基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的人a群鏈球菌快速檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人 A群鏈球菌（groupAstreptococci,GAS) (111，3,5,6,24血清型）抗原的快速檢測(cè)方法及 檢測(cè)試劑盒，以及該檢測(cè)試劑盒的制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鏈球菌廣泛分布于自然界和動(dòng)物體內(nèi)，可長(zhǎng)期寄居于人體鼻咽部和腸道中。為革 蘭氏陽(yáng)性菌，呈球狀或卵圓形，為需氧或兼性厭氧菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高。鏈球菌種類繁多，根 據(jù)溶血能力分為a、P、Y溶血性鏈球菌，又稱之甲型、乙型、丙型溶血性鏈球菌。根據(jù)鏈球 菌胞壁所含多糖（C抗原）的不同分為A~V等20族（其中缺I和J)，（Lancefield分型）。 對(duì)人類有致病性的鏈球菌90%屬于A群。鏈球菌C抗原的外層還具有M、T、R、S4種型特 異性抗原。M抗原主要見(jiàn)于A群，根據(jù)M抗原的不同又可分為90多個(gè)血清型，其中在我國(guó)能 引起風(fēng)濕熱的臨床上最常見(jiàn)的血清型為組，10』5，116，1118，1124等。八群鏈球菌&仰即八 streptococci,GAS)又稱化膿性鏈球菌（streptococcuspyogenes)，為0溶血性鏈球菌。 A群鏈球菌感染和后遺癥一直是困擾公共健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的嚴(yán)重問(wèn)題，尤對(duì)兒童和青年影 響最大。A群鏈球菌感染最常發(fā)生于冬春季和雨季，在兒童發(fā)病年齡多見(jiàn)于5~15歲，臨床 可把A群鏈球菌感染分為四類：①淺表部位感染：咽炎、皮膚和軟組織感染、膿皰瘡、丹毒、 陰道炎、產(chǎn)后感染；②深部感染：菌血癥、壞死性筋膜炎、深部組織感染、蜂窩織炎、肌炎、膿 毒敗血癥、心包炎、腦膜炎、肺炎、化膿性關(guān)節(jié)炎；③毒素介導(dǎo)：猩紅熱、鏈球菌中毒性休克 綜合征；④免疫介導(dǎo)：風(fēng)濕熱、鏈球菌感染后腎小球腎炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。
[0003] 臨床病人由于不同的呼吸道病原體（如副流感病毒、流感嗜血桿菌、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、腺病毒等）感染引起疾病癥狀可以十分相似，這導(dǎo)致了流行診斷比較困難， 確診往往依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷?？焖儆行У脑\斷方法應(yīng)該是在疾病的發(fā)病初期就可以得到明 確的診斷，便于實(shí)施針對(duì)性的治療，阻止病情的發(fā)展遷延。
[0004] 盡管A群鏈球菌在全球范圍內(nèi)傳播，但可用于實(shí)驗(yàn)室診斷的標(biāo)準(zhǔn)化商品試劑的種 類極少。目前，A群鏈球菌的檢測(cè)主要有以下幾種方法：
[0005] 一、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
[0006] 1、細(xì)菌分離
[0007] 細(xì)菌培養(yǎng)是診斷A群鏈球菌感染的"金標(biāo)準(zhǔn)"。樣本采集后最好立即接種到血瓊脂 培養(yǎng)基上。若無(wú)條件及時(shí)接種，應(yīng)使用轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基。將標(biāo)本接種在血瓊脂平皿，35~37°C， 含有5 %~10 %CO2或厭氧條件下孵育，可增加A群鏈球菌的分離率。血瓊脂平皿孵育24~ 48h。A群鏈球菌菌落常不能與其他P-溶血性鏈球菌區(qū)別，特別是C群和G群，需采用血 清學(xué)方法進(jìn)行最后鑒定。該法培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)，操作步驟繁多，且若采樣前患者使用過(guò)抗菌 藥物，會(huì)造成培養(yǎng)結(jié)果的假陽(yáng)性。這樣在臨床方面對(duì)病人的治療就有一定的局限性。
[0008] 2、血清學(xué)檢測(cè)
[0009]即采用酶聯(lián)免疫法、放免法、微量免疫熒光法等，檢測(cè)被檢者血清中A群鏈球菌抗 體水平，可間接提示A群鏈球菌感染的存在。然而，血清學(xué)試驗(yàn)只能提供一種回顧性的診 斷，它需要同時(shí)檢測(cè)患者急性期和恢復(fù)期的雙份血清，如果恢復(fù)期中抗人A群鏈球菌抗體 效價(jià)比急性期高4倍或4倍以上才有診斷意義。另外，臨床上主要檢測(cè)的抗體為抗鏈球菌 素0,而統(tǒng)計(jì)學(xué)研究表明大約20%的病人并不出現(xiàn)出現(xiàn)抗鏈球菌素0水平的升高，故現(xiàn)有血 清學(xué)方法的檢測(cè)質(zhì)量受到一定限制。
[0010] 二、快速診斷
[0011] 直接檢查人A群鏈球菌蛋白抗原和菌體核酸可達(dá)到快速診斷的目的，目前主要有 免疫熒光法、免疫酶法和PCR法等。免疫熒光法和免疫酶法均不能進(jìn)行一步檢測(cè)，均存在操 作步驟復(fù)雜，需要專業(yè)人員操作，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)（2h以上），成本較高等缺點(diǎn)。PCR法主要是檢 測(cè)鏈球菌特異性rRNA序列，其檢測(cè)快速、靈敏、特異，是目前研究A群鏈球菌感染的重要手 段，但由于PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及操作要求較高，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性，在我國(guó)還不能作為常用的 臨床診斷方法。目前，檢測(cè)人A群鏈球菌抗原的方法主要為膠體金法檢測(cè)其C多糖抗原，但 是膠體金法敏感度較低，對(duì)樣品材料質(zhì)量要求較高，同時(shí)在檢測(cè)前還必須對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)胞 裂解以釋放C多糖，而添加細(xì)胞裂解液的量又對(duì)檢測(cè)靈敏度有較大的影響。因此，建立具備 高靈敏度的A群鏈球菌特異性抗原快速診斷法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 針對(duì)【背景技術(shù)】中存在的這些技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn) 標(biāo)記的能簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的檢測(cè)人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）抗原的檢測(cè)方 法和試劑盒，以及該試劑盒的制備及使用方法。
[0013] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0014] -種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）抗 原的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：
[0015] 1)兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體的制備；
[0016] 2)鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體的制備；
[0017] 3)將步驟1)制備得到的兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體與納 米磁珠通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制備抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠；
[0018] 4)將步驟2)制備得到的鼠抗人A群鏈球菌1，3,5,6,24型11蛋白多克隆抗體與納 米量子點(diǎn)通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌納米探針；
[0019] 5)取人呼吸道分泌物樣本（包括但不限于咽拭子），用PBST緩沖液溶解后，加入 步驟3)制備得到的抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠，充分混合，反應(yīng)10-45min后進(jìn)行磁分 離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟4)制備得到的量子點(diǎn)標(biāo) 記的抗人A群鏈球菌納米探針，反應(yīng)10-45min后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，使 用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光值；所述PBST緩沖液中各組分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/LKC1， 0? 24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4,0? 3g/LNaN3,0? 5ml/LTween-20;所述PBST緩沖液的pH =7. 4 ;
[0020] 6)根據(jù)步驟1)-步驟5)的方法分別檢測(cè)四份經(jīng)臨床確定為人A群鏈球菌（Ml，3， 5,6,24血清型）陰性的人群的呼吸道分泌物樣品，讀取熒光值；所述人A群鏈球菌（Ml，3， 5,6, 24血清型）陰性的人群的呼吸道分泌物樣品簡(jiǎn)稱人A群鏈球菌陰性對(duì)照樣品；所述四 份人A群鏈球菌陰性對(duì)照樣品的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為CUT-OFF值；若步 驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測(cè)熒光值大于⑶T-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本 中人A群鏈球菌（111，3,5,6,24血清型）抗原為陽(yáng)性；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本的 檢測(cè)熒光值小于⑶T-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人A群鏈球菌（Ml，3, 5,6, 24 血清型）抗原為陰性。
[0021] -種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人A群鏈球菌（Ml，3,5,6,24血清型）抗 原的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒由具有富集人A群鏈球菌（M1，3, 5,6, 24血清型）抗 原功能的抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠、量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人A群鏈球菌納米探針、質(zhì)控品以 及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì)控品包括陽(yáng)性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；所述陽(yáng)性質(zhì)控品由滅 活的人Ml血清型A群鏈球菌干燥結(jié)合到拭子上而成；所述陰性質(zhì)控品是經(jīng)臨床確定為人A 群鏈球菌（M1，3, 5,6, 24血清型）陰性的人群的咽拭子。
[0022] -種用于制備基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人A群鏈球菌（M1，3, 5,6, 24血 清型）抗原的試劑盒的方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：
[0023] 1)抗人A群鏈球菌免疫納米磁珠的制備：
[0024] 1.1)兔及鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體IgG的制備
[0025] I.I. 1)重組M-His融合蛋白的制備、純化：
[0026]I.I.I. 1)對(duì)人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分別獲取 其N(xiāo)端型特異性序列（高變區(qū)）中含胞外抗原表位且不與其他抗原抗體起交叉反應(yīng)的的肽 段；
[0027]I.I. 1. 2)找到步驟I.I.I. 1)中所得到五個(gè)肽段一一對(duì)應(yīng)的基因編碼序列，按 M1-M3-M5-M6-M24的順序進(jìn)行序列拼接并根據(jù)大腸桿菌中密碼子的偏好性對(duì)該序列進(jìn)行密 碼子優(yōu)化，在上述經(jīng)密碼子優(yōu)化后的重組基因的序列的5'端及3'端引入酶切位點(diǎn)并化學(xué) 合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為m;其基因序列參見(jiàn)序列表；
[0028]I. 1. 1.3)將步驟I. 1. 1.2)中所得到的m按分子生物學(xué)方法克隆入表達(dá)載體 pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組M-His融合蛋白；所述重組M-His融合蛋白以可溶 性表達(dá)方式存在于菌體中；
[0029]I.I. 1. 4)用鎳柱純化步驟I.I. 1. 3)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后， 以Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度為0. 2mg/mL后備用；
[0030]I. 1. 2)兔及鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[0031]I. 1. 2. 1)以步驟I.I. 1. 4)中所得到的重組M-His融合蛋白為完全抗原，分別免疫 新西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清及鼠抗人A 群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清；所述兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血 清及鼠抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型M蛋白抗血清的間接ELISA效價(jià)均大于IXIO5 ;所述 間接ELISA是重組M-His融合蛋白作為包被抗原為基礎(chǔ)；
[0032]I. 1. 2. 2)采用ProteinG親和層析柱分別純化兔抗人A群鏈球菌1，3, 5,6, 24型 M蛋白抗血清及鼠抗人A群鏈球菌1，3，5，6，24型M蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG;
[0033]I. 1. 2. 3)用凱基Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定步驟I. 1. 2. 2)所得到的多克 隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為lmg/mL后備用；
[0034]I. 2)免疫納米磁珠的包被：
[0035] 1. 2. 1)取5mg磁珠，用ImlMES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離 后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、粒徑為350nm的羧基磁珠；所述MES緩 沖液是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代）乙磺酸；所述MES緩沖液的pH= 6. 0 ;所述納米 磁分離器的磁性強(qiáng)度是〇. 4T;
[0036]L2. 2)依次加入用步驟L2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC 溶液以及用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各 0. 5ml，以10-40rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除 上清，用Iml步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0037] 1. 2. 3)取5個(gè)離心管，在每個(gè)離心管中加入200iiL步驟1. 2. 2)所得到的活化后 的磁珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀 釋的濃度為50-300iig/ml的由步驟I. 1)所制備的兔抗人A群鏈球菌1，3,5,6,24型M蛋 白多克隆抗體IgG溶液各lml，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2-6h，置于納米磁 分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫 下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖 液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2PO4,1. 44g/LNa2HPO4，所述PBS 緩沖液的pH= 7. 4 ;
[0038]I. 2. 4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個(gè)離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移 除上清，各用Iml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.2