專利名稱：新型癌癥標記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于癌癥中基因啟動子的超甲基化(hypermethylation)的新型標記物。更具體地說，本發(fā)明涉及一種測定在呼吸消化系統(tǒng)(aero-digestivesystem)內(nèi)是否發(fā)生腫瘤，或者測定受試者對這種腫瘤進行治療后是否復發(fā)的方法。本發(fā)明的方法包括測定一個或多個特定基因的啟動子區(qū)域/序列中CpG位點的甲基化狀態(tài)。本發(fā)明還涉及對這種甲基化的基因的使用和用來測定癌癥的診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
在人類癌癥中，受損的表觀遺傳學調(diào)節(jié)與基因突變同樣普遍。這些機理在數(shù)量上和質(zhì)量上發(fā)生了會導致選擇性生長優(yōu)勢的基因表達變化，而這可能產(chǎn)生癌性轉(zhuǎn)變的結(jié)果。在與轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)的基因啟動子內(nèi)的異常超甲基化的CpG島是癌癥中最常見的表觀遺傳學變化(epigenetic change)。由于疾病的早期測定可能提高大多類型癌癥的臨床療效結(jié)果，因此，對與癌癥有關(guān)的異常的基因甲基化的確定反映了具有前景的新型生物標記物。對于呼吸消化系統(tǒng)中的癌癥(包括結(jié)腸直腸癌)來說，開始的研究已經(jīng)確定了異常甲基化的DNA在患者血液和糞中的存在。由于對高危腺瘤和低危時期癌瘤進行早期測定的潛在臨床效應，已經(jīng)存在于良性腫瘤中且僅少見于正常粘膜中高頻率異常超甲基化的基因可能成為良好的候選診斷生物標記物。然而，通?，F(xiàn)有的用于呼吸消化系統(tǒng)癌癥的早期標記物的靈敏度和特異性依然很差，并且到目前為止，僅少量的實際被篩選用于甲基化的基因顯示了理想較高的靈敏度和特異性。根據(jù)馬勒等人(Muller et al.)和陳等人(Chen et al.)的報道,在VIM (波形蛋白)和SFRP2中發(fā)現(xiàn)了特異性超甲基化，并且最近在來自林德等人(Lind et al)的報道中提出ADAMTS1和CRABPl在結(jié)腸直腸腫瘤中具有高頻率的癌癥特異性超甲基化，而NR3C1的超甲基化頻率卻要低得多。林德等人還確定了 18種作為結(jié)腸直腸癌的潛在標記物的基因。在莫里等人(Mori et al.)的研究中，鑒于MAL的甲基化頻率低(對應于僅6%的甲基化(2/34樣品))，得出了林德等人所討論的18種候選基因之一的T細胞分化蛋白MAL可能不是合適的用于呼吸消化道癌癥的診斷生物標記物的結(jié)論。發(fā)明人對18種候選基因中的多個進行的進一步的分析也沒有產(chǎn)生推動性的結(jié)果=NDRGl在所有被分析樣品中未被甲基化；NR3C1雖然被甲基化，但是僅發(fā)生為非常低的頻率，而且在隨后的SDHA序列分析中不能證實該基因一致性，從而使其不適于作為癌癥發(fā)展的標記物?？偠灾?，不存在有這種啟示任何由林德等人所討論的基因可以對目前的癌癥檢測技術(shù)做出改進。因此需要這樣一組基因，其中的各個基因在癌癥中被高頻率且特異性地超甲基化。更具體地，需要這樣一組基因該基因在非侵入技術(shù)(例如涉及使用糞便樣品的技術(shù))，或在可以用在易于獲得的樣品材料(例如血液或粘液)上的技術(shù)中是有用的。這種基因組可以極大地改進對這些癌癥進行早期檢測的可能。最終的目標可以為開發(fā)對僅少數(shù)(例如兩種或三種)高頻率的基因標記物中的超甲基化作用進行測定的診斷測試。因此，需要確定其他的基因，在這些基因中，啟動子區(qū)域內(nèi)的CpG島在癌癥中以高頻率被超甲基化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明建立在發(fā)明人對以下的實現(xiàn)由林德等人確定為潛在標記物的特定基因亞群具有在呼吸消化癌癥中以非常高的頻率被甲基化的CpG位點。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一組用于癌癥(例如呼吸消化系統(tǒng)中的癌癥，特別是結(jié)腸癌和結(jié)腸直腸癌)的診斷標記物。該組標記物解決了用于癌癥的大多數(shù)已知標記物中甲基化低特異性和低頻率的問題。
因此，本發(fā)明的一方面涉及一種用來測定受試者是否已經(jīng)發(fā)生、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或者受試者在癌癥治療后是否復發(fā)的方法，該方法包括以下步驟a)測定從所述受試者獲得的樣品中的至少一個基因內(nèi)的啟動子區(qū)域、第一外顯子或內(nèi)含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，其中，所述基因選自由以下所組成的組中CNRIP1，例如由恩薩姆博(ensembl)(基因組結(jié)構(gòu)注釋數(shù)據(jù)庫)基因編號ENSG00000119865、恩垂茲(entrez)(美國國家生物技術(shù)信息中心提供的在線資源檢索系統(tǒng))編號25927所確定；SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定；FBNl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定；SNCA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000145335、entrez 編號 6622 所確定；和INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定。該方法還可以包括以下步驟b)與參照物比較甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)；和c)如果甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)高于參照物的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，則將所述受試者確定為可能發(fā)生了、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或在癌癥治療后復發(fā)，如果甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)低于所述參照物的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，則將所述受試者確定為不太可能發(fā)生了、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或在癌癥治療后復發(fā)。本發(fā)明的另一方面涉及一種用來測定受試者是否已經(jīng)發(fā)生、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或者受試者在癌癥治療后是否復發(fā)的方法，該方法包括以下步驟a)測定來自受試者的樣品內(nèi)的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)b)構(gòu)建得自健康人群樣品的所述至少一種基因的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)的百分位數(shù)圖；c)基于健康人群中測定的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)并基于患有癌癥人群中測定的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，構(gòu)建ROC (受試者操作特性)曲線；d)從ROC曲線中選擇所期望的靈敏度和特異性的結(jié)合；e)從百分位數(shù)圖測定相應于所測定的或選擇的特異性的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)；和f)如果樣品中的所述至少一種基因的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)等于或高于相應于期望的靈敏度/特異性結(jié)合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，則預測受試者可能患有癌癥，并且如果樣品中的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)低于相應于期望的靈敏度/特異性結(jié)合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，則預測受試者不太可能患有癌癥。 本發(fā)明還涉及用來測定癌癥的診斷試劑盒，該診斷試劑盒含有一個或多個寡核苷酸引物或一組或多組寡核苷酸引物，它們中的每一個與選自以下的基因的核苷酸序列互補CNRIPl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定；SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定；FBNl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定；SNCA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000145335、entrez 編號 6622 所確定；和INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的標記物的應用。因此，本發(fā)明進一步涉及一個或多個選自由以下所組成的組中的基因在診斷分析中的應用CNRIPl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定；SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定；FBNl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定；SNCA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000145335、entrez 編號 6622 所確定；和INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定；其中，對甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)進行評價，作為受試者是否發(fā)生了、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或受試者是否在癌癥治療后復發(fā)的指示物。此外，本發(fā)明涉及核酸序列在診斷分析中的應用，其中，所述核酸含有選自由以下所組成的組中的核酸序列A)由 SEQ ID NO. :6、SEQ ID NO. :7,SEQ ID NO. :9,SEQ ID NO. : 13、SEQ ID NO. : 14和SEQ ID NO. :16中的任意一個所定義的核酸序列；B)與所述A)中所定義的序列互補的核酸序列；C)所述A)或B)中所定義的核酸序列的子序列；D)與所述A)、B)或C)中所定義的序列至少75% —致的核酸序列其中，對甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)進行評價，作為受試者是否發(fā)生了、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或受試者是否在癌癥治療后復發(fā)的指示物。
本發(fā)明還提供了識別甲基化的核酸序列的抗體，所述核酸序列選自由以下所組成的組中A)由 SEQ ID NO. :6、SEQ ID NO. :7,SEQ ID NO. :9,SEQ ID NO. : 13、SEQ ID NO. : 14和SEQID NO. :16中的任意一個所定義的核酸序列；B)與所述A)中所定義的序列互補的核酸序列；C)所述A)或B)中所定義的核酸序列的子序列；D)與所述A)、B)或C)中所定義的序列至少75% —致的核酸序列。


圖1表示了代表性的甲基化特異性聚合酶鏈式反應，該聚合酶鏈式反應是由于對三種粘膜樣品、三種腺瘤和三種癌瘤中的MAL進行分析而進行的。泳道(lane) U中的可見PCR廣物說明了存在未被甲基化的等位基因，而泳道M中的PCR廣物說明了存在被甲基化的等位基因?？s寫A，腺瘤；C，癌瘤；N，正常粘膜；P0S，含有正常血液(針對未被甲基化樣品的對照)以及體外被甲基化的DNA (針對甲基化的樣品的對照)的陽性對照；NEG，陰性對照(含有水作為模板)；U，用于未被甲基化的MSP產(chǎn)物的泳道；M，用于被甲基化的MSP產(chǎn)物的泳道。本圖示出了兩組凝膠板的拼接(merge)，因為腺瘤在獨立的凝膠上電泳。圖2-4圖2-4示出了對最初被甲基化的細胞系進行表觀遺傳藥物(epigeneticdrug)處理之后的基因表達的上調(diào)。單獨使用脫甲基5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶核苷和與脫乙?；敢种苿┣乓志谹結(jié)合使用進行處理后，在結(jié)腸癌細胞系中發(fā)現(xiàn)了上調(diào)的CNRIPUINA和SPG20的mRNA表達。這些組分別(以線性比例的方式)示出了在單獨使用5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶核苷(IuM和10uM)、曲古抑菌素A以及結(jié)合使用這兩種藥物(I μ M的5-氮雜-2’ -脫氧胞嘧啶核苷和O. 5 μ M的曲古抑菌素Α)對六份結(jié)腸癌細胞系(即，ΗΤ29、SW48、HCT15、SW480.RK0以及LS1034)進行處理之后，該六份結(jié)腸癌細胞系中的CNRIP1、INA以及SPG20的相對表達值。兩種劑量(一種高，一種低)的5-氮雜-2’ -脫氧胞喃唳核苷在所有三個基因的相對表達值中產(chǎn)生類似的增大。這意味著，可以通過存在低劑量的5-氮雜-2’ -脫氧胞嘧啶核苷的情況下對它們進行培養(yǎng)來實現(xiàn)細胞系的脫甲基化，考慮到該藥物的細胞毒性，這是有利的。對于CNRIPl和INA而言，相比于單獨使用5-氮雜-2’ -脫氧胞嘧啶核苷和單獨使用曲古抑菌素A進行處理，這兩者的結(jié)合處理更加有效。結(jié)合處理還提高了 SPG20的表達，然而，可以通過單獨使用5-氮雜-2’ -脫氧胞嘧啶核苷進行處理來達到類似的或者更高的再活化。如所預期的，單獨使用脫乙?；敢种苿┣乓志谹進行處理不會提高CNRIP、INA或者SPG20的基因表達?？s寫AZA，5_氮雜-2’-脫氧胞嘧啶核苷；TSA，曲古抑菌素A。圖5示出了 MAL啟動子在正常結(jié)腸粘膜樣品和結(jié)腸直腸癌瘤中的甲基化狀態(tài)。圖中示出了甲基化特異性聚合酶鏈式反應的具有代表性的結(jié)果。泳道U中的可見PCR產(chǎn)物說明了存在未被甲基化的等位基因，而泳道M中的PCR廣物說明了存在被甲基化的等位基因。N,正常粘膜；c，癌瘤；Pos，陽性對照(未被甲基化的反應來自正常血液的DNA;甲基化反應體外被甲基化的DNA) ；Neg,陰性對照(含有水作為模板)；U，用于未被甲基化的MSP產(chǎn)物的泳道；M，用于被甲基化的MSP產(chǎn)物的泳道。圖6示出了 MAL啟動子中的位點特異性甲基化。對MAL啟動子進行亞硫酸氫鹽測序可以核實由甲基化特異性聚合酶鏈式反應所評價的甲基化狀態(tài)。附圖上部分是CpG位點經(jīng)兩個被分析的亞硫酸氫鹽測序的片段(即，A (右側(cè)的第-68至第+168)和B (左側(cè)的第-427至第-85))成功擴增之后的示意圖。轉(zhuǎn)錄起始位點由+1表示,垂直塊表示單個CpG位點的位置。兩個箭頭說明了 MSP引物的位置。對于附圖的下部分而言，實心圓表示被甲基化的CpG ;空心圓表示未被甲基化的CpG ;而具有斜杠的空心圓表示被部分甲基化的位點(除胸腺嘧啶之外，還存在大約20-80%的胞嘧啶)。位于所述附圖下部分右側(cè)的U、M和U/M的量列出了通過使用MSP分析所評價的各個細胞系的甲基化狀態(tài)?？s寫MSP，甲基化特異性PCR;s，正義；as，反義；U，未被甲基化的；M，被甲基化的；U/M，存在未被甲基化的和被甲基化的條帶。 圖7示出了 MAL啟動子的“亞硫酸氫鹽測序”。該圖為結(jié)腸癌細胞系中的MAL啟動子的代表性亞硫酸氫鹽測序電泳圖。所述亞硫酸氫鹽測序電泳圖覆蓋了相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的第+11至+15的CpG位點。CpG位點中的胞嘧啶由黑色箭頭表示，而已經(jīng)被轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶的胞嘧啶被標有紅色下劃線。在此所示的MAL啟動子測序電泳圖來自未被甲基化的V9P細胞系和超甲基化的ALA和 HCTl16。圖8示出了癌癥細胞系和結(jié)腸直腸癌瘤中的MAL表達。在體外模型中，MAL的啟動子超甲基化是與基因表達的減小或者喪失有關(guān)的。MAL定量基因表達被表不為兩個MAL分析(檢測各種剪切變體)的平均值與兩個內(nèi)源性對照(GUSB和ACTB )的平均值之間的比值。將該值乘以系數(shù)1000。以下示出了甲基化特異性聚合酶鏈式反應所評價的每個樣品各自的甲基化狀態(tài)。實心圓表不MAL啟動子超甲基化，空心圓表不未被甲基化的MAL,而具有斜杠的空心圓表示存在未被甲基化的等位基因和被甲基化的等位基因。將結(jié)腸直腸癌瘤被未被甲基化的組(n=3)和被超甲基化的組(n=13)，在此示出了中間表達式。在表I中能夠找到個體細胞系來源的組織。圖9示出在進行藥物治療之后MAL表達的上調(diào)。在單獨使用脫甲基5-氮雜_2’_脫氧胞嘧啶核苷和與脫乙?；敢种苿┣乓志谹結(jié)合使用進行處理之后，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞系中mRNA表達上調(diào)之后，MAL啟動子甲基化減小。上方組表明在單獨使用5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶核苷、單獨使用曲古抑菌素A、以及結(jié)合使用這兩種藥物進行治療之后，兩份結(jié)腸癌細胞系(HT29和HCT15)中的MAL的相對表達值(線性比例的方式)。下方組說明了相同樣品的MAL的MAP結(jié)果。泳道U中的可見PCR產(chǎn)物說明了存在未被甲基化的等位基因，而泳道M中的PCR產(chǎn)物說明了存在被甲基化的等位基因?？s寫AZA，5-氮雜-2’ -脫氧胞嘧啶核苷；TSA，曲古抑菌素A ;Pos，(未被甲基化的反應來自正常血液的DNA ;被甲基化的反應體外的被甲基化的DNA) ；Neg,陰性對照(含有水作為模板);U，用于未被甲基化的MSP產(chǎn)物的泳道；M，用于被甲基化的MSP產(chǎn)物的泳道。圖10示出了結(jié)腸直腸癌瘤中的MAL表達。在腎小管(A)中發(fā)現(xiàn)了 MAL的陽性細胞質(zhì)染色，而在心肌(B)中沒有發(fā)現(xiàn)任何染色，這與早期的報告(馬拉祖厄拉M等人，組織化學和細胞化學雜志 2003，51:665-674 (Marazuela M, et al J Histochem Cytochem2003，51:665-674))相符。結(jié)腸直腸癌瘤的上皮細胞為MAL陰性(C，D)，而在正常結(jié)腸組織中，會在上皮細胞和結(jié)締組織(E，F(xiàn))中發(fā)現(xiàn)MAL的細胞質(zhì)表達。所有圖像均通過使用40X透鏡(400X放大倍率)拍攝得到。下面，將對本發(fā)明進行更詳細的描述。
具體實施例方式定義除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常知曉的意思。雖然在實踐中或?qū)Ρ景l(fā)明進行的測試中可以使用于本文所描述類似或等價的任意的方法或材料，但是在此描述的優(yōu)選的方法和材料。為了本發(fā)明的目的，對以下術(shù)語進行定義表觀遺傳學(Epigentics)甲基化是一種表觀遺傳學變化，它被定義為不基于序列發(fā)生的通過細胞分裂而繼承的。甲基化本文中的“超甲基化”僅指高于參照物甲基化的甲基化。參照物甲基化是來自健康受試者樣品或正常組織中基因的甲基化。因此，甲基化的基因(而該基因在正常組織中未被甲基化)將被歸類為超甲基化?！凹谆癄顟B(tài)”是在至少一種核酸序列中一個或多個CpG位點內(nèi)存在或不存在甲基修飾的度量。應該理解的是，優(yōu)選在多份具體的目標基因中對一個或多個CpG位點的甲基化狀態(tài)進行測定?！凹谆健北磉_了在一份或多份目標基因或核酸序列中甲基化的量。該甲基化水平可以被計算為目標基因或核酸序列中甲基化的絕對度量。此外，“相對甲基化水平”可以被測定為相對于存在的DNA總量的甲基化的DNA的量，或被測定為相對于基因或核酸序列總份數(shù)的目標基因或核酸序列甲基化的份數(shù)。另外，“甲基化水平”可以被測定為在感興趣DNA段(DNA stretch )內(nèi)的甲基化的CpG位點的百分數(shù)。術(shù)語甲基化水平還包括了這樣的情況其中，在例如啟動子區(qū)域內(nèi)的一個或多個CpG位點被甲基化,但是甲基化的量低于擴增閾值(amplificationthreshoId)。因此，甲基 化水平可以是在感興趣基因中甲基化的量的估計值。本發(fā)明不以任何方式受到用來測量根據(jù)本發(fā)明的基因的甲基化狀態(tài)或甲基化水平的特定的類型的分析的限制。在一種事實方式中，如果感興趣基因的甲基化水平為15%_100%，例如50%_100%，更優(yōu)選為60-100%，更優(yōu)選為70-100%，更優(yōu)選為80%-100%，更優(yōu)選為90%_100%。因此，本發(fā)明的一種實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的基因的甲基化水平為80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。CpG“CpG位點”是DNA區(qū)域，其中，沿線性堿基序列長度方向上，胞嘧啶核苷酸緊接著鳥嘌呤核苷酸產(chǎn)生?！癈pG”表示的是被磷酸酯間隔開的胞嘧啶和鳥嘌呤，所述磷酸酯在DNA中將這兩個核苷酸連接在一起。“CpG”這一符號用來將緊鄰鳥嘌呤的胞嘧啶與鳥嘌呤進行堿基配對的胞嘧啶進行區(qū)分。CpG島可以被定義為至少200個堿基對的DNA連續(xù)視窗，其中，G :C含量至少為50%,且觀察到的超過預期頻率的CpG率的比例超過O. 6。然而，還可以以更嚴格的定義對它們進行定義500個堿基對的視窗(window)，其中G C含量至少為55%，并且觀察到的超過預期的CpG率至少為O. 65。啟動子區(qū)域或序列“啟動子區(qū)域或序列”包括了從給定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點向上游延長IOOObp的連續(xù)核酸序列，和從轉(zhuǎn)錄起始位點向下游延長300個堿基對的連續(xù)核酸序列。在這種序列表中，上游序列以小寫字母表示而下游序列以大寫字母表示。在序列的3’部分中，小寫字母表示內(nèi)含子序列。轉(zhuǎn)錄起始位點本發(fā)明涉及的“轉(zhuǎn)錄起始位點”是描述轉(zhuǎn)錄發(fā)生的點。轉(zhuǎn)錄可以在基因內(nèi)的一個或多個位點中發(fā)生，并且一個基因可以具有多個轉(zhuǎn)錄起始位點，它們中的一些可以對特定細胞類型或組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄具有特異性。核酸序列的甲基化基因是DNA中起到產(chǎn)生并對多肽鏈進行調(diào)控的區(qū)域?；虬ň幋a部分和非編碼部分，包括內(nèi)含子、外顯子、啟動子、起始子(initiator)、增強子、終止子、微RNA和其他調(diào)控元件。本文使用的“基因”表示的基因的至少一部分。因此，例如說，“基因”可以被認為是為了本發(fā)明目的的啟動子。所以，在本發(fā)明的一種實施方式中，一組基因中的至少一個成員含有整個基因的非編碼部分。在一種具體的實施方式中，基因的非編碼部分為啟動子。在另一種實施方式中，在全組基因中的所有成員含有基因的非編碼部分，例如但不限于，內(nèi)含子。在另一種具體實施方式
中，基因成員的非編碼部分為啟動子。在本發(fā)明的另一種實施方式中，一組基因中的至少一個成員含有基因的編碼部分。在另一種實施方式中，全組基因的所有成員含有基因的編碼部分。術(shù)語“核酸序列”指的是單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸的聚合物。“子序列”指的是整個序列中的任意部分。因此，子序列指的是較長的核酸序列(例如，多核苷酸)中氨基酸或核酸的連續(xù)序列。術(shù)語“序列一致性”指的是在兩個相同長度的核酸序列之間的同源性程度的定性度量。如果這兩個待比較序列長度不同，則必須將它們對齊以產(chǎn)生最佳的可能匹配，以允許插入間隔，或可選擇地在多肽序列或核苷酸序列的端部進行切斷。這種序列一致性可以按
權(quán)利要求
1.一種用來測定受試者是否已經(jīng)發(fā)生、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或者受試者在癌癥治療后是否復發(fā)的方法，該方法包括以下步驟 a)測定從所述受試者獲得的樣品中的至少一個基因內(nèi)的啟動子區(qū)域、第一外顯子或內(nèi)含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，其中，所述基因選自由以下所組成的組中 CNRIPl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定； SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定； FBNl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定； SNCA，例如由ensembl基因編號ENSG00000145335、entrez編號6622所確定；和 INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括以下步驟 b)與參照物比較甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)；和 c)如果甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)高于參照物的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，則將所述受試者確定為可能發(fā)生了、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或在癌癥治療后復發(fā)，如果甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)低于所述參照物的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，則將所述受試者確定為不太可能發(fā)生了、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或在癌癥治療后復發(fā)。
3.一種用來測定受試者是否已經(jīng)發(fā)生、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或者受試者在癌癥治療后是否復發(fā)的方法，該方法包括以下步驟 a)測定來自受試者的樣品內(nèi)的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)； b)構(gòu)建得自健康人群樣品的所述至少一種基因的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)的百分位數(shù)圖； c)基于健康人群中測定的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)并基于患有癌癥人群中測定的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，構(gòu)建ROC (受試者操作特性)曲線； d)從ROC曲線中選擇所期望的靈敏度和特異性的結(jié)合； e)從百分位數(shù)圖測定相應于所測定的或所選擇的特異性的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)；和 f)如果樣品中的所述至少一種基因的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)等于或高于相應于期望的靈敏度/特異性結(jié)合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，則預測受試者可能患有癌癥，并且如果樣品中的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)低于相應于期望的靈敏度/特異性結(jié)合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，則預測受試者不太可能或沒有患有癌癥。
4.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，至少一種附加標記物的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)得到測定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述至少一種附加標記物選自由以下所組成的組中CNRIP1，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定； SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定；FBN1，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定；SNCA，例如由ensembl基因編號ENSG00000145335、entrez編號6622所確定；和 INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定；MAL，例如由ensembl基因編號ENSG00000172005所確定。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，該方法包括測定CNRIP1的甲基化水平、甲基化的CpG 位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，聯(lián)合測定至少一種附加標記物的甲基化水平、甲基 化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，所述一種附加標記物選自由以下所組成的 組中SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定；FBN1，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定；SNCA，例如由ensembl基因編號ENSG00000145335、entrez編號6622所確定；和 INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，該方法包括測定SPG20的甲基化水平、甲基化的CpG位 點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，聯(lián)合測定至少一種附加標記物的甲基化水平、甲基化 的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，所述一種附加標記物選自由以下所組成的組 中CNRIP1，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定； FBN1，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定；SNCA，例如由ensembl基因編號ENSG00000145335、entrez編號6622所確定；和 INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，該方法包括測定FBN1的甲基化水平、甲基化的CpG位 點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，聯(lián)合測定至少一種附加標記物的甲基化水平、甲基化 的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，所述一種附加標記物選自由以下所組成的組 中CNRIP1，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定； SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定；SNCA，例如由ensembl基因編號ENSG00000145335、entrez編號6622所確定；和 INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，該方法包括測定SNCA的甲基化水平、甲基化的CpG位 點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，聯(lián)合測定至少一種附加標記物的甲基化水平、甲基化 的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，所述一種附加標記物選自由以下所組成的組 中CNRIP1，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定； SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定；FBN1，例如由ensembl基因編號ENSG00000166147、entrez編號2200所確定；和 INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，該方法包括測定INA的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，聯(lián)合測定至少一種附加標記物的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)，所述一種附加標記物選自由以下所組成的組中 CNRIPl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定； SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定； FBNl，例如由ensembl基因編號ENSG00000166147、entrez編號2200所確定；和 SNCA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000145335、entrez 編號 6622 所確定。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，通過亞硫酸氫鹽測序、定量和/或定性的甲基化特異性聚合酶鏈式反應(MSP)、焦磷酸測序、DNA印跡法、基因組限制性酶切掃描法(RLGS)、單核苷酸引物延伸、CpG島微陣列、SNUPE、COBRA、質(zhì)譜，通過使用甲基特異性限制酶，通過測量所述基因的表達水平或它們的結(jié)合來對甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點甲基化狀態(tài)進行測定。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述甲基特異性聚合酶鏈式反應包括使用能夠與這樣的核酸序列雜交的核酸引物該核酸序列包括2個CPG位點和不在CpG位點內(nèi)的胞嘧啶殘基。
13.根據(jù)前述任意一項所述的方法，其中，所述癌癥選自由以下所組成的組中結(jié)腸直腸腫瘤、肺腫瘤(包括小細胞肺癌和/或非小細胞性肺癌)、食道腫瘤、胃腫瘤、胰腺腫瘤、肝腫瘤、膽囊和/或膽管的腫瘤、小腸腫瘤和大腸腫瘤。
14.根據(jù)前述任意一項所述的方法，其中，樣品得自血液、糞便、尿液、胸水、膽汁、支氣管液、口腔洗出液、組織活檢、腹水、膿、腦脊髓液、抽出物、濾泡液、組織或粘液。
15.根據(jù)前述任意一項所述的方法，該方法包括測定核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài),所述核酸序列包括選自由以下所組成的組中的序列A)由SEQ ID NO. :6、SEQ ID NO. :7,SEQ ID NO. :9,SEQ ID NO. :13,SEQ ID NO. :14 和SEQ ID NO. : 16中的任意一個所定義的核酸序列； B)與所述A)中所定義的序列互補的核酸序列； C)所述A)或B)中所定義的核酸序列的子序列； D)與所述A)、B)或C)中所定義的序列至少75%—致的核酸序列。
16.一種用來測定癌癥的診斷試劑盒，該試劑盒含有一個或多個寡核苷酸引物或者一組或多組寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物中的每一個與選自以下的基因的核苷酸序列互補 CNRIPl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定； SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定； FBNl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定； SNCA，例如由ensembl基因編號ENSG00000145335、entrez編號6622所確定；和 INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定。
17.—個或多個選自由以下所組成的組中的基因在診斷分析中的應用 CNRIPl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000119865、entrez 編號 25927 所確定；SPG20，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000133104、entrez 編號 23111 所確定； FBNl，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000166147、entrez 編號 2200 所確定； SNCA，例如由ensembl基因編號ENSG00000145335、entrez編號6622所確定；和 INA，例如由 ensembl 基因編號 ENSG00000148798、entrez 編號 9118 所確定； 其中，對甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)進行評價，作為受試者是否發(fā)生了、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或受試者是否在癌癥治療后復發(fā)的指示物。
18.核酸序列在診斷分析中的應用，其中，所述核酸含有選自由以下所組成的組中的核酸序列A)由SEQ ID NO. :6、SEQ ID NO. :7,SEQ ID NO. :9,SEQ ID NO. :13,SEQ ID NO. : 14 和SEQ ID NO. :16中的任意一個所定義的核酸序列； B)與所述A)中所定義的序列互補的核酸序列； C)所述A)或B)中所定義的核酸序列的子序列； D)與所述A)、A)或C)中所定義的序列至少75%—致的核酸序列； 其中，對甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)進行評價，作為受試者是否發(fā)生了、正在發(fā)生或易于發(fā)生癌癥、或受試者是否在癌癥治療后復發(fā)的指示物。
19.一種識別甲基化的核酸序列的抗體，所述核酸序列選自由以下所組成的組中A)由SEQ ID NO. :6、SEQ ID NO. :7,SEQ ID NO. :9,SEQ ID NO. :13,SEQ ID NO. :14 和SEQ ID NO. :16中的任意一個所定義的核酸序列； B)與所述A)中所定義的序列互補的核酸序列； C)所述A)或B)中所定義的核酸序列的子序列； D)與所述A)、B)或C)中所定義的序列至少75%—致的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型癌癥標記物。更具體地說，本發(fā)明涉及一種確定在呼吸消化系統(tǒng)內(nèi)是否發(fā)生腫瘤，或者對所述腫瘤進行治療后受試者是否復發(fā)的方法。本方法包括測定選自由CNRIP1、SPG20、FBN1、SNCA和INA所組成的組中一個或多個的基因的啟動子區(qū)域、第一外顯子或內(nèi)含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位點的數(shù)量或CpG位點的甲基化狀態(tài)。本方法還涉及用來測定呼吸消化道中的腫瘤的診斷試劑盒。
文檔編號C07K16/00GK103014155SQ201210495659
公開日2013年4月3日 申請日期2008年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月21日
發(fā)明者羅爾夫·I.·舍特海姆, 朗希爾德·A.·洛特, 古羅·E.·林德, 泰耶·C.·阿爾奎斯特 申請人:奧斯陸大學醫(yī)院Hf