)行擴(kuò)增取一支離心管，加(反應(yīng)管數(shù)+1)×[(HS-Taq 0.4μl(用前必須用手指彈勻)+5×反應(yīng)混合物4μl+10×引物混合物2μl+超純水11.6μl)]，混勻后，每個(gè)反應(yīng)管分裝18μl，然后每個(gè)反應(yīng)管分別加提取的DNA 2μl和一滴石蠟油(若模板DNA濃度太低，可適當(dāng)增加其體積，但同時(shí)要減少超純水體積，以保持總反應(yīng)體積為20μl)，稍離心后按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增96℃預(yù)變性5分鐘，然后95℃變性45秒；60℃退火40秒；72℃延伸1分鐘，循環(huán)5次。緊接著92℃變性30秒；60℃退火40秒；72℃延伸1分鐘，再循環(huán)25次。最后72℃保溫10分鐘。
三、分別用本發(fā)明中使用的四種熒光素(TAMRA，HEX，F(xiàn)AM，ROX)標(biāo)記物在PE 310、377或其型號(hào)的全自動(dòng)熒光核駿序列分析上作矩陣分析，以調(diào)整儀器的參數(shù)。
四、將內(nèi)標(biāo)分別三種熒光素標(biāo)記的Ladder按適當(dāng)比例混合后進(jìn)行電泳，然后將電泳后的用激光掃描的熒光數(shù)據(jù)記錄在電腦中。
五、將內(nèi)標(biāo)分別與每份檢材的擴(kuò)增產(chǎn)物按一定比例混合后，在相同條件下進(jìn)行電泳，然后在電腦中通過(guò)內(nèi)標(biāo)，將擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果與Ladder進(jìn)行比對(duì)，以得到每份檢材所屬的等位基因。
六、從等位基因頻率統(tǒng)計(jì)表中(見(jiàn)中國(guó)漢族等位基因頻率統(tǒng)計(jì)表)查找相應(yīng)的基因頻率，并按實(shí)施例三的方法計(jì)算相應(yīng)的PM值和實(shí)施例四的方法計(jì)算相應(yīng)的RCP值。
實(shí)施例三(人員個(gè)體識(shí)別)在STR-PCR基因分型的電泳圖譜上，純合子表現(xiàn)為一條特征帶，雜合子表現(xiàn)為兩條特征帶。根據(jù)H-W定律，在處于遺傳平衡的群體，純合子基因型頻率等于基因頻率的平方，雜合子基因型頻率等于兩基因頻率乘積的2倍。在個(gè)人識(shí)別鑒定中，當(dāng)二份物證材料的STR基因型不同時(shí)，可排除二份材料來(lái)源于同一個(gè)體。如果二份材料的STR基因型相同，則按上述方法計(jì)算偶合概率。聯(lián)合擴(kuò)增多個(gè)STR位點(diǎn)，二檢材的型別均相同，偶合概率PM為多個(gè)STR基因型頻率的乘積。下表為一實(shí)際案例的計(jì)算結(jié)果(表中的“n”代表串聯(lián)序列重復(fù)次數(shù))。
通過(guò)下表的計(jì)算說(shuō)明，用于比較的這兩份檢材不相同的可能性(即偶合概率PM)為7.5689×10-18。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明在全世界總?cè)丝?60億人)中不可能有第二個(gè)重復(fù)的可能性，從而可以認(rèn)定這兩份檢材來(lái)自同一個(gè)體。

實(shí)施例四(親子鑒定)1、原理判定親生關(guān)系的理論依據(jù)是孟德?tīng)栠z傳的分離律。按照這`一規(guī)律，在配子細(xì)胞形成時(shí)，成對(duì)的等位基因彼此分離，分別進(jìn)入各自的配子細(xì)胞。精、卵細(xì)胞受精形成子代，孩子的兩個(gè)基因組一個(gè)來(lái)自母親，一個(gè)來(lái)自父親；因此同對(duì)的等位基因也就是一個(gè)來(lái)自母親，一個(gè)來(lái)自父親。鑒定的結(jié)果如果符合該規(guī)律，則不排除親生關(guān)系，若不符合，則排除親生關(guān)系(變異情況除外)。
在大多數(shù)情況下，母、子關(guān)系是已知的，要求鑒定假設(shè)父和孩子是否親生關(guān)系。此時(shí)首先從母、子基因型的對(duì)比中，可以確定孩子基因中可能來(lái)自父親的基因(生父基因，OG)。然后觀察假設(shè)父親的基因型，如果不具有生父基因，則可排除假設(shè)父與孩子的親生關(guān)系。若假設(shè)父也具有生父基因，結(jié)果就不能排除假設(shè)父的親生關(guān)系，假設(shè)某案例中母親是vWA-16/17型，孩子為16/18型，從比較中可確定生父基因是vWA-18。此案中假設(shè)父1為vWA-14/20型；假設(shè)父2為vWA-14/18型。其中假設(shè)父1不具備生父基因vWA-18，故可排除他與孩子的親生關(guān)系；相比之下，假設(shè)父2因具有vWA-18，不排除與孩子有親生關(guān)系。
2、親權(quán)指數(shù)的計(jì)算上例中假設(shè)父2不能排除父子親生關(guān)系，但他不一定是孩子的生父，因?yàn)槿巳褐衯WA-18基因頻率為0.1908。雖然生父必須有生父基因，但有vWA-18基因的男人不一定就是孩子的生父。按照概率理論，具有生父基因的假設(shè)父和具有生父基因的隨機(jī)男人都有成為孩子生父的可能性。假設(shè)父提供生父基因成為孩子生父的可能性和隨機(jī)男人提供生父基因成為孩子生父的機(jī)會(huì)的比值叫作親權(quán)指數(shù)(paternity index，PI)。前一種可能性假設(shè)為X；后一種可能性假設(shè)為Y。上例中的假設(shè)父2基因型為vWA-14/18雜合子，他提供生父基因vWA-18的可能性為1/2，即X＝1/2。隨機(jī)男人提供生父基因vWA-18的機(jī)會(huì)為該基因的頻率，即Y＝0.1908。因此，此例的PI值為0.5/0.1908＝2.6208。如果假設(shè)父2的確是孩子的生父，則不論檢測(cè)多少位點(diǎn)，均不會(huì)排除他與孩子的親生關(guān)系，在所有檢測(cè)的位點(diǎn)，每一個(gè)位點(diǎn)都可以計(jì)算出一個(gè)PI值，多個(gè)位點(diǎn)的累計(jì)PI值等于各個(gè)位點(diǎn)PI值的乘積，但前提條件是所檢測(cè)的各位點(diǎn)之間沒(méi)有遺傳連鎖關(guān)系。
三聯(lián)體基因型組合的可歸納為三條原則(1)當(dāng)假設(shè)父為純合子時(shí)，X＝1；假設(shè)父為雜合子時(shí)，X＝1/2，但雜合子假設(shè)父的2個(gè)基因均可能是生父基因時(shí)，X＝1。(2)只涉及1個(gè)生父基因時(shí)，Y值等于生父基因的頻率。(3)若涉及2個(gè)生父基因時(shí)，Y值為2個(gè)生父基因頻率之和。
親子鑒定的PI值簡(jiǎn)易計(jì)算法可參照《親子鑒定DNA分型PI值簡(jiǎn)化計(jì)算法》。
例如某親子鑒定案檢測(cè)結(jié)果如下

經(jīng)過(guò)14個(gè)基因座檢測(cè)，均不排除孩子與AF有親生關(guān)系，可計(jì)算出這14個(gè)基因座的PI值。然后各值相乘得到此案的累計(jì)PI值為9657145.0995。
2、父子關(guān)系相對(duì)機(jī)會(huì)(relative chance of paternity，RCP)上述計(jì)算出的PI值是一個(gè)絕對(duì)值，為使鑒定結(jié)果能夠以概率形式表達(dá)父子關(guān)系的相對(duì)機(jī)會(huì)，PI值須轉(zhuǎn)換成一種相對(duì)值RCP。計(jì)算出PI值后，RCP＝[PI/PI+1]×100％。按照國(guó)內(nèi)外親子鑒定的慣例，當(dāng)RCP值大于99.73％時(shí)，則可以認(rèn)為假設(shè)父與孩子具有親生關(guān)系。如果RCP值達(dá)不到99.73％，應(yīng)該增加檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)直至RCP大于99.73％為止。本試劑盒提供的九個(gè)基因座均是高多態(tài)性的，上例中檢測(cè)這9個(gè)STR基因座都不能排除父子關(guān)系，RCP值為99.9999％，該值已大大超過(guò)99.73％?？梢哉J(rèn)定AF-C是親生關(guān)系。親子鑒定DNA分型PI值簡(jiǎn)化計(jì)算法表1.AF-C-M三聯(lián)體PI值
表2.二聯(lián)體AF-G的PI值 原則1.三聯(lián)體AF-C-M鑒定例(1)當(dāng)AF為純合子時(shí)，X＝1；AF為雜合子時(shí)，X＝1/2；但雜合子AF的2個(gè)基因均可能是生父基因時(shí)，X＝1。
(2)只涉及一個(gè)生父基因時(shí)，Y＝生父基因頻率。
(3)涉及2個(gè)生父基因時(shí)，Y＝2個(gè)生父基因頻率之和。
2.二聯(lián)體AF-C鑒定例將母親傳遞必需基因機(jī)會(huì)按隨機(jī)個(gè)體處理，即Xm＝(AF提供p機(jī)會(huì))×q+(AF提供q機(jī)會(huì))×pYm＝2pq
中國(guó)漢族等位基因頻率統(tǒng)計(jì)表





權(quán)利要求
1.一種人類STR基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒主要由DNA提取液、HS-Taq、上樣緩沖液、反應(yīng)混合物、引物混合物、Ladder、對(duì)照模板組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類STR基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的DNA提取液、HS-Taq、上樣緩沖液、反應(yīng)混合物、引物混合物、Ladder組分為DNA提取液 1.20ml×2支HS-Taq 200μl×1支11×上樣緩沖液 900μl×1支5×反應(yīng)混合物 1.64ml×1支10×引物混合物A組.D3S1358+TH01+D13S317 210μ1×1支B組.TPOX+vWA+D7S820 210μl×1支C組.XY+D8S1179+FGA 210μ1×1支D組.D5S818+CSF1PO+D16S539210μl×1支E組.D6S1043+D2S1772+D7S3048 210μl×1支LadderA組.D3S1358+TH01+D13S317 110μl×1支B組.TPOX+vWA+D7S820 110μl×1支C組.XY+D8S1179+FGA 110μl×1支D組.D5S818+CSF1PO+D16S539110μl×1支E組.D6S1043+D2S1772+D7S3048 110μl×1支
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類STR基因型檢測(cè)試劑盒，其特征在于它還包括內(nèi)標(biāo)，所述的DNA提取液、HS-Taq、上樣緩沖液、反應(yīng)混合物、引物混合物、Ladder組分為DNA提取液 1.20m1×2支HS-Taq 50μl×1支11×上樣緩沖液 220μl×1支5×反應(yīng)混合物 410μl×1支10×引物混合物 210μl×1支LadderA組.標(biāo)記的熒光素為T(mén)AMRAD3S1358+TH01+D13S317+D16S539+D6S1043 110μl×1支B組.標(biāo)記的熒光素為HEXTP0X+vWA+D7S820+D5S818+D2S1772110μl×1支C組.標(biāo)記的熒光素為FAMXY+D8S1179+CSF1PO+FGA+D7S3048 110μl×1支內(nèi)標(biāo)由100～400bp組成，每?jī)蓚€(gè)片段之間相差20bp，標(biāo)記的熒光素為ROX110μl×1支
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)產(chǎn)品，為一種人類STR基因型檢測(cè)試劑盒。本測(cè)試劑盒主要由DNA提取液、HS－Taq、上樣緩沖液、反應(yīng)混合物、引物混合物、Ladder、對(duì)照模板等組成。本發(fā)明與國(guó)外產(chǎn)品相比，更適合中國(guó)人群。檢測(cè)中國(guó)漢族的結(jié)果為PM＜10
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1506470SQ0215216
公開(kāi)日2004年6月23日 申請(qǐng)日期2002年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月9日
發(fā)明者張茲鈞 申請(qǐng)人:張茲鈞