專利名稱：早期癌癥腫瘤標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測早期癌癥的腫瘤標(biāo)記。
背景技術(shù)：
癌癥的發(fā)展或擴(kuò)大的程度可被描述為早期癌癥、中期癌癥和晚期癌癥。其中，早期癌癥一般被認(rèn)為是“癌癥進(jìn)展的程度是腫瘤小、轉(zhuǎn)移少并且能夠永久性治愈或通過治療能夠長期抑制的癌癥”。
早期癌癥基本上是沒有癥狀的。所以，當(dāng)試圖近乎完全地檢測早期癌癥時(shí)，要檢測的目標(biāo)是沒有癥狀的對象。人們將目的是從寬范圍的無癥狀對象中尋找受特殊疾病影響的患者或者將該寬范圍縮小到需要進(jìn)一步輔助試驗(yàn)的患者的試驗(yàn)一般稱之為篩選。通常在篩選中，試驗(yàn)對象的數(shù)量非常大。為了測試許多對象，這種篩選首先并且最重要的是應(yīng)該方便并且經(jīng)濟(jì)。盡管腫瘤標(biāo)記試驗(yàn)是很少傷害患者的適當(dāng)?shù)臏y試方法，但目前人們認(rèn)為通過測定腫瘤標(biāo)記來檢測早期癌癥是不可能的。
Midkine(本文以后稱之為”MK”)是發(fā)現(xiàn)可作為對視黃酸應(yīng)答的基因產(chǎn)物的增生和分化因子，并且是富集堿性氨基酸和半胱氨酸的13-kDa多肽(Kadomatsu，K.等Biochem.Biophys.Res.Commun.，1511312-1318；Tomomura，M.等J.Biol.Chem.，26510765-10770，1990)。在各種惡性腫瘤中MK的水平相比于周圍的正常組織升高，這一事實(shí)顯示了MK在癌發(fā)生中起著重要作用。所以，有人已經(jīng)建議用MK基因作探針的Northern印跡法(未審公開的日本專利申請?zhí)?JP-A)Hei6-113898)和含抗-MK蛋白抗體的癌癥診斷劑(JP-A Hei6-172218)來診斷癌癥。但是，這些公開的專利申請既沒有描述也沒有暗示MK基因或MK蛋白可用于早期癌癥的檢測中。所以，Ye等已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了在人體結(jié)腸直腸癌的腺瘤階段，癌變前組織的MK表達(dá)升高(Ye C.等Br.J Cancer.，79，179-183，1999)。但是，在這篇報(bào)導(dǎo)中沒有描述或暗示有關(guān)的早期癌癥檢測的任何內(nèi)容。
所以，期望發(fā)現(xiàn)可由早期癌癥狀況進(jìn)行檢測的腫瘤標(biāo)記和開發(fā)用于檢測這種標(biāo)記的試驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用作早期癌癥標(biāo)記的新的多肽。另外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用這種多肽作為指標(biāo)檢測早期癌癥的方法。而且，本發(fā)明的又一目的是提供可檢出這種多肽的用于早期癌癥的外部診斷劑。
本發(fā)明的發(fā)明人員發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌的早期用抗-MK抗體所檢出的肝細(xì)胞癌患者的MK水平與健康對象或肝炎患者的相比，不僅在肝細(xì)胞癌組織中，而且在血液和尿液中都有顯著提高。即使在胃癌中，也發(fā)現(xiàn)血液和尿液中MK水平在早期也類似于肝癌顯著升高。而且，在許多類型的癌癥如食管癌、十二指腸癌、結(jié)腸癌、膽管癌和膽囊癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肺癌和乳腺癌中，都可以在它們的早期觀察到血清(serum)MK水平的顯著升高。這表明MK具有對于檢測未特別指明癌癥的公知腫瘤標(biāo)記中所看不到的非常廣譜的特異性。
按照這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人說明了MK作為早期癌癥標(biāo)記的實(shí)用性。而且，使用本發(fā)明人所開發(fā)的使用酶免疫測定(EIA)的簡單而高度敏感的一步三明治(sandwich)方法通過對各種癌癥早期患者體液中出現(xiàn)的MK水平的高敏感度的檢測而使得早期癌癥的篩選診斷成為可能。EIA能夠完全自動地并且是非常適合用作目的為檢出早期癌癥的MK測定法。
也就是說，本發(fā)明涉及早期癌癥的檢測方法，或者早期癌癥的診斷方法和用于這些方法的診斷劑和試劑盒，具體如下(1)一種檢測早期癌癥的方法，包括(a)在生物樣本中測定midkine和/或其片段，以及(b)將步驟a)中所得到的測定水平與健康對象的測定水平相比較。
(2)按照(1)的方法，其中早期癌癥是胃癌。
(3)按照(2)的方法，其中胃癌在第I階段(stage I)。
(4)按照(1)的方法，其中早期癌癥是肝細(xì)胞癌。
(5)按照(4)的方法，其中肝細(xì)胞癌是在第I階段。
(6)按照(1)的方法，其中早期癌癥是肺癌。
(7)按照(6)的方法，其中肺癌是在第I階段。
(8)按照(1)的方法，其中生物樣本是血清或尿。
(9)可識別midkine和/或其片段的抗體在早期癌癥檢測中的應(yīng)用。
(10)早期癌癥的診斷劑，包括可識別midkine和/或其片段的抗體。
(11)用于檢測生物樣本中早期癌癥的試劑盒，其中該試劑盒(a)包括容器，該容器中裝有可與至少一種midkine和/或其片段的表位(epitope)特異性結(jié)合的抗體，和(b)測定生物樣本中midkine和/或其片段的存在。
(12)按照(11)的試劑盒，其中抗體被吸收在固體上。
(13)一種評價(jià)癌癥預(yù)后的方法，包括a)測定生物樣本中的midkine和/或其片段，以及b)將步驟a)中得到的測定水平與癌癥預(yù)后相關(guān)聯(lián)(correlating)。
(14)按照(13)的方法，其中癌癥是胃癌、肝細(xì)胞癌或肺癌。定義除非另有說明，說明書中所用下列術(shù)語有下列含義。
“早期癌癥(early cancer)”指的是沒有侵襲到周圍組織的、限制在發(fā)生部位(粘膜內(nèi))的腫瘤，或者是已經(jīng)侵襲但侵襲范圍限制在局部區(qū)域的腫瘤。尤其是，沒有表現(xiàn)出侵襲的腫瘤是本發(fā)明的重要檢測目標(biāo)，因?yàn)樗鼈兒茈y被公知的腫瘤標(biāo)記檢測出。這種定義適用于幾乎所有癌癥如皮膚癌、口腔癌、呼吸道癌、胃腸道癌、子宮頸癌、卵巢癌、膽囊癌、膀胱癌等癌癥。早期癌癥包括按照TNM分類的0階段(原位癌)和第I階段。在這些癌癥階段，沒有血管內(nèi)的侵襲或遠(yuǎn)距離的轉(zhuǎn)移，并且僅切除局部腫瘤就會完全康復(fù)。
在本發(fā)明中，“腫瘤標(biāo)記(tumor marker)”被定義為由腫瘤細(xì)胞或與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的物質(zhì)，它可以在組織、體液、分泌物等中發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)能顯示腫瘤的某些特征，如存在、特點(diǎn)或擴(kuò)展。
術(shù)語“MK”包括全長MK蛋白和含有具有MK生物活性的任意長度的氨基酸序列的片段。也包括突變MK如可表達(dá)癌癥特異性的缺少N-區(qū)的突變MK(Kaname T.等Biochem.Biophys.Res.Commun.，219256-260，1996)。在這篇描述內(nèi)容中，由遺傳工程技術(shù)所生產(chǎn)的MK和化學(xué)合成的MK可以互換使用?？删幋a人全長MK的DNA序列是公知的(US 5,461,029)。MK的生物活性不僅包括MK對細(xì)胞的生理作用，而且也包括與抗-MK抗體的免疫反應(yīng)性。
“敏感性(sensitivity)”是指腫瘤存在組中陽性測定結(jié)果所占的比例，也稱之為陽性比例(positivity ratio)。
“特異性(specificity)”是指沒有腫瘤存在的組中陰性測定結(jié)果所占的比例，也稱之為陰性比例。
“生物樣本(biological sample)”是指能夠從有機(jī)體獲得的樣本。更具體地說，例如是血液、血清、尿液、其他分泌物等。在這些生物樣本中，尿液可用作具有低侵襲性的樣本。因?yàn)槟蛞后w積變化相當(dāng)大，所以為了更精確地比較尿液成分的濃度，希望對尿液體積進(jìn)行校正。肌酸酐校正等都是校正尿液體積的公知方法。
“階段分類(stage classification)”一般是指通過用肉眼可觀察到的進(jìn)展而對癌癥進(jìn)行的分類，國際上普遍使用TNM分類(tumor-node-metastasisstaging)。本發(fā)明所用的“階段分類”對應(yīng)于TNM分類(“Rinsho，Byori，Genpatsusei Kangan Toriatsukaikiyaku (Clinical and Pathological Codes forHandling Primary liver Cancer)”第22頁Nihon Kangangaku Kenkyukai(Liver Cancer Study Group of Japan)版本(第3次修訂本)，Kanehara Shuppan，1992)。
而且，在本發(fā)明中，“癌癥的檢測(detection of cancer)”是指高可能性地判斷受試驗(yàn)者體內(nèi)癌癥的存在。與檢測成對比的是，篩選是表示測試的術(shù)語，特別地其是以任意組為目標(biāo)，目的是縮小很可能患癌癥的對象的范圍。以特殊對象為目標(biāo)的癌癥檢測稱之為診斷，而篩選是以任意組為目標(biāo)。在本發(fā)明中，篩選和診斷只是目標(biāo)不同，本發(fā)明的檢測方法包含了這二者。
因?yàn)橹钡桨┌Y生長到一定大小時(shí)，血液中癌細(xì)胞所產(chǎn)生的標(biāo)記含量才不同于健康對象的標(biāo)準(zhǔn)值，所以通過血清標(biāo)記的量的增長來檢測早期癌癥一般被認(rèn)為是不可能的，這就象上文所提到的那樣。
由于在結(jié)腸直腸癌的癌變前期的MK在mRNA和蛋白質(zhì)水平都有高水平的表達(dá)(Ye C.等Br.J Cancer.，79179-183，1999)，所以發(fā)明人對各種類型的癌癥患者的血液MK的水平進(jìn)行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者(87％)相比于健康對象，血液MK水平顯著升高。87％相對于當(dāng)前的腫瘤標(biāo)記是相當(dāng)高的數(shù)值。在癌癥組織中所表達(dá)的MK可能被分泌到血流中，所以認(rèn)為這導(dǎo)致了血液MK水平的增加。在肝細(xì)胞癌、胃癌、肺癌等中，血液MK水平在癌癥早期都升高。
在第I階段，肝細(xì)胞癌或肺癌患者的血液MK水平與健康對象血液中的標(biāo)準(zhǔn)值相比已經(jīng)顯著升高，并且在第II到IV階段還會持續(xù)升高。相比之下，在第I階段的胃癌患者中，該水平比健康對象的標(biāo)準(zhǔn)值明顯升高，但從第II階段和之后，無論什么階段，MK水平幾乎都保持相同。所以，這表明通過測定多種癌癥包括肝細(xì)胞癌、肺癌或胃癌的MK而歸類為第I階段的早期癌癥的檢測是可能的。而且，MK的測定不僅可以檢測早期癌癥，而且也可以檢測不同階段的癌癥，與癌癥的擴(kuò)展和MK的積累無關(guān)。這一特點(diǎn)對腫瘤標(biāo)記是非常重要的，因?yàn)橹辉诎┌Y早期發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)記會帶來忽略進(jìn)展癌癥(progressed cancer)的危險(xiǎn)。
腫瘤標(biāo)記的實(shí)用性一般可以通過可確定癌癥患者是否為陽性的“敏感度”和可確定非癌癥患者是否為陰性的“特異性”來評價(jià)。但是，各種公知的腫瘤標(biāo)記在敏感度和選擇性上都是有局限性的。
就MK而言，它在血液和尿液中的水平在如實(shí)施例中所述的各種未特別指出類型的癌癥早期都比健康對象的標(biāo)準(zhǔn)水平高。這可以說明MK在非特別指出類型的癌癥中有廣譜特異性并且有高敏感性。對廣泛篩選不論何種類型的器官的早期癌癥來說，對指定類型的癌癥進(jìn)行檢測的高敏感性和特異性以及在檢測未特別指出類型癌癥中的廣譜特異性都是所希望具有的。MK被認(rèn)為具有這種篩選所需的敏感性和特異性。
而且，基于本發(fā)明的早期癌癥檢測方法增加了(augment)已知腫瘤標(biāo)記的敏感性和特異性的局限。已知組合多種腫瘤標(biāo)記能夠提高敏感性同時(shí)保持特異性不變。一般將多種腫瘤標(biāo)記組合以改進(jìn)敏感性和特異性的篩選方法稱之為組合測定法。
在本發(fā)明中，對各種類型的惡性腫瘤的早期檢測能夠通過在無癥狀的對象所進(jìn)行的篩選中使用EIA等而測量測試對象的血液和尿液中的MK水平來檢測。而且，通過結(jié)合其它腫瘤標(biāo)記的測定，可以提高敏感性和特異性。
當(dāng)進(jìn)行組合測定時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮兩點(diǎn)。第一點(diǎn)是腫瘤標(biāo)記組合的選擇。一旦決定腫瘤標(biāo)記組合，接下來考慮的就是怎樣設(shè)置截止數(shù)值(cut-off value)。
腫瘤標(biāo)記選擇的要點(diǎn)是選擇相互之間發(fā)生關(guān)聯(lián)的可能性最小的組合。例如，AFP和PIVKA-II，其是肝臟腫瘤標(biāo)記，具有低關(guān)聯(lián)性，并且通過設(shè)置PIVKA-II截止數(shù)值為0.1Au/ml，它們具有接近100％的特異性。同時(shí)，CA19-9和CA-50的組合(它們是胰腺癌標(biāo)記)得到正確的陽性狀況一致而錯誤的陽性狀況不重疊的組合，這些使其成為無效組合。
一旦選擇好腫瘤標(biāo)記的組合，下一步就是設(shè)置截止數(shù)值。截止數(shù)值是一個(gè)影響敏感度和特異性的重要因素。一般，腫瘤標(biāo)記的敏感度和特異性是一種協(xié)調(diào)(trade-off)關(guān)系，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠按照下述參考文獻(xiàn)(例如，Kawamura，T.Tumer Marker，Nippon Rinsho 541649-1653，1996)設(shè)置適當(dāng)?shù)慕刂箶?shù)值。
在理想的腫瘤標(biāo)記中，對腫瘤組和對非腫瘤組的測定值是不重疊的，并且這些測定值能夠確定是否存在腫瘤。但是，至今為止這種理想的腫瘤標(biāo)記并沒有被開發(fā)出來。所以，必需設(shè)定最適合于鑒別和分辨腫瘤組和非腫瘤組的截止數(shù)值。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，截止數(shù)值是當(dāng)用固相抗體溫育來自沒有癌癥的患者樣本時(shí)所得到的信號的平均值。正常情況下，產(chǎn)生相對于預(yù)定截止數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為三倍的信號的樣本被認(rèn)為是癌癥陽性。經(jīng)常用對健康對象測定水平的分布中的95％置信區(qū)間的上下限(標(biāo)準(zhǔn)范圍)作截止數(shù)值。但是，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)范圍沒有考慮疾病狀態(tài)的分布。所以，優(yōu)選通過清楚定義要用試驗(yàn)分辨的疾病狀態(tài)而確定截止數(shù)值，然后收集疾病組和非疾病組的恒定數(shù)目(constant number)，測定它們，并考慮兩組測定值的普遍率(進(jìn)行測定時(shí)的狀況)和分離程度(試驗(yàn)的可分辨性)。用這種方法所確定的得到具有高于截止數(shù)值的信號的樣本被認(rèn)為是癌癥陽性。
而且，在手術(shù)除去腫瘤后，肝細(xì)胞癌患者中血液MK顯著降低。這表明MK不僅可以用于癌癥的診斷，而且也可以作為監(jiān)控病程的指示劑，作為預(yù)后因素或用于監(jiān)控復(fù)發(fā)。預(yù)后(prognosis)是指患者對治療的反應(yīng)。所以，如果在腫瘤治療前和治療后測定到MK數(shù)值的降低，并且該數(shù)值的下降得到確認(rèn)后，人們能夠推測所進(jìn)行的治療是有效的。而且，如果所測定的MK數(shù)值下降到健康對象的水平，人們能夠推測腫瘤治療已經(jīng)成功。腫瘤治療除了手術(shù)切除外還包括放射療法、免疫療法、化學(xué)療法等。
在其他實(shí)施方案中，MK能夠用作某些類型的癌癥如肝細(xì)胞癌的標(biāo)記。血液MK水平會隨著肝細(xì)胞癌階段的進(jìn)展而升高。對癌癥診斷而言，順序(隨著時(shí)間)多次進(jìn)行上述測定，評價(jià)MK水平的變化。例如，在6個(gè)月到1年內(nèi)每24小時(shí)到72小時(shí)進(jìn)行這種測定，之后如果需要的話再進(jìn)行測定。一般來說，患者體內(nèi)的癌癥不斷發(fā)展，并且其中的可由抗體檢測的MK值也隨時(shí)間不斷增長。
在本發(fā)明中，生物樣本中的MK水平能夠通過使用特異性的多克隆或單克隆抗MK的抗體的乳膠凝集、EIA或RIA方法、FIA、化學(xué)發(fā)光免疫測定法或ECLIA方法等來測定。在這些方法中，EIA是優(yōu)選作為本發(fā)明中測定MK的測定法。因?yàn)镋IA使用酶作標(biāo)記，所以EIA比伴有半衰期和放射活性廢物問題的RIA更容易操作。而且，理論上，EIA的敏感度比RIA更能提高。
此外，關(guān)于EIA，各種測定系統(tǒng)對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都是已知的(例如，參見Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。尤其是，為MK的測定已經(jīng)開發(fā)出一種優(yōu)異的EIA方法(JP-A Hei10-160735)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根據(jù)需要按照測定目的而改進(jìn)這種公知方法。
在相關(guān)的實(shí)施方案中，使用將抗體固定在固體膜如硝化纖維上的流通式(flow through)或帶狀(strip)試驗(yàn)類型測定法進(jìn)行測定。在流通式試驗(yàn)類型中，當(dāng)樣本通過該膜時(shí)，樣本中的MK與定相在固體上的抗體(solid phasedantibody)結(jié)合。接著，當(dāng)含有第二種抗體的溶液通過該膜時(shí)，所標(biāo)記的第二種抗體結(jié)合抗體-多肽絡(luò)合物。然后，如上所述測定所結(jié)合的第二種抗體。在帶狀試驗(yàn)類型中，將含結(jié)合抗體的膜的一端浸入含樣本的溶液中。樣本通過膜移動從而通過含第二種抗體的區(qū)域，然后移向定相在固體上的抗體區(qū)。在定相在固體上的抗體區(qū)中第二種抗體的濃度表示癌癥的存在。一般在這個(gè)區(qū)域中第二種抗體的濃度會產(chǎn)生圖案如可見的線。沒有這種圖案的表示陰性結(jié)果。通常，選擇固定在固體膜上的抗體量是為了產(chǎn)生視覺上可分辨的圖案。在這些情況中，生物樣本中的MK水平在兩種抗體的三明治測定法中是足以引起陽性信號的。固定在固體膜上的抗體量優(yōu)選為約25ng到1μg，更優(yōu)選在大約50ng到500ng。這類試驗(yàn)一般用非常小量的生物樣本進(jìn)行操作。
在流通式類型或帶狀試驗(yàn)類型測定形式(format)中，通過信號強(qiáng)度的自動讀數(shù)進(jìn)行定量測定是可能的?；蛘撸軌蛘{(diào)節(jié)敏感度以使陽性結(jié)果只在MK以特定濃度或更高時(shí)出現(xiàn)。通過敏感度的調(diào)整，能夠不用特殊裝置通過視覺確定陽性結(jié)果。在這類型測定形式中調(diào)整敏感度的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。例如，通過調(diào)整所用抗體量來改變敏感度。
當(dāng)然，許多其他測定方案也適合于使用本發(fā)明的抗原或抗體，所以上述方法僅僅是用來舉例的。
在上述每種類型的測定方案所需的MK抗體和用作標(biāo)準(zhǔn)樣本的MK可用作早期癌癥檢測試劑盒。本發(fā)明的早期癌癥檢測試劑盒包括至少一種抗-MK抗體和用作標(biāo)準(zhǔn)樣本的MK。另外，本發(fā)明的檢測試劑盒可以結(jié)合有檢測標(biāo)準(zhǔn)組份所需的酶底物、陰性對照和說明書等。當(dāng)在如EIA方法中使用檢測試劑盒時(shí)，前面所提到的抗MK抗體能夠預(yù)先與固體支持物結(jié)合。一般將反應(yīng)容器、珠或磁性顆粒等作為固體相。通過事先將抗MK抗體與固體相結(jié)合，EIA不僅能夠容易操作，而且還可以自動進(jìn)行。
在上述方法中所用的抗MK抗體能夠用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)生產(chǎn)(例如，參見Harbor和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring HarborLaboratory，1988)?？筂K的抗體可以是多克隆的或單克隆的抗體。例如，特異性識別MK的單克隆抗體如本發(fā)明人的日本專利申請?zhí)?000-272199(2000年9月7日申請)可以用于本發(fā)明。含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段也可以用作抗MK抗體。而且，這種抗體可以是單股的、嵌合的、CDR-接枝的或人化的抗體。這種抗體可以用本文所述的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他方法生產(chǎn)。
MK可用作生產(chǎn)本發(fā)明抗MK抗體的免疫原或用作標(biāo)準(zhǔn)物。為這些目的所用的MK包括生物衍生的MK、重組MK或化學(xué)合成MK，以及具有MK生物活性的片段。得到MK作為重組體的方法是公知的(JP-A Hei9-95454)。
本說明書中所引用的所有現(xiàn)有技術(shù)的公開出版物在本文都被作為參考文獻(xiàn)。
附圖簡述

圖1顯示了用實(shí)施例2的(1)所述的一步三明治方法對76名第I到IV階段的肝細(xì)胞癌患者(第I階段7名患者；第二階段19名患者；第III階段23名患者和第IV階段27名患者)、7名病毒性肝炎患者作比較對照和135名健康對象作對照(**p＜0.01)的血清MK水平的測定結(jié)果。誤差條(error bar)表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖2類似地顯示了用實(shí)施例2的(2)所述的一步三明治方法對76名第I到IV階段的肝細(xì)胞癌患者、7名病毒性肝炎患者作比較對照和376名健康對象作對照(**p＜0.01，Mann-Whitney U-試驗(yàn))的血清MK水平的測定結(jié)果。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖3相似地顯示了使用Eitest PIVKA-II(Sanko Junyaku Co.，Ltd.)對第I到IV階段的肝細(xì)胞癌患者血清中的PIVK-II水平的測定結(jié)果。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖4是相似地顯示了使用α-feto RIA珠(Dainabot)對第I到IV階段的肝細(xì)胞癌患者的血清中的AFP水平的測定結(jié)果(*p＜0.01)。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖5類似地顯示了用實(shí)施例2的(1)所述的一步三明治方法對72名第1到7階段的胃癌患者和135名健康對象的血清MK水平的測定結(jié)果。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖6類似地顯示了用實(shí)施例2的(2)所述的一步三明治方法對72名第1到7階段的胃癌患者和376名健康對象的血清MK水平的測定結(jié)果(**p＜0.01，Mann-Whitney U-試驗(yàn))。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖7類似地顯示了使用CEA RIA珠(IRMA方法)(Dainabot)對72名第1到7階段的胃癌患者血清中的CEA水平的測定結(jié)果。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖8類似地顯示了使用Centocor CA19-9試劑盒(IRMA方法)(Centocor)對72名第1到7階段的胃癌患者血清中的CA19-9水平的測定結(jié)果。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖9顯示了72名癌癥患者(胃癌24名患者；肝細(xì)胞癌24名患者；結(jié)腸癌24名患者)和50名健康對象的尿液MK水平的分布，其是用肌酸酐數(shù)值校正過的(p＜0.01；統(tǒng)計(jì)軟件StatView-J5.0；使用Mann-Whitney U-試驗(yàn))。
圖10顯示了在第1-7階段的3名膽管癌、3名乳腺癌、6名結(jié)腸癌、3名食管癌、1名膽囊癌、10名肝細(xì)胞癌、3名胰腺癌、7名直腸癌、28名胃癌和1名甲狀腺癌患者共65名患者的尿液MK水平的結(jié)果，其是用肌酸酐數(shù)值校正過的(*p＜0.05，**p＜0.001)。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖11顯示了肝細(xì)胞癌部分切除對血清中的MK數(shù)值的影響。含點(diǎn)的條表示腫瘤手術(shù)前的數(shù)值(手術(shù)前)，實(shí)體黑條表示腫瘤切除后的數(shù)值(第7天)。
圖12比較了各種類型的癌癥患者血清中MK的水平。粗線表示135名健康對象血清中MK水平的平均值，點(diǎn)線表示0.50ng/ml截止數(shù)值。各種類型的癌癥名稱下所顯示的數(shù)字表示患者數(shù)、中間值和25％到75％的置信區(qū)間。Asterisks表示與健康對象相比的顯著差異(significant difference)(Mann-Whitney U-試驗(yàn))。*p＜0.05，**p＜0.01。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下面參考實(shí)施例具體詳細(xì)說明本發(fā)明，但不能認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。
抗-人MK多克隆抗體的生產(chǎn)按照J(rèn)P-A Hei 9-95454的實(shí)施例1中所述的方法生產(chǎn)免疫接種所用的MK蛋白和用作標(biāo)準(zhǔn)物的重組MK蛋白。
將含有人MK的ORF的cDNA導(dǎo)入有Pichia酵母作為宿主的pHIL-D4表達(dá)載體。將這種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到Pichia酵母G115(Pichia pastoris G115；Research Corporation Technologies)。通過組氨酸和G418選擇獲得表達(dá)克隆的MK。在肝素柱上用離子交換色譜層析法和親和色譜層析法純化MK。純化的MK蛋白的神經(jīng)營養(yǎng)活性相當(dāng)于重組L-細(xì)胞所生產(chǎn)的鼠MK的活性。
每兩周對兔和雞進(jìn)行免疫接種注射，給兔接種6次，給雞接種8次。
具體來說，對兔開始皮下注射400μg混有等量弗氏完全佐劑(Freund’scomplete adjuvant)的MK，從第二次之后，每次皮下注射400μg混有弗氏不完全佐劑的MK。對雞來說，步驟類似于兔的，除了每次注射的是100μgMK。
從兔得到的抗血清(anti-sera)通過硫酸銨沉淀，然后用蛋白A柱分離IgG，而且將其用已經(jīng)將MK固定在Affigel-10TM(BioRad)的MK親和柱親和純化，獲得純化的兔抗-人MK-特異性抗體。另一方面，用硫酸銨沉淀從雞獲得的抗血清，然后用MK親和柱親和純化得到純化的雞抗-人MK-特異性抗體。這些抗體都用于蛋白質(zhì)印跡分析法中測定人MK的特異性。
通過一步三明治方法測定MK(1)將兔的抗-人MK-抗體溶于(5.5μg/ml)含0.1％NaN3的50mM PBS(pH7.2)中，將該溶液的50μl等份放入微量滴定板(polysorp plates，Nunc)的每個(gè)孔中。將該板在室溫下保持16小時(shí)，以吸收抗體到這些孔中。用0.1％吐溫20的PBS沖洗后，通過向各孔中加入150μl的等份的0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS并在37℃溫育2小時(shí)來阻斷這些孔。
另一方面，將10μl各期肝癌的血清(sera)、各期胃癌的血清或健康對象(對照)血清與100μl溶于含0.5MKCl、0.5％BSA和0.01％MicrocideI(aMReSCO，Solon，Ohio)的50mM Tris-HCl(pH8.4)中的過氧化酶標(biāo)記的雞抗人-MK抗體(0.1μg/ml)反應(yīng)。將50μl等份的該反應(yīng)溶液加入板孔中，然后在室溫溫育1小時(shí)。用1％吐溫20的PBS將各孔沖洗5次。將100μl等份的底物溶液(0.5mg/ml四甲基聯(lián)苯胺)加入孔中并在室溫溫育30分鐘。加入2N H2SO4終止反應(yīng)，用多板讀數(shù)計(jì)(型號3550，BioRad)測定在450nm/655nm的吸收值。在測定時(shí)，用類似方法測定已知濃度的MK標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)溶有兔抗-人MK抗體的緩沖液不同于上述提到的(1)的，區(qū)別在于i)用50mM Tris-HCl(pH8.1-8.3)替代50mM PBS，該緩沖液含有0.15M NaCl而抗體濃度是5μg/ml；ii)用含0.1％的酪蛋白的PBS作為阻斷溶液替代0.5％的BSA；iii)溶有過氧化酶(POD)-標(biāo)記的雞抗-人MK抗體緩沖液是含0.5MKCl、0.1％酪蛋白、0.5％BSA、1mg/ml兔γ-球蛋白和0.01％MicrocideI(aMReSCO，Solon，Ohio)的50mM Tris-HCl(pH8.2-8.4)，另外，用類似于上述(1)中的一步三明治方法進(jìn)行MK的測定。
肝細(xì)胞癌每一階段和血清MK水平之間的關(guān)聯(lián)(correlation)(1)血清樣本的制備從135健康對象(94名男性和41名女性，年齡在21-75歲之間)、76名肝細(xì)胞癌(HCC)患者(第I階段7名患者；第II階段19名患者；第III階段23名患者；第IV階段27名患者)和肝病對照、7名病毒性肝炎患者、72名腺癌患者(第I階段23名患者；第II階段9名患者；第III階段7名患者；第IV階段9名患者；第V階段5名患者；第VI階段9名患者；第VII階段10名患者)中收集血樣，然后從中制備血清。馬上將血清冷凍，并在-20℃存放，直到MK測定時(shí)。
之后，從其他376名健康對象(152名男性和224名女性)中收集新鮮血樣，然后制備血清。
(2)血清MK水平的測定用實(shí)施例2中的(1)的方法測定每個(gè)HCC患者、病毒性肝炎患者和135名健康對象的血清MK水平(圖1)。圖中的條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。證實(shí)了HCC患者的血清MK水平相對于健康對象逐漸顯著高于第II期。
用實(shí)施例2的(2)所述的一步三明治方法測定上述HCC患者、病毒性肝炎患者和376名健康對象中每個(gè)的血清MK水平，其中EIA的敏感度是提高的(圖2)。圖中的條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
在第I期HCC患者的血清MK水平是0.22ng/ml(平均值)，明顯較高的值(**p＜0.01；Mann-Whitney試驗(yàn))相比于由健康對象獲得的數(shù)值0.02ng/ml(平均值)。所以，發(fā)現(xiàn)MK作為早期HCC的血清腫瘤標(biāo)記是非常有用的。
在HCC中用PIVKA-II和AFP的對比試驗(yàn)?zāi)壳癙IVKA-II和AFP被廣泛用作HCC腫瘤標(biāo)記。PIVKA-II和AFP是互補(bǔ)性的，PIVKA-II和AFP的組合提高了診斷率。所以，PIVKA-II和AFP可以用作比較性對照腫瘤標(biāo)記。
使用Eitest PIVKA-II(Sanko Junyaku Co.，Ltd.)測定血清PIVKA-II(圖3)。測定法是EIA。暗示了HCC從第III期是陽性的可能性。
用α-feto RIA珠(Dainabot)測定血清AFP水平(圖4)。該測定法是免疫放射性測定法(IRMA)。在HCC的第I階段沒有檢測到AFP，暗示了從第II階段的檢測是可能的。
也就是說，用MK進(jìn)行HCC的早期測定是可行的，而且證實(shí)了在HCC階段發(fā)展和血清MK濃度的升高之間有密切聯(lián)系(strong correlation)。
在胃癌各階段和血清MK水平之間的關(guān)系(1)血清樣本的制備從72名胃癌患者(第1階段23名患者；第2階段9名患者；第3階段7名患者；第4階段9名患者；第5階段5名患者；第6階段9名患者；第7階段10名患者)中收集血樣，然后制備血清。將血清馬上冷凍，并在-20℃存放，直到進(jìn)行MK測定時(shí)。分別使用試驗(yàn)例1中獲得的135名健康對象和376名健康對象的血清MK水平的數(shù)值。
(2)血清MK水平的測定圖5顯示了胃癌各階段(1-7)和135名健康對象的血清MK水平(圖中的條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差)，圖6分別顯示了376名健康對象的血清MK水平的數(shù)值(**p＜0.01；Mann-Whitney U-試驗(yàn)；圖中的條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差)。
圖6證實(shí)了胃癌患者從第1期起的血清MK水平顯著性地高于健康對象的數(shù)值。也就是說，發(fā)現(xiàn)MK可用作胃癌早期診斷的腫瘤標(biāo)記。
在胃癌中使用CEA和CA19-9的對比試驗(yàn)選用CEA和CA19-9作對照比較的腫瘤標(biāo)記。發(fā)現(xiàn)在消化器官的各種癌癥以及在其他各種癌癥中血清CEA水平升高，由此它被廣泛用于臨床。另一方面，發(fā)現(xiàn)CA19-9在胰腺和膽汁系統(tǒng)的癌癥顯示了較高的陽性數(shù)值。當(dāng)前，CA19-9以及CEA都是常規(guī)臨床使用中最為廣泛使用的消化器官癌癥的腫瘤標(biāo)記。
使用對血清CEA所用的CEA RIA珠(Dainabot)對胃癌患者測定血清MK水平(圖7；條帶表示標(biāo)準(zhǔn)誤差)。所用的測定法是IRMA。盡管可以測定CEA作為第7階段的陽性值，但是由于各階段之間較大的標(biāo)準(zhǔn)誤差不能證實(shí)階段之間的顯著差異。
使用Centocor CA19-9 RIA試劑盒(Centocor；正常值37U/ml或更低)測定血清CA19-9(圖8；圖中條帶表示標(biāo)準(zhǔn)誤差)。所用測定法為IRMA。CA19-9僅在第5階段顯示出較高數(shù)值，所以由此推測它與階段沒有聯(lián)系。
也就是說，發(fā)現(xiàn)MK可用作早期胃癌的血清腫瘤標(biāo)記。
在胃癌患者和肺癌患者中的血清MK水平在胃癌患者和肺癌患者早期調(diào)查血清MK水平(表1)。胃癌患者和肺癌患者二者都顯示出在第I階段的血清MK水平的平均值低于第II到IV階段的，但是它們之間的差異在胃癌患者和肺癌患者中都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。
表1 血清MK水平(ng/ml)
癌癥患者中尿液MK水平的測定用實(shí)施例2的(2)的方法測定在健康檢查期間獲得的72個(gè)癌癥患者(胃癌24名患者；肝細(xì)胞癌24名患者和結(jié)腸癌24名患者)的尿液樣本的MK水平和50個(gè)健康對象的早晨尿液樣本。而且，在相同尿液中測定肌酸酐的數(shù)值，然后用肌酸酐的數(shù)值校正MK的數(shù)值。圖9顯示了結(jié)果。證實(shí)了在健康對象和癌癥患者尿液MK數(shù)值之間具有顯著性差異(p＜0.01；使用Mann-Whitney U-試驗(yàn))。
在癌癥患者和癌癥各階段中尿液MK數(shù)值之間的關(guān)聯(lián)研究在癌癥患者和癌癥各階段間尿液MK數(shù)值之間的關(guān)聯(lián)。對包括3名膽管癌患者、3名乳腺癌患者、6名結(jié)腸癌患者、3名食管癌患者、1名膽囊癌患者、10名肝細(xì)胞癌患者、3名胰腺癌患者、7名直腸癌患者、28名胃癌患者和1名甲狀腺癌患者的總共65名患者進(jìn)行階段分類(第1-7個(gè)階段)。然后，測定尿液MK水平。圖10中顯示了各階段的MK水平作為尿液MK的校正值(*p＜0.05，**p＜0.01；Mann-Whitney U-試驗(yàn))。發(fā)現(xiàn)癌癥的第I期的尿液MK水平比健康對象顯著提高。至今為止，沒有報(bào)導(dǎo)過癌癥早期階段增長的尿液標(biāo)記。也就是說，尿液MK水平可用于各種癌癥的早期篩選。
在HCC中腫瘤部分切除對血清MK水平的影響對5名HCC患者研究外科手術(shù)部分切除腫瘤對血清MK水平的影響(圖11)。在4名患者中，腫瘤摘除后7天血清MK水平顯著下降。也就是說，血清MK的水平反映了對HCC的治療效果。
各種癌癥的血清MK水平表2詳細(xì)列舉了包括18名食管癌患者、30名胃癌患者、2名十二指腸癌患者、25名結(jié)腸直腸癌患者、25名肝細(xì)胞癌患者、12膽管癌和膽囊癌患者、9名胰腺癌患者、5名甲狀腺癌患者、19名肺癌患者和5名乳腺癌患者總共150名癌癥患者的所處階段。圖12顯示了用EIA測定這150名癌癥患者的血清MK水平的結(jié)果。150名癌癥患者的血清MK水平與健康對象的數(shù)值顯示了顯著性差異(p＜0.001，Mann-Whitney U-試驗(yàn))。在87％患者中可見高于0.5ng/ml截止數(shù)值的血清MK水平。
表2


工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種用作診斷早期癌癥的腫瘤標(biāo)記。該腫瘤標(biāo)記可用于進(jìn)行早期癌癥的篩選、某些類型的癌癥的階段和預(yù)后的評估以及監(jiān)控治療過程。
權(quán)利要求
1.一種檢測早期癌癥的方法，包括a)測定生物樣本中的midkine和/或其片段，和b)將步驟a)中得到的測定水平與健康對象的測定水平進(jìn)行比較。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中早期癌癥是胃癌。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中胃癌在第I階段。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中早期癌癥是肝細(xì)胞癌。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中肝細(xì)胞癌是在第I階段。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其中早期癌癥是肺癌。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中肺癌是在第I階段。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中生物樣本是血清或尿。
9.可識別midkine和/或其片段的抗體在早期癌癥檢測中的應(yīng)用。
10.早期癌癥診斷劑，含有可識別midkine和/或其片段的抗體。
11.檢測生物樣本早期癌癥的試劑盒，其中該試劑盒(a)含有容器，該容器中裝有與至少一種midkine和/或其片段的表位特異性結(jié)合的抗體，以及(b)測定生物樣本中midkine和/或其片段的存在。
12.按照權(quán)利要求11的試劑盒，其中抗體被吸附到固體上。
13.評估癌癥預(yù)后的方法，包括a)測定生物樣本中的midkine和/或其片段，和b)將步驟a)獲得的測定水平與癌癥預(yù)后相關(guān)聯(lián)。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其中癌癥是胃癌、肝細(xì)胞癌或肺癌。
全文摘要
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MK(midkine)在早期階段出現(xiàn)在各種類型癌癥患者的血液或尿液中?；谶@一發(fā)現(xiàn),完成了一種涉及測定血或尿中MK的步驟的測定早期癌癥的方法。
文檔編號G01N33/574GK1390304SQ00815553
公開日2003年1月8日 申請日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月10日
發(fā)明者村松喬, 岡本好司, 池松真也, 佐久間貞俊, 小田宗宏, 熊井英志 申請人:村松喬