HpychH4內切酶鑒定TERF1基因rs3863242多態(tài)性的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及測定單核巧酸多態(tài)性的方法。
【背景技術】
[0002] SNP(單核巧酸多態(tài)性）是指單個核巧酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基 的置換、插入和缺失等形式?；蚨鄳B(tài)性是個體與生俱來的遺傳特征，不隨環(huán)境發(fā)生變化， 也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現(xiàn)，因此其應用并不存在診斷和治療作用。
[0003] 基因多態(tài)性檢測在遺傳學領域和醫(yī)學領域中應用廣泛，舉例如下：1.研究物種起 源和進化等遺傳學現(xiàn)象。根據(jù)基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進化歷史， 闡明物種進化關系。應用于考古學中W確定古人類遺傳變異特征W及不同種群的親緣關 系。2.研究多態(tài)與種群親緣關系等遺傳學研究。多態(tài)亦與各種人體特征密切相關，包括身 高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預防醫(yī)學領域可W用于疾病預防措施。通過研究人體 對毒物的耐受性，發(fā)現(xiàn)易于對某種毒物發(fā)生毒性作用的個體，及時避免該個體與毒物接觸， 保護該易感人群。例如，對準備從事接觸苯等有機溶劑的人群進行多態(tài)檢測，篩查出容易出 現(xiàn)血液毒性、神經(jīng)毒性等反應的個體，令其遠離苯等有機溶劑，保護此類易感人群免受毒物 侵害。4.藥理學中可W用于藥物選擇W及劑量確定。通過多態(tài)檢測可W判斷患病個體對某 種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物W免除其毒性作用。通過判斷個體對藥物效 果的反應程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。
[0004] 端粒重復結合因子 1(telomericrepeatbindingfactor1,TERF1)是在端粒保 衛(wèi)蛋白復合體中首先被鑒定出來的端粒結合蛋白，TERFl基因位于染色體8q21. 11，相關研 究結果表明，TERFl與由細胞雙鏈DNA損傷導致的細胞周期檢驗點障礙和早衰有密切聯(lián)系。 TERFl基因rs3863242位點多態(tài)，在人群中存在兩種等位基因A和G，形成S種TERFl基因 的基因型：AA型（人體基因組rs3863242多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為A)，AG型（人 體基因組rs3863242多態(tài)位點的兩個等位基因堿基分別為A和G)和GG型（人體基因組 rs3863242多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為G)。
[0005] 聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態(tài)（PCR-RFL巧技術是一種快速、簡便、準 確、低成本測定SNP(單核巧酸多態(tài)性）基因型的經(jīng)典方法。該方法通過引物來對模板進 行擴增反應，形成足夠數(shù)量和穩(wěn)定的擴增產(chǎn)物，通過對擴增產(chǎn)物的酶切和檢測酶切產(chǎn)物的 片段長度，最終測定出SNP。目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有限制性內切酶可W識別含TERFl基因 rs3863242多態(tài)位點的堿基序列，不能采取PCR-RFLP技術進行檢測，需要開發(fā)新的檢測技 術。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的測定人TERFl基因 rs3863242位點多態(tài)性的可靠手段。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種測定人TERFl基因rs3863242位點多態(tài)性的 方法，包括：
[0008] 提供待測人基因組DNA;
[0009] 提供擴增人TERFl基因rs3863242位點附近序列的上游引物和下游引物，其中下 游引物具有錯配堿基A;
[0010] W所述待測人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進行PCR擴增反應W 獲得含AYGT片段，其中Y燈或C)為人TERFl基因rs3863242位點上的待定堿基R(A或G) 的互補堿基；
[0011] 提供限制性內切酶；
[0012] 利用限制性內切酶對所得擴增產(chǎn)物進行酶切（反應）W獲得相應的酶切產(chǎn)物；W 及
[0013] 根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來確定人TERFl基因rs3863242位點上的待定堿基R是A還是 G，其中，限制性內切酶為僅能夠切開ACGT片段與ATGT片段之一的限制性內切酶。
[0014] 另外，根據(jù)本發(fā)明，在所得擴增產(chǎn)物上，下游引物的錯配堿基A與多態(tài)R之間相隔 一個堿基C。令人驚訝的是，如此設置錯配堿基將使酶切反應進行得極其順利，不會出現(xiàn)酶 切不充分等現(xiàn)象。并且，如此設置下游引物錯配堿基使PCR反應進行順利，提高了PCR的靈 敏度和特異度，運可能與錯配堿基后使得擴增序列的二級結構改變有關。
[0015] 此外，本發(fā)明還通過設計上游引物和下游引物的長度而使得擴增產(chǎn)物的總片段長 度在100至300bp之間，并且下游引物的片段長度至少為35bp，優(yōu)選長度40~60bp(在該 優(yōu)選區(qū)間擴增反應尤其順利充分），使得酶切切掉部分片段長度占總片段長度的百分比超 過20%。本發(fā)明的運種設計可W使得具有總片段長度的未切斷擴增產(chǎn)物與切斷后具有較 長片段的擴增產(chǎn)物的電泳紫外照片的位置區(qū)別顯著。但是，如果總片段過長，則電泳位移將 不明顯；過短則圖像會變得模糊一片，無法準確區(qū)分。下游引物的片段長度范圍保證了PCR 擴增反應能夠順利進行，避免了錯配堿基時會出現(xiàn)的擴增不足現(xiàn)象。
[0016] 在本發(fā)明的具體實施例中，在所得擴增產(chǎn)物上，下游引物末端堿基與R相鄰。例 如，下游引物末端堿基可W是......AC等結構。
[0017] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，限制性內切酶可W采用僅能切開ACGT片段的 化yCH4IV或其同裂酶。運類化yCH4IV酶價格低廉，能大大降低測定成本。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所得酶切產(chǎn)物包括=種片段類型：具有總片段長度的未切 斷擴增產(chǎn)物、切斷后具有較長片段的擴增產(chǎn)物W及（通常不能有效觀測到的）切斷后具有 較短片段的擴增產(chǎn)物。通過觀測（判斷）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型來確定人TERFl基因 rs3863242位點上的待定堿基R是A還是G。例如，在采用化yCH4IV酶的情況下，根據(jù)總片 段和切斷后較長片段運兩個片段的觀察結果來進行判斷：如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具 有總片段長度的未切斷擴增產(chǎn)物，則待定堿基為A;如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具有較 長片段（小于總片段長度）的切斷產(chǎn)物，則待定堿基為G;如果觀察到上述二者，則待定堿 基既包括A又包括G。
[0019] 在本發(fā)明的一個實施例中，判斷（或觀測）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型是通過凝 膠電泳聯(lián)合紫外燈拍照后與參照圖對比來進行的。運種情況下，優(yōu)選參照圖是擴增產(chǎn)物在 凝膠電泳標準設定時間后經(jīng)紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照圖像位置和第二參照圖 像位置，其中第一參照圖像位置針對的是未切斷的總片段長度的擴增產(chǎn)物，而第二參照圖 像位置則針對的是切斷后具有較長片段的擴增產(chǎn)物。例如，本發(fā)明采用的參照圖是由合成 的166bp和127bp兩個堿基片段同時經(jīng)凝膠電泳相同時間后紫外燈拍照而成。與常規(guī)DNA ladder的復合參照圖相比，由于采用了僅具有兩個特定參照圖像位置的參照圖，本發(fā)明的 運種方法能夠直觀快速地觀測或判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型，同時最大限度地避免了 誤判。酶切反應后優(yōu)選將酶切產(chǎn)物濃縮1~2倍濃度后進行電泳，增加圖像亮度，提高判斷 準確性。
[0020] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過控制PCR擴增程序中退火溫度的范圍在55~70°C 之間，優(yōu)選溫度60~69°C(該溫度可提高擴增反應的特異性），使得設計的PCR產(chǎn)物純度 較高。本發(fā)明的運種設計可W使得PCR擴增產(chǎn)物條帶清楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識別。但 是，如果溫度過低，則特異條帶少且雜帶過多，電泳后難W區(qū)分判斷；如果溫度過高，則影響 PCR擴增效率使得特定擴增產(chǎn)物過少，影響觀察效果。
[0021] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過控制PCR擴增程序中延伸時間的范圍在10~60s 之間，優(yōu)選時間15~30s(該時間可提高擴增反應的效率和擴增產(chǎn)物的特異性），使得設計 的PCR反應時間較短，擴增產(chǎn)物純度較高。本發(fā)明的運種設計可W使PCR擴增產(chǎn)物條帶清 楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識別，而且PCR時間較短。但是，如果時間過短，則特異條帶不能 完全擴增而使得擴增產(chǎn)物較少，電泳后難W區(qū)分判斷；如果時間過長，則增加非特異條帶的 出現(xiàn)幾率，出現(xiàn)雜帶影響觀察效果。
[002引在本發(fā)明中，PCR反應成分可W包含DNA模板、上下游引物、Taq DNA polymerase (DNA聚合酶或亦可稱作"Taq酶"）、緩沖液、Mg2+等。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例 中，PCR擴增反應中可W使用！"aqDNA polymerase及其！"aqAntibody。Taq Antibody是 Taq DNA polymerase的單克隆抗體，其與！"aqDNA polymerase結合后抑制DNA聚合酶活 性，兩者的親和力非常高，即使在65°C下仍然可W封閉化q DNA polymerase的活性，因此 可W非常有效地抑制引物的非特異性退火及引物二聚體引起的非特異性擴增，具有極高的 擴增靈敏度和特異性。Taq Antibody只需要在95°C加熱30s即可完全失活，釋放化q DNA polymerase活性，保證了后續(xù)PCR擴增反應能夠順利進行。
[002引 PCR反應中可W加入抑值為8.1~8.7的Tris-肥1緩沖液，在72°C延伸反應時 調整PCR溶液抑值在6.8~7.8之間，從而使Taq酶在偏堿性環(huán)境中更好地發(fā)揮活性。另 夕F，PCR溶液中還可W加入明膠化01%) W減少PCR管對Taq酶的吸附作用，穩(wěn)定酶活性 及保護作用，促進PCR反應。
[0024] 另外，PCR溶液中Mg2+濃度在1. 5~2.Ommol/L之間時，可W很好地控制PCR反應 的產(chǎn)率和特異性。
[002引 PCR反應引物的終濃度一般為0. 1~1 iiM左右，濃度太高會導致非特異性擴增，太 低則擴增產(chǎn)物太少。
[0026] 此外，PCR反應中還可W加入助溶劑二甲亞諷值MS0)和硫酸錠W降低堿基錯配水 平，提高富含GC模板的擴增效率。運可能與消除引物和模板的二級結構，降低DNA解鏈溫 度使DNA變性完全有關。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于測定人TERFl基因rs3863242位點多態(tài) 性的試劑盒，其包含：
[0028] 用于PCR擴增人TERFl基因rs3863242位點附近序列的上游引物和下游引物，其 中下游引物具有錯配堿基AW獲得含AYGT片段的擴增產(chǎn)物，其中Y燈或C)為人TERFl基 因rs3863242位點上的待定堿基R(A或G)的互補堿基；W及
[0029] 僅能夠切開ACGT片段與ATGT片段之一的限制性內切酶。
[0030] 上述試劑盒中還可W包括其它成分，例如PCR反應Mix(包括4種dN