專利名稱：G6PC2基因3’區(qū)域上的rs16856187多態(tài)位點(diǎn)的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是一種f^^i"(葡萄 糖6磷酸酶催化亞單位2)基因3'區(qū)域上的rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)的檢測方法。
技術(shù)背景6^月2基因位于染色體2q24.3，該基因編碼的蛋白又稱胰島特異性葡萄糖 -6-磷酸相關(guān)蛋白(IGRP)，屬于G6PC家族。該蛋白催化葡萄糖-6-磷酸分解為葡 萄糖和磷酸的水解反應(yīng)。近期研究表明，G6PC2在胰島細(xì)胞中高表達(dá)，對葡萄糖 激酶催化的葡萄糖分解反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，且可能影響胰島素分泌。C^^i"基因 上的多態(tài)位點(diǎn)，如rsl6856187的研究有望成為糖尿病遺傳學(xué)研究的新熱點(diǎn)。為 適應(yīng)國際上糖尿病遺傳學(xué)研究的趨勢，目前迫切需要建立在大規(guī)模樣本中檢測 C^T2基因上多態(tài)位點(diǎn)的穩(wěn)定的方法。由于rsl6856187位點(diǎn)在白種人中十分罕 見，沒有檢測報(bào)道，在中國人群中也鮮有研究，因此國內(nèi)外尚未有對該位點(diǎn)進(jìn)行 大批量檢測的相關(guān)報(bào)道。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Sequenom公司在2005年針對MassARRAY iPlex技術(shù)公開發(fā)行了一份應(yīng)用指南《iPLEX Application Guide》，該指南提及， MassARRAY iPlex方法是一種新型的用于高通量SNP檢測方法，該方法利用單堿 基延伸和基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜測定SNP位點(diǎn)基因型，該指南描述了此技術(shù) 的操作方法，包括如下步驟基因組DNA模板的提??；設(shè)計(jì)特異性核酸引物擴(kuò)增 目的基因；測定SNP位點(diǎn)基因型等步驟。但是該方法對于SNP位點(diǎn)引物的設(shè)計(jì)只 描述了設(shè)計(jì)原則，并且無論是DNA的提取方法，還是引物設(shè)計(jì)的實(shí)際操作都使得 該方法在應(yīng)用到具體基因時(shí)存在一定局限性。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種C6尸6^基因3'區(qū)域上的 rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)的檢測方法。本發(fā)明建立了一種在大批量樣本中進(jìn)行C^尸C2 基因rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)快速檢測的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明涉及的一種"^Ti^基因3'區(qū)域 上的rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)的檢測方法，步驟包括
步驟一，從樣品中提取基因組DNA，以此作為DNA模板；
步驟二，設(shè)計(jì)一對可特異性擴(kuò)增出含SEQ ID NO. 1所示序列中第101位核 苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸引物，利用該對引物擴(kuò)增目的基因；
步驟三，測定rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測SEQ ID NO. 1所示序列第 101位是否存在C到A的單核苷酸多態(tài)性。
步驟二中，所述一對核酸引物長度為18bp-30bp。
步驟三中，所述測定為，用單堿基延伸和利用基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜 進(jìn)行測定。
本發(fā)明從樣品中提取基因組DNA，以此作為DNA模板；根據(jù)6^月2基因 rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對特異性核酸引物，擴(kuò)增目的基因；測定rsl6856187 多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測SEQ ID NO. 1所示序列第101位是否存在C到A的單核苷 酸多態(tài)性。
本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明建立了一種在大批量樣本中進(jìn)行6^尸Ci" 基因rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)快速檢測的方法，本發(fā)明可利用一臺(tái)MassARRAY iPLEX 設(shè)備，8小時(shí)內(nèi)完成768個(gè)樣本的rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)檢測。


圖1為6^P(2基因結(jié)構(gòu)及rs16856187多態(tài)位點(diǎn)示意圖2為基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜檢測rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)的結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于 下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)施方法，通常按照常規(guī)條件， 例如Sambrook等人所著分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例
圖1為^^P(2基因結(jié)構(gòu)及rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)示意圖，如圖所示，6^尸0" 基因包含5個(gè)外顯子，rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)位于6^尸(2基因3'端非翻譯區(qū)。6^月2基因3'區(qū)域上的rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)的檢測具體檢測步驟包括 步驟一，從樣品中提取基因組DNA，以此作為DNA模板 用常規(guī)酚氯仿法從樣品中提取基因組DNA，具體過程如下
(1) 取肝素抗凝的新鮮的人全血5ml，加入破膜液至總體積為50ml，破膜 液組成如下0. 32mmol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HC1、 5mmol/L MgCl2、 l%Triton-X 100，其中1000ml破膜液的配方為109. 5g蔗糖、10ml lMTris-HCl、 lml 5MMgCl2、 10ml Triton-X 100;充分混勻，于4000g離心10分鐘，棄去上清液，重復(fù)操作 一次；
(2) 在沉淀中加入含0. 075mol/L NaCl、 0. 024mol/L EDTA的溶液4. 5ml， 其中，1000ml該溶液的配方為4. 38gNaCl、 240ml 0. 1MEDTA，充分混勻，再加入 蛋白酶K lmg, 5%SDS 0.5ml,其中，5%SDS的配制為:5gSDS加水至100ml;輕 輕混勻，得到混合溶液，上述過程均在4'C條件下操作；將混合溶液于37'C消化 過夜；
(3) 向混合溶液中加入5ml平衡的重蒸苯酚和5ml體積比為24:1的氯仿-異戊醇，搖10分鐘，于4000g離心10分鐘，棄去下層有機(jī)相；再加入5ml體積 比為24:1的氯仿-異戊醇，搖10分鐘，于4000g離心10分鐘，棄去下層有機(jī)相；
(5)加入0. 5ml 3mol/L醋酸鈉溶液及12. 5ml的-20。C的無水乙醇，用實(shí)心 玻璃棒撈起狀沉淀，取無水乙醇70ml加水稀釋至lOOml，用該乙醇溶液洗滌沉 淀一次，待酒精揮發(fā)后，將沉淀溶解于500ul TE緩沖液中，于4'C溶解過夜； 將DNA樣本原液混勻離心，用4倍原液體積的H20稀釋后，用BioPhotometer生 物分光光度計(jì)測定稀釋液濃度及OD260/OD280值，計(jì)算后將DNA樣本稀釋至 20ng/yl，儲(chǔ)存于微量離心管，使用印Motion移液工作站將稀釋好的樣本加入 384孔儲(chǔ)液板于4'C儲(chǔ)存。
步驟二，設(shè)計(jì)一對可特異性擴(kuò)增出含SEQ ID NO. 1所示序列中第101位核苷 酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸引物，利用該對引物擴(kuò)增目的基因
PCR擴(kuò)增目的基因，PCR及單堿基延伸在Mastercycler384孔熱循環(huán)儀 (Eppendorf)上進(jìn)行。
一對特異性核酸引物
PCR正向引物:5， -ACG TTG GAT GCA CAC CGT GAA TGA ACC TTC-3，， PCR反向引物5' -ACG TTG GAT GTG TTG GTG GCC TCA GTT TAC-3'，單堿基延伸引物5， -AAC CCC ATA CTA AAC TCC-3'。 PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，反應(yīng)體系及步驟如下
反應(yīng)體系
PCR緩沖液為:0.625ul; 10mM dNTP為:0.25yl;混合引物為lul; HotStarTaq酶為:0. lyl; DNA模板為:l.Oul; ddH20為:2.025ul;反應(yīng)體
系總體積為5Ul。 反應(yīng)步驟
94'C預(yù)變性為2 min:
進(jìn)入循環(huán)94。C變性為20s， 56"C退火為10s， 65匸延伸為30s，共45
個(gè)循環(huán)；
最后65匸延伸為3 min。
SAP反應(yīng)
反應(yīng)體系
SAP反應(yīng)緩沖液為O. 17U l;SAP酶為O. 30 U 1;PCR反應(yīng)混合液為5. 00 U 1; ddH20為1.53Ul;反應(yīng)體系總體積為7^1。 反應(yīng)步驟
37。C溫育40 min， 85。C加熱5 min。 通過上述反應(yīng)對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。
步驟三，測定rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測SEQ ID NO. 1所示序列第 101位是否存在C到A的單核苷酸多態(tài)性 單堿基延伸反應(yīng) 反應(yīng)體系
iPLEX緩沖液為:0.200"; iPLEX反應(yīng)終止液為:0.200yl; iPLEX酶為: 0.041yl;延伸引物液為0.804ul; SAP反應(yīng)后混合液為:7.000ul; d顯
為0. 755lU;反應(yīng)體系總體積為9. OOOnl。 反應(yīng)步驟
94。C預(yù)變性為30S;
進(jìn)入大循環(huán)94。C變性為5S，共40個(gè)大循環(huán)；
進(jìn)入小循環(huán)52。C退火為5s， 8(TC延伸為5s，共5個(gè)小循環(huán)； 72。C延伸為3 min。基于質(zhì)譜的SNP基因型檢測在MassARRAY Compact Analyzer (Sequenom) 上進(jìn)行，rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)基因型檢測和讀取，在每個(gè)反應(yīng)液中加入6 mg純 化樹脂，每個(gè)樣本加入16u 1水，沿384孔板長軸旋轉(zhuǎn)15min進(jìn)行純化反應(yīng)，384 孔反應(yīng)板4000 rpm離心5 min后，使用Nanodispenser點(diǎn)樣轉(zhuǎn)移至Spectro基 因芯片，在MassARRAY Analyzer Co卿act進(jìn)行SNP基因型檢測讀取?；|(zhì)輔助激 光解吸飛行質(zhì)譜檢測rsl2742393多態(tài)位點(diǎn)的結(jié)果示意圖如圖2所示，圖2中， 分布在位置l內(nèi)的樣本為A/A基因型，分布在位置2內(nèi)的樣本為A/C基因型，分 布在位置3內(nèi)的樣本為C/C基因型。
結(jié)果標(biāo)明，本發(fā)明的方法可利用一臺(tái)MassARRAY iPLEX設(shè)備，8小時(shí)內(nèi)完 成768個(gè)樣本的rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)檢測，W尸C 基因rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)在 3676例樣本中的檢測成功率達(dá)到96. 1%。序列表
〈110>上海交通大學(xué)
<120> 6Kft^基因3'區(qū)域上的rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)的檢測方法 〈160〉 1 <210> 1 <211〉 200 〈212〉醒
<213>人(Homo sapiens) <220>
<221〉 misc_feature <222> (101) <223> n=a或c 〈400〉 1
agtcatcaga actacattct agcctggccc tgcatxtaac cactaaaact ccagaaggcc 60 atttagtgtt ggtggcctca gtttacccag ttctcaactg nggagtttag tatggggtta 120 aaatggaeigg ttcattcacg gtgtgatatt cttcaactct gagggtctca ttcagtccaa 180 catattgtgc tttgtctctc 200
權(quán)利要求
1、一種G6PC2基因3’區(qū)域上的rs16856187多態(tài)位點(diǎn)的檢測方法，其特征在于，步驟具體為步驟一，從樣品中提取基因組DNA，以此作為DNA模板；步驟二，設(shè)計(jì)一對可特異性擴(kuò)增出含SEQ ID NO.1所示序列中第101位核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸引物，利用該對引物擴(kuò)增目的基因；步驟三，測定rs16856187多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測SEQ ID NO.1所示序列第101位是否存在C到A的單核苷酸多態(tài)性。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的C^^2基因3'區(qū)域上的rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)的 檢測方法，其特征是，步驟二中，所述一對特異性核酸引物長度為18bp-30bp。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的6W^2基因3'區(qū)域上的rsl6856187多態(tài)位點(diǎn)的 檢測方法，其特征是，步驟三中，所述測定具體為，用單堿基延伸和利用基質(zhì)輔 助激光解吸飛行質(zhì)譜進(jìn)行測定。
全文摘要
一種分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的G6PC2基因3’區(qū)域上的rs16856187多態(tài)位點(diǎn)的檢測方法，具體步驟為從樣品中提取基因組DNA，以此作為DNA模板；設(shè)計(jì)一對可特異性擴(kuò)增出含SEQ ID NO.1所示序列中第101位核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸引物，利用該對引物擴(kuò)增目的基因；測定rs16856187多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測SEQ ID NO.1所示序列第101位是否存在C到A的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明建立了一種在大批量樣本中進(jìn)行G6PC2基因rs16856187多態(tài)位點(diǎn)快速檢測的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101514371SQ200910046349
公開日2009年8月26日 申請日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者蓉 張, 王從容, 承 胡, 賈偉平, 陸靜毅 申請人:上海交通大學(xué)