專利名稱：^99mTc標記半乳糖化RGD腫瘤診斷藥物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于腫瘤診斷的放射性藥物,特別涉及用于intergrin α νβ3受體陽性腫瘤診斷的一種RGD多肽放射性藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全世界惡性腫瘤每年發(fā)病1100多萬人，病死800多萬人。惡性腫瘤發(fā)病率在我國也呈明顯上升趨勢，據(jù)國家衛(wèi)生資料統(tǒng)計，近兩年來我國城市居民惡性腫瘤占死亡原因的第I位，每年新增患者約220萬人。近年來惡性腫瘤的治療手段在不斷發(fā)展，不僅傳統(tǒng)的化療和放療技術(shù)更加規(guī)范化和科學(xué)化，新的治療方法，如分子祀向治療、免疫治療和基因治療等，正在逐步應(yīng)用于臨 床。與之相適應(yīng)，要求惡性腫瘤診斷技術(shù)不僅要能夠進行準確的診斷，更迫切需要進一步反映惡性腫瘤的生物學(xué)行為和病理特點，為治療方案的科學(xué)化決策提供確切的依據(jù)。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力直接關(guān)系到患者的預(yù)后，同時對于臨床醫(yī)師選擇治療方案具有至關(guān)重要的意義。但目前臨床上還缺乏準確判定惡性腫瘤轉(zhuǎn)移能力的檢測方法，而主要依靠經(jīng)驗判斷。新生血管和淋巴管的形成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，腫瘤新生血管形成促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，淋巴道形成與腫瘤轉(zhuǎn)移直接相關(guān)。整合素(integrin)是一組跨膜糖蛋白，由一個α亞單位和β亞單位通過非共價鍵組成的異二聚體，也是細胞外基質(zhì)蛋白的受體，與細胞外基質(zhì)蛋白(如纖維結(jié)合蛋白、玻璃結(jié)合蛋白、層粘蛋白和膠原等)的受體識別序列RGD (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)特異結(jié)合。整合素調(diào)控新生血管和淋巴道的形成。諸多研究表明，整合素調(diào)控金屬基質(zhì)蛋白酶等蛋白水解酶，直接參與細胞外基質(zhì)的降解，促使腫瘤轉(zhuǎn)移；整合素的豐富表達是促使腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞遷移和侵襲的重要分子，它直接介導(dǎo)腫瘤細胞與基質(zhì)蛋白的粘附和結(jié)合；參與調(diào)控胞內(nèi)細胞骨架構(gòu)成，細胞增殖。ανβ3是目前研究最多的整合素分子，在骨肉瘤、成神經(jīng)細胞瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細胞瘤及浸潤性黑色素瘤等多種實體腫瘤細胞表面和腫瘤新生血管均有豐富的表達，在成熟血管內(nèi)皮細胞和絕大多數(shù)正常組織表達缺乏或幾乎不表達。ανβ3受體介導(dǎo)腫瘤細胞粘附和移行，在腫瘤新生血管生成和淋巴道轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。ανβ3的表達水平與惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移能力等惡性表型有關(guān)，也可以作為評價某些惡性腫瘤預(yù)后的的指標。放射性核素標記的RGD序列配體已經(jīng)被用于腫瘤的放射性核素顯像研究，用于檢測轉(zhuǎn)移潛力較高的integrin ανβ3表達陽性的腫瘤。已有的研究結(jié)果認為RGD多肽二聚體顯像劑與惡性腫瘤表面integrin α ν β 3的親和力更好,要優(yōu)于RGD多肽四聚體。但目前已有的RGD多肽二聚體顯像劑在非靶器官，特別是腸道等器官的攝取較多，腹部本底較高，干擾了腹部腫瘤的成像效果，有必要發(fā)明新型的RGD多肽二聚體顯像劑，通過改變配體的結(jié)構(gòu)，進一步降低顯像劑在腸等非靶器官的攝取，從而降低放射性本底，提高腫瘤顯像的圖像質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
為克服已有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種非靶器官攝取更為理想的放射性核素標記RGD多肽腫瘤診斷藥物。為達到上述目的，本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下將HYNIC-OSu與半乳糖化的R⑶肽二聚體Galacto-RGD2相連接，制備得到配體HYNIC-Galacto-RGD2。利用配體中HYNIC的螯合作用，實現(xiàn)"mTc標記,制成RGD多肽二聚體顯像藥物99mTc-Galacto_RGD2。在配體結(jié)構(gòu)中引入兩個半乳糖連接鏈，減少了藥物在腸道中的攝取，從而降低了放射性本底，提高了腫瘤顯像的圖像質(zhì)量。


圖I標記前體化合物HYNIC-Galacto_RGD2的合成路線示意圖；
圖2 99mTc標記的診斷藥物99mTc-Galact0-RGD2的合成路線示意圖； 圖3 99mTc-Galacto-RGD2 的放射性 HPLC 圖譜；圖4在過量E[c (RGDfK) ]2抑制或未經(jīng)E[c (RGDfK) ]2抑制的條件下，99mTc-Galacto-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤裸鼠中注射后60 min的生物分布；圖5 99mTc-Galacto-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤裸鼠模型中的3D和橫斷面的SPECT-CT 圖像；圖6注射前的99mTc-Galacto-RGD2、注射后30 min和120 min的尿樣以及注射后120 min的糞便樣本的放射性HPLC圖譜。
具體實施例方式一.半乳糖化RGD多肽放射性藥物的制備方法I.材料和設(shè)備化學(xué)試劑均購于美國Sigma/Aldrich公司，無需進一步純化。Galacto-RGD肽二聚體(Galacto-RGD2)由美國 Peptides International 公司(Louisville, KY)按照常規(guī)工藝制造。HYNIC-Osu根據(jù)文獻中方法合成。ESI(電噴射離子化)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Finnigan LCQ傳統(tǒng)質(zhì)譜儀上采集獲得。"mTc04_從原子高科股份有限公司購得。2. HPLC (高效液相色譜)方法HPLC方法I :使用LabAillance色譜系統(tǒng)，包括紫外_可見光檢測儀(波長為254nm)和Zorbax C18半制備柱(柱寬X柱長為9. 4 nmX250 mm，固定相的孔徑大小為100A，美國Agilent Technologies公司提供)。流速為2. 5 mL/min,流動相A相為含O. 1%TFA 的水；B 相為含 O. 1% TFA 的甲醇。流動相梯度0_5 min, 90%A->80%A ；5. 01-20 min,80%A->70%A。HPLC 方法 2 :使用 LabAillance 色譜系統(tǒng),包括 β-ram IN/US 檢測儀(Tampa, FL)和Zorbax C18色譜柱(柱寬X柱長為4. 6 mmX250 _，固定相的孔徑大小為300 A，美國Agilent Technologies公司提供)。流速為I mL/min,流動相A相為25 mM NH4Oac ;B相為乙腈。流動相梯度為 0-5 min, 90% A ；5. 01-20 min, 90%A->60%A ；20. 01-25 min，60%A_>40%A。
3.標記前體化合物HYNIC-Galacto-RGD2的制備方法將HYNIC-Osu (5. 4 mg, 12 μ mol)和 Galacto-RGD2 (6. 5 mg, 3 μπιο )溶于 DMF(2 mL)。 滴加過量的DIEA(5滴)至上述混合液，室溫攪拌至反應(yīng)結(jié)束(約5天)。將2 mL水加至反應(yīng)液中，用三氟乙酸(TFA)調(diào)節(jié)pH至:Γ4。產(chǎn)品經(jīng)HPLC分離純化(HPLC方法1)，收集保留時間為14. 5 min的組分，冷凍干燥后得到3. 5 mg目標產(chǎn)物HYNIC-Galacto-RGD2(圖 I)。ESI-MS(C104H146N32O36S):實驗值為 2452. 3([M + H] + )，計算值為 2451. 03 ([M]+)。4. 99mTc-Galacto-RGD2 的制備方法將I. (Tl. 5 mL含有1110 1850 MBq Na99mTcO4的生理鹽水加至含有20 μ gHYNIC-Galacto-RGD2,5 mg TPPTS、6. 5 mg tricine、40 mg 甘露醇、38. 5 mg 六水合琥珀酸二鈉和12. 7 mg琥珀酸的凍干瓶中。將上述反應(yīng)液在沸水浴中反應(yīng)1(T30 min，然后在室溫中放置5 min，采用HPLC對反應(yīng)產(chǎn)物進行分析(HPLC方法2)(圖2)。將上述反應(yīng)液配制成約30 μ Ci/mL的生理鹽水溶液用于生物分布研究，配制成約
ImCi/mL的生理鹽水溶液用于顯像研究。用于上述兩個實驗的99mTc-Galacto-RGD2，其放化純>90%。在給動物注射前，溶液均經(jīng)O. 20 urn Millex-LG濾膜過濾，每只動物注射O. ImL。從99niTc-Galacto-RGD2 的放射性 HPLC 圖譜(圖 3)可見，99niTc-Galacto-RGD2 具有高的放射化學(xué)純度，RCP>90%。二.動物實驗生物分布及顯像研究依據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院動物實驗指南進行，并符合動物倫理的要求。U87MG膠質(zhì)瘤細胞株用含厄爾平衡鹽緩沖液的MEM培養(yǎng)基培育，并培養(yǎng)基中添加了 10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素。腫瘤細胞于37° C，含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有細胞單層生長，待達到90%匯合度時收獲。選擇雌性4-5周齡裸鼠，將腫瘤細胞懸于生理鹽水中，數(shù)量調(diào)整為5 X IO7個/mL，取O. I mL細胞懸液植于裸鼠肩側(cè)。所有步驟均于超凈臺內(nèi)進行。待腫瘤長至O. I、.5 g時進行實驗。I. 99mTc-Galact0-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤的裸鼠中的生物分布實驗隨機選擇4只荷瘤小鼠(2(T25 g)，均于尾靜脈注射約3 μ Ci99niTc-Galacto-RGD2。在注射5、30、60和120 min后，將動物用過量的戊巴比妥鈉(約200 mg/kg)麻醉處死。從心臟取血樣，再取出腫瘤及正常器官(腦、眼、心、脾、肺、肝、腎、肉和腸)，用生理鹽水洗漆后擦干稱重，并用Perkin Elmer Wizard 1480 Y計數(shù)器(Shelton, CT)測計數(shù)，從而計算出各組織的單位質(zhì)量注射劑量百分數(shù)(％ID/g)和瘤與正常組織的比值。表I列出了 99mTc-Galacto-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤的裸鼠中不同時相的生物分布數(shù)據(jù)；表2對荷U87MG人膠質(zhì)瘤裸鼠注射后60 min后，99mTc-Galacto-RGD2和99mTc_3P-RGD2的生物分布數(shù)據(jù)進行了比較。表I 99mTc-Galact0-RGD2在荷U87MG人膠質(zhì)瘤的裸鼠中的生物分布數(shù)據(jù)(％ID/g)
器官5 min (η = 5)30 min (η = 5)60 min (η = 8)120 min (η = 8)
_ ._I. 10 土 O. 16_O. 92 土 O. 33_O. 56 土 O. 25_O. 22 土 O. 03_
腦0ΓΤ 土 O. 10O. 22 ± O. 06— O. 35 土 O. 28O. 14 土 O. 12
目艮土 0.49I 20 土 0.50~0. 81 土 0.39O. 52 土 0.15
心27^6 土 0.29Τ. 65 土 1.10I. 27 土 0.61O. 56 土 0.08
權(quán)利要求
1.一種99mTc標記的RGD多肽放射性藥物，該藥物在結(jié)構(gòu)上為半乳糖化的RGD環(huán)狀二聚體，通過雙功能螯合劑HYNIC進行放射性核素99mTc標記，其主要特征是采用兩個半乳糖作為RGD的連接鏈，降低了藥物在腸道、肺等非靶器官中的攝取，從而提高了腫瘤顯像的圖像質(zhì)量，所述的放射性藥物為99mTc-Galacto-RGD2,為無色透明液體針劑。
2.權(quán)利要求I中所述的99mTc標記RGD多肽放射性藥物的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 a.標記前體化合物HYNIC-Galacto-RGD2的制備方法將 HYNIC-Osu (5.4 mg, 12 μ mol)和 Galacto-RGD2 (6.5 mg, 3 μπιο )溶于 DMF (2mL)。 滴加過量的DIEA(5滴)至上述混合液，室溫攪拌至反應(yīng)結(jié)束(約5天);將2 mL水加至反應(yīng)液中，用三氟乙酸(TFA)調(diào)節(jié)pH至:Γ4 ;產(chǎn)品經(jīng)HPLC分離純化，收集保留時間為14. 5min 的組分，冷凍干燥后得到 3. 5 mg 目標產(chǎn)物 HYNIC-Galacto-RGD2 ;ESI_MS( Cltl4H146N32O36S):實驗值為 2452. 3 ([M + H] + )，計算值為 2451. 03 ([M]+)； b.99mTc-Galacto-RGD2 的制備方法 將I. (Tl. 5 mL含有1110 1850 MBq Na99mTcO4的生理鹽水加至含有20 μ gHYNIC-Galacto-RGD2,5 mg TPPTS、6. 5 mg tricine、40 mg 甘露醇、38. 5 mg 六水合琥珀酸二鈉和12. 7 mg琥珀酸的凍干瓶中，將上述反應(yīng)液在沸水浴中反應(yīng)1(T30 min，然后在室溫中放置5 min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于intergrin αvβ3受體陽性腫瘤診斷的RGD多肽放射性藥物及其制備方法。該藥物在結(jié)構(gòu)上為半乳糖化的RGD環(huán)狀二聚體，通過雙功能螯合劑HYNIC進行放射性核素99mTc標記。其主要特征是采用兩個半乳糖作為RGD的連接鏈，降低了藥物在腸道、肺等非靶器官中的攝取，從而提高了腫瘤顯像的圖像質(zhì)量。所述的放射性藥物為99mTc-Galacto-RGD2，為無色透明液體針劑。
文檔編號A61K103/10GK102861347SQ20121038042
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月9日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:安徽筑夢生物科技有限公司