用于預(yù)測對癌癥治療的敏感性的生物標記的制作方法
【專利摘要】本申請?zhí)峁┝擞糜陬A(yù)測對癌癥治療的敏感性的生物標記以及生物標記的組合。
【專利說明】用于預(yù)測對癌癥治療的敏感性的生物標記
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本專利申請要求2011年4月I日提交的美國申請61/471，036的優(yōu)先權(quán)，將其內(nèi)容通過引用的方式并入本申請。
【背景技術(shù)】
[0003]當細胞具有最終賦予所述細胞生長優(yōu)勢的突變時，可產(chǎn)生癌癥。體細胞突變包括例如核苷酸堿基替換、缺失、插入、擴增(amplification)和重排。癌癥中發(fā)生的體細胞突變的鑒別提供了關(guān)于癌癥發(fā)展的有價值的信息。所述信息也用于癌癥中的診斷標記和治療革巴標的鑒定(參見例如Bamford et al.(2004)British Journal of Cancer91:355-358.)。已經(jīng)證實與癌癥相關(guān)的體細胞突變的鑒別在臨床情況下是有價值的，例如在區(qū)分對具體療法響應(yīng)的患者群體方面是有價值的(參見例如Lynch et al.(2004)N.Engl.J.Med.350:2129-2139 ;0’ Hare (2004) Bloodl04:2532-2539.)。因此，存在對于鑒別癌癥中發(fā)生的體細胞突變的持續(xù)的需求。
[0004]種系變異或者多態(tài)性為存在于生物體基因組的遺傳性變異。多態(tài)性包括限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLPs)、短串聯(lián)重復(fù)(STRs)和單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。種系變異也可與對于某些疾病包括癌癥的敏感性相關(guān)(參見例如Vierimaa et al.(2006)Science312:1228-1230;Landi et al.(2006) Science313:521-522;Zhu et al.(2004)Cancer Research64:2251-2257.)。因此，存在對于鑒別與癌癥相關(guān)的多態(tài)性的持續(xù)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本申請所述的本發(fā)明滿足上述需求且提供其它益處。
[0006] 申請人:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生物標記可預(yù)測AKT抑制劑在治療過度增殖性疾病諸如癌癥中的有效性。
[0007] 申請人:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些AKT突變可導致中斷AKT PH結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。由所述突變引起的這些區(qū)域之間的中斷似乎可導致AKT的組成性磷酸化以及組成性AKT信號傳導。這些作用也涉及細胞的轉(zhuǎn)化。這些突變帶來對PI3K和變構(gòu)的Akt抑制劑的抗性。因此，所述突變的存在表明PI3K和變構(gòu)的Akt抑制劑的有效劑量將會更高，且也表明還應(yīng)當使用除了 PI3K和/或者變構(gòu)的Akt抑制劑之外的抑制劑，諸如ATP-競爭性Akt抑制劑。單獨使用或者與本申請所述的其它生物標記組合使用的該生物標記用于預(yù)測腫瘤細胞生長對于AKT抑制劑的敏感性，所述AKT抑制劑單獨給予或者與另外的治療性化合物諸如5-FU、鉬制劑(卡鉬、順鉬、奧沙利鉬等)、伊立替康、多西他賽、多柔比星、吉西他濱、SN-38、卡培他濱、替莫唑胺、厄洛替尼、PD-0325901、紫杉醇、貝伐單抗、培妥珠單抗(pertuzumab)、他莫昔芬、雷帕霉素、拉帕替尼、PLX-4032、MDV3100、阿比特龍和⑶C-0973以及其它MEK抑制劑組合使用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0008]圖1描繪了 AKT以及PH和激酶結(jié)構(gòu)域的相互作用(1A和1B)，且還描繪了這些區(qū)域之間的相互作用的定位(1C)。
[0009]圖2描繪了這樣的結(jié)果，其表明被認為中斷PH結(jié)構(gòu)域與激酶結(jié)構(gòu)域的相互作用的在位點的合成突變導致Akt的組成性磷酸化。
[0010]圖3描繪了體細胞突變。
[0011]圖4描繪了表明體細胞突變的結(jié)果，所述體細胞突變導致組成性Akt磷酸化、導致組成性Akt信號傳導。
[0012]圖5描繪了這樣的結(jié)果，其表明Aktl突變體可使細胞轉(zhuǎn)化。
[0013]圖6描繪了這樣的結(jié)果，其表明Aktl突變體帶來對PI3K抑制劑和AKT變構(gòu)抑制劑的抗性。
[0014]圖7描繪了來自用⑶C-0068治療的患者的腫瘤中的pPRAS40T246變化。
[0015]圖8描繪了具有活化的PI3K/AKT途徑的腫瘤。
[0016]圖9描繪了這樣的結(jié)果，其表明高AKT活性分布預(yù)測了對⑶C-0068的敏感性。
[0017]圖10描繪了這樣的結(jié)果，其證實了前列腺和卵巢細胞系中PTEN損失與對GDC-0068的敏感性的強的關(guān)聯(lián)性。該結(jié)果為GDC-0068中標準化單一化合物劑量響應(yīng)的結(jié)
果O
[0018]圖11描繪了這樣的結(jié)果，其證實了 PTEN損失和PIK3CA突變與體外⑶C-0068單一藥物敏感性之間的強的關(guān)聯(lián)性。
[0019]圖12A和12B描繪了在異種移植物模型中的⑶C-0068單一藥物活性(12A)以及體外細胞系篩選數(shù)據(jù)(12B)的結(jié)果，其表明最高百分比的腫瘤生長抑制也已經(jīng)顯示出通過PTEN損失或者PI3K突變的途徑活化。在具有AKT途徑活化(且不具有MEK途徑活化)的模型中觀察到強力的效果。
[0020]圖13描繪了這樣的結(jié)果，其表明各個細胞系的⑶C-0068以及MEK抑制劑的單一藥物敏感性之間的負相關(guān)。
[0021]圖14描繪了這樣的結(jié)果，其證實了在具有AKT途徑活化(PTEN損失、PI3K突變)的細胞系中的強的協(xié)同作用。BLISS分析表明對于⑶C-0068與MEK抑制劑(⑶C-0973)的組合的寬的協(xié)同作用。
[0022]圖15描繪了以下結(jié)果:⑶C-0068與順鉬+5FU的組合作用與AKT途徑活化相關(guān)。使用5FU/順鉬(FOLFOX)的組合篩選(combo screen)顯示出累加效應(yīng)。累加效應(yīng)與以下途徑活化相關(guān):PTEN、ρΑΚΤ、ΡΙ3Κ突變。
[0023]圖16描繪了:ΡΗ-激酶結(jié)構(gòu)域接觸位點突變導致AKT活化。(A)穩(wěn)定表達單獨的空載體(empty vector, EV)、野生型(WT)、豆蘧?；?Myr)或者E17K AKTl或者它們與MEK1N3的組合的BaF3細胞的獨立于IL-3的增殖。(B)AKTl與變構(gòu)抑制劑(PDB AccessionCode3096)的絡(luò)合物的PH和KD的“開卷(open book) ”的描繪。(C)描繪用于評估AKT1PH-KD界面突變的作用的篩選的示意圖。(D) PH-KD界面突變促進了 BaF3細胞的獨立于IL-3的增殖。(E)穩(wěn)定表達空載體以及指定的AKTl結(jié)構(gòu)的NIH3T3細胞的免疫印跡分析。
[0024]圖17描繪了人類癌癥的體細胞AKT突變。AKT家族成員中存在體細胞突變。水平的黑色條帶表不保留在AKT1、2和3之間的殘基?！揪唧w實施方式】
[0025]目前的結(jié)構(gòu)研究表明具有抑制作用的區(qū)域間相互作用在調(diào)節(jié)AKT活化中起到關(guān)鍵作用。使用突變篩選，此時顯示出AKT活化可由在PH-激酶結(jié)構(gòu)域接觸中涉及的殘基的突變導致。此外，報道了在人類癌癥中新的突變的鑒別，其中一些涉及在PH-KD界面的殘基。
[0026]除了先前鑒別的突變E17K之外，在臨床樣品中鑒別的AKTlPH結(jié)構(gòu)域突變體L52R和激酶結(jié)構(gòu)域突變體D323H介導了細胞轉(zhuǎn)化且在體內(nèi)是致癌的。對全長AKTl的結(jié)構(gòu)的考察顯示出E17、L52和D323位于PH-KD界面且預(yù)測出在這些位置上的替換可干擾PH-KD結(jié)合。與此相一致的是，在2-雜交物測定中，L52R和D323H均使得PH-KD結(jié)合減弱。此前，E17K的活化機制已經(jīng)歸因于改變的脂質(zhì)結(jié)合特異性。這些結(jié)果表明對區(qū)域間的相互作用的干擾為作為E17K活化基礎(chǔ)的另外的機制。這些發(fā)現(xiàn)一起表明此處鑒別的AKT1PH-KD界面突變的致癌性源自于區(qū)域間接觸的脫穩(wěn)定化。
[0027]靶標PI3K-AKT途徑成員(包括AKT)的抑制劑目前處于開發(fā)的各個階段。先前的研究已經(jīng)顯示AKT變構(gòu)抑制劑需要完整的PH-KD界面，由此所述抑制劑優(yōu)先結(jié)合閉合的“PH-入”構(gòu)象。與此相一致的是，優(yōu)選打開的(“PH-出”)構(gòu)象的AKT的突變顯示出對變構(gòu)的AKT抑制劑的降低的敏感性，盡管它們保留對ATP-競爭性抑制劑的敏感性。這表明AKT突變狀態(tài)針對在臨床上抑制劑的選擇而言具有重要關(guān)聯(lián)。盡管AKT突變可發(fā)揮作為初始腫瘤中的驅(qū)動器的功能，但是其也可由于對藥物響應(yīng)而在腫瘤中發(fā)生，所述藥物靶向AKT途徑的上游組分。
[0028]在某些實施方案中，B-Raf或者K-Ras突變的存在為負性預(yù)測因子(即禁忌的)且所述患者應(yīng)當由接受AKT抑制劑諸如⑶C-0068的治療組選出。
[0029]⑶C-0068以及相似的ATP競爭性抑制劑優(yōu)先靶向活化的Akt且通過阻斷脫磷酸化將Akt鎖定為高度磷酸化而又失活狀態(tài)。pAkt的增加可用作針對GDC-0068和相似的ATP競爭性抑制劑的作用的藥效學生物標記(“ro生物標記”)。
[0030]在本發(fā)明的某些實施方案中，pGSK-3 β或者PRAS40可用作針對AKT抑制劑諸如⑶C-0068的藥效學生物標記。此外，在某些實施方案中，化合物諸如⑶C-0068的適當劑量可基于AKT途徑的抑制使用H)生物標記例如pGSK-3 β或者PRAS40進行確定和調(diào)整(參見圖7)。
[0031]本申請還提出了⑶C-0068以及相似的ATP競爭性抑制劑針對高度活化的Akt更
具有活性。
[0032]活化的Akt的優(yōu)先靶向可發(fā)揮與致癌基因加入相一致的作用以增加⑶C-0068以及相似的ATP競爭性抑制劑對于腫瘤的治療指數(shù)，其具有高度穩(wěn)態(tài)水平的活化的Akt，包括由Akt突變、PTEN損失(半合子型或者純合子型)、INPP4B功能損傷、PHLPP功能損傷、PP2A功能損傷、PI3K突變以及Her2和/或者Her3擴增引起的那些。
[0033]在無PTEN或者具有PI3K突變的腫瘤中例如在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中預(yù)測⑶C-0068有效性。
[0034]PTEN損失為在例如胰腺癌中的預(yù)測與MEK抑制劑的協(xié)同作用的生物標記。
[0035]因此，⑶C-0068活性與AKT途徑活化相關(guān)(例如選擇性相關(guān))。該關(guān)系的證據(jù)在細胞系以及異種移植物研究中被證實。[0036]PTEN損失、PI3K激酶結(jié)構(gòu)域突變以及高ρΑΚΤ水平是重要的標記，其預(yù)測了化合物例如作為單一藥物的活性；具有與化學治療化合物的組合的累加效應(yīng)，以及具有例如與MEK抑制劑的協(xié)同作用。有趣的是，與MEK抑制劑的協(xié)同作用觀察到伴隨有MEK途徑活化。相反地，MEK途徑活化(例如KRAS/BRAF)為針對單一藥物活性(例如⑶C-0068)的抗性的標記。化合物活性例如⑶C-0068活性的其它潛在的預(yù)測因子包括RTK驅(qū)動途徑活化(乳腺癌中的HER2，胃癌中的HER2和Met)、AKTIE17K突變、AKT2擴增、AKT3過表達以及PI3K擴增。
[0037]表A基于來自文獻的報道，針對胃癌、前列腺癌以及胰腺癌的生物標記的普遍性的現(xiàn)行評估
【權(quán)利要求】
1.預(yù)測腫瘤細胞生長對AKT抑制劑的敏感性的方法，包括確定AKT突變的存在，其中所述AKT突變的存在與所述細胞對AKT抑制劑的敏感性相關(guān)聯(lián)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述AKT突變的存在與所述細胞對ATP競爭性AKT抑制劑的增加的敏感性相關(guān)聯(lián)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述AKT突變的存在與所述細胞對變構(gòu)的AKT抑制劑的降低的敏感性相關(guān)聯(lián)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述AKT突變的存在與所述細胞對泛-PI3KAKT抑制劑的降低的敏感性相關(guān)聯(lián)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述突變對應(yīng)于表1、表2、圖2、圖3、圖16或者圖17中所述的突變或者與所述突變一致。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述突變對應(yīng)于L52、K189或者D323或者與L52、K189或者D323 —致。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述AKT為AKT1、AKT2或者AKT3。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述AKT為AKTl。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所述AKT突變中斷了AKT的PH-結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述AKT突變增加了AKT的磷酸化。
11.權(quán)利要求10的方法，其中磷酸化的增加是由于組成性磷酸化。
12.權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中所述方法進一步包括確定所述細胞的PTEN狀態(tài)，其中PTEN損失與對所述抑制劑的增加的敏感性相關(guān)聯(lián)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述腫瘤細胞為卵巢癌或者前列腺癌腫瘤細胞。
14.權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中所述方法進一步包括確定所述細胞的PI3K突變的存在，其中所述PI3K突變的存在與對經(jīng)所述抑制劑產(chǎn)生的抑制的增加的敏感性相關(guān)聯(lián)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述PI3K突變?yōu)镠1047R和H1047L中的一種或者兩種。
16.權(quán)利要求1-15中任一項的方法，其中所述方法進一步包括確定所述細胞的pAKT分布，其中pAKT的高活性分布與對經(jīng)所述抑制劑產(chǎn)生的抑制的增加的敏感性相關(guān)聯(lián)。
17.權(quán)利要求1-16中任一項的方法，其中所述方法進一步包括確定所述細胞的pAKT分布，其中pAKT的低活性分布與對經(jīng)所述抑制劑產(chǎn)生的抑制的降低的敏感性相關(guān)聯(lián)。
18.權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中所述方法進一步包括確定所述細胞的Her2和/或者Her3狀態(tài)，其中所述細胞的Her2+和/或者Her3+狀態(tài)與對經(jīng)所述抑制劑產(chǎn)生的抑制的增加的敏感性相關(guān)聯(lián)。
19.權(quán)利要求1-18中任一項的方法，其中所述方法進一步包括確定所述細胞的Met激酶突變的存在，其中Met激酶突變的存在與所述細胞對AKT抑制劑的敏感性相關(guān)聯(lián)。
20.權(quán)利要求1-19中任一項的方法，其中所述方法進一步包括確定所述細胞的B-Raf或者K-Ras突變的存在，其中B-Raf或者K-Ras突變的存在與所述細胞對AKT抑制劑的敏感性降低相關(guān)聯(lián)。
21.權(quán)利要求1-20中任一項的方法，其中所述方法進一步包括確定F0X03a在所述細胞的定位分布，其中F0X03a的細胞質(zhì)定位分布與所述細胞對經(jīng)Akt抑制劑產(chǎn)生的抑制的敏感性相關(guān)聯(lián)。
22.權(quán)利要求1-12或者14-21中任一項的方法,其中所述腫瘤細胞為前列腺癌細胞、卵巢癌細胞、乳腺癌細胞、胃癌細胞或者胰腺癌細胞。
23.權(quán)利要求23的方法，其中所述腫瘤細胞為內(nèi)分泌耐藥性乳腺癌細胞。
24.權(quán)利要求1-23中任一項的方法，其中所述方法進一步包括確定所述細胞的INPP4B、PHLPP和/或者PP2A狀態(tài)，其中INPP4B、PHLPP和/或者PP2A損失與對抑制劑的增加的敏感性相關(guān)聯(lián)。
25.權(quán)利要求1-24中任一項的方法，其中所述AKT抑制劑為(S)-2-(4-氯苯基)-1-(4-((51?，710-7-羥基-5-甲基-6，7-二氫-5!1-環(huán)戊二烯并[d]嘧啶_4_基)哌嗪-1-基)-3-(異丙基氨基)丙-1-酮或者其藥用鹽。
26.權(quán)利要求1-25中任一項的方法，進一步包括由患者獲得生理學樣品以確定AKT突變的存在。
27.權(quán)利要求26的方法，進一步包括確定AKT突變在生理學樣品中的存在。
28.權(quán)利要求1-27中任一項的方法，進一步包括告知確定了存在AKT突變的患者應(yīng)該給予AKT抑制劑。
29.權(quán)利要求1-27中任一項的方法，進一步包括告知確定了存在AKT突變的患者不應(yīng)給予AKT抑制劑。
30.治療癌細胞的方法，所述癌細胞包括PI3k、PTEN和AKT突變中的一種或者多種，所述方法包括對所述細胞·給予GDC-0068或者其鹽。
【文檔編號】G01N33/48GK103858007SQ201280027029
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月1日
【發(fā)明者】K.林, E.龐努斯, S.塞沙吉里 申請人:基因泰克公司