基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎衣原體快速檢測方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人 肺炎衣原體（Chlamydiapneumoniae，Cpn)抗原的快速檢測方法及檢測試劑盒，以及該檢測 試劑盒的制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎衣原體（Chlamydiapneumoniae,Cpn)作為衣原體屬的一種重要的呼吸道病 原微生物，自從上個(gè)世紀(jì)80年代中期由Grayston等人正式命名，在隨后的時(shí)間里被研究者 們廣泛研究。現(xiàn)僅知人是該病原體的宿主，感染方式可能為人與人之間通過呼吸道分泌物 傳播。5歲以下兒童極少受染，8歲以上兒童及青年易被感染，尤其是人群聚集處，如家庭、 學(xué)校、兵營中易流行，經(jīng)血清流行病學(xué)調(diào)查，證實(shí)成人中至少有40%已受到該衣原體感染， 大部分為亞臨床型。肺炎衣原體是專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，寄居于人呼吸道和咽喉等處， 在兒童和成人中產(chǎn)生上呼吸道和呼吸道感染，常引起肺炎和支氣管炎等呼吸道疾病。目前 研究表明，其還與動脈粥樣硬化綜合癥、老年癡呆癥、心肌炎、哮喘等疾病有關(guān)。臨床上由于 其與其他呼吸道病原體引起的感染癥狀類似，因此常難以根據(jù)臨床表現(xiàn)、x-射線檢查等得 出結(jié)論，確診往往依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷?？焖儆行У脑\斷方法應(yīng)該是在疾病的發(fā)病初期就可 以得到明確的診斷，便于實(shí)施針對性的治療，阻止病情的發(fā)展遷延。
[0003] 盡管肺炎衣原體在全球范圍內(nèi)傳播，但可用于實(shí)驗(yàn)室診斷的標(biāo)準(zhǔn)化商品試劑的種 類極少。目前，肺炎衣原體感染的診斷方法有血清學(xué)檢測法，核酸檢測法和病原體直接檢 測法。檢測血清中肺炎衣原體IgG、IgA、IgM抗體常用的有5種方法：微量免疫熒光抗體 檢測（MIF)，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF)，重組酶免疫測定（rEIA)，血清補(bǔ)體結(jié)合一酶免疫測定試驗(yàn) (SeroCF-EIA)，0Y酶免疫試劑盒（LoY-EIA)。這5種方法要求肺炎衣原體不同成分做為 抗原，而且肺炎衣原體抗體的檢出只能說明該個(gè)體感染過肺炎衣原體，卻不能反映體內(nèi)是 否仍有肺炎衣原體活菌存在，并且血清學(xué)特異性抗體檢測常需要根據(jù)IgM抗體的動態(tài)結(jié)果 進(jìn)行判斷，需要較長的時(shí)間。同時(shí)，這些技術(shù)均存在靈敏度低、操作步驟復(fù)雜、需要專業(yè)人員 操作、重復(fù)性差、檢測時(shí)間長、檢測特異性差、成本較高等缺陷，因而難以滿足臨床的實(shí)際需 要。
[0004] 核酸檢測包括核酸雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，核酸雜交檢測肺炎衣原體的特 異性強(qiáng)，但敏感性不高，主要用于PCR結(jié)果的檢測、判定，尚未直接用于臨床標(biāo)本的檢測； PCR具有較高的敏感性，應(yīng)用肺炎衣原體外膜蛋白基因片段的一對特異性引物對臨床咽拭 子進(jìn)行PCR測定，其結(jié)果與血清學(xué)檢測具有較好的一致性。但PCR實(shí)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)室有特殊要 求，標(biāo)本處理、擴(kuò)增和檢測要求嚴(yán)格，且易出現(xiàn)假陽性，在我國還不能作為常用的臨床診斷 方法。
[0005] 抗原檢測方法有雞胚卵黃囊分離培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)法（常用HL和Hep-2兩種細(xì) 胞），然后采用熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記抗體檢測標(biāo)本中的衣原體，但該法存在操作步驟復(fù)雜，細(xì) 胞培養(yǎng)時(shí)間長等明顯缺陷，并不適合臨床應(yīng)用。近年也嘗試直接應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢驗(yàn)，其 敏感性與標(biāo)本采集有關(guān)：痰液和咽拭子涂片后用EIA可檢測肺炎衣原體抗原的存在，其敏 感性、特異性和可重復(fù)性不理想，且僅限于急性呼吸道感染；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)也 可以直接檢出病原體，主要檢測肺炎衣原體外膜蛋白-2,所用抗體為抗衣原體屬特異性抗 體，不能直接識別肺炎衣原體，與"金標(biāo)準(zhǔn)"（MIF)相比，雖然很靈敏，特異性卻不高。
[0006] 因此，目前建立具高靈敏度、高特異性的人肺炎衣原體抗原快速檢測法以滿足臨 床的檢測需求就顯得非常必要了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對【背景技術(shù)】中存在的這些技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn) 標(biāo)記的能簡便、快速、高靈敏度的檢測人肺炎衣原體抗原的檢測方法和試劑盒，以及該試劑 盒的制備及使用方法。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人肺炎衣原體抗原的方法，其特征在于： 所述方法包括以下步驟：
[0010] 1)兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體的制備；
[0011] 2)鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體的制備；
[0012] 3)將步驟1)制備得到的兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體與納米磁珠通 過共價(jià)偶聯(lián)，制備抗人肺炎衣原體免疫納米磁珠；
[0013] 4)將步驟2)制備得到的鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體與納米量子點(diǎn) 通過共價(jià)偶聯(lián)，制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎衣原體納米探針；
[0014] 5)取人呼吸道分泌物樣本（包括但不限于咽拭子），用樣品處理液溶解后，加入步 驟3)制備得到的抗人肺炎衣原體免疫納米磁珠，充分混合，反應(yīng)10-45min后進(jìn)行磁分離， 以PBST緩沖液2遍后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟4)制備得到的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗 人肺炎衣原體納米探針，反應(yīng)l〇_45min后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，使用熒 光酶標(biāo)儀讀取熒光值；所述樣品處理液中各組分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/LKC1，0. 24g/ LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.3g/LNaN3，10ml/LNonidetP-40，lml/LSDS;所述樣品處理 液口11 = 7.4;所述？831'緩沖液中各組分含量如下抑/1恥(^，0.28/11((：1，0.248/1腿2?0 4， 1. 44g/LNa2HP04,0. 3g/LNaN3,0. 5ml/LTween-20 ;所述PBST緩沖液pH= 7. 4 ;
[0015] 6)根據(jù)步驟1)-步驟5)的方法分別檢測四份經(jīng)臨床確定為人肺炎衣原體陰性的 人群的呼吸道分泌物樣品，讀取熒光值；所述人肺炎衣原體陰性的人群的呼吸道分泌物樣 品簡稱人肺炎衣原體陰性對照樣品；所述四份人肺炎衣原體陰性對照樣品的熒光值的平均 值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為⑶T-0FF值；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測熒光值大于 CUT-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人肺炎衣原體抗原為陽性；若步驟5)中人呼 吸道分泌物樣本的檢測熒光值小于⑶T-0FF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人肺炎衣 原體抗原為陰性。
[0016] -種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人肺炎衣原體抗原的試劑盒，其特征在 于：所述試劑盒由具有富集人肺炎衣原體抗原功能的抗人肺炎衣原體免疫納米磁珠、量子 點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎衣原體納米探針、質(zhì)控品、樣品處理液以及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì) 控品包括陽性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；所述陽性質(zhì)控品由滅活的人肺炎衣原體干燥結(jié)合到 拭子上而成；所述陰性質(zhì)控品是經(jīng)臨床確定為人肺炎衣原體陰性的人群的咽拭子。
[0017] -種用于制備基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人肺炎衣原體抗原的試劑盒的 方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：
[0018] 1)抗人肺炎衣原體免疫納米磁珠的制備：
[0019] 1. 1)兔及鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG的制備
[0020] 1. 1. 1)重組M98-His融合蛋白的制備、純化：
[0021] 1. 1. 1. 1)對人肺炎衣原體98KD膜蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取其胞外保守結(jié) 構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段；
[0022] 1. 1. 1. 2)找到步驟1. 1. 1. 1)中所得到肽段對應(yīng)的基因編碼序列，在上述基因序 列的5'端及3'端引入酶切位點(diǎn)并化學(xué)合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為m98 ;其基因序列參 見序列表；
[0023] 1. 1. 1.3)將步驟1. 1. 1.2)中所得到的m98按分子生物學(xué)方法克隆入表達(dá)載體 pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組M98-His融合蛋白；所述重組M98-His融合蛋白以 包涵體表達(dá)方式存在于菌體中；
[0024] 1. 1. 1. 4)用鎳柱純化步驟1. 1. 1. 3)所得到的重組蛋白，SDS-PAGE檢測其純度后， 以Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度為0. 2mg/mL后備用；
[0025] 1. 1. 2)兔及鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[0026] 1. 1. 2. 1)以步驟1. 1. 1. 4)中所得到的重組M98_His融合蛋白為完全抗原，分別免 疫新西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白抗血清及鼠抗人肺炎衣 原體98KD膜蛋白抗血清；所述兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白抗血清及鼠抗人肺炎衣原體 98KD膜蛋白抗血清的間接ELISA效價(jià)均大于1X105 ;
[0027] 1. 1. 2. 2)采用ProteinG親和層析柱分別純化兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白抗 血清及鼠抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG;
[0028] 1. 1. 2. 3)用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定步驟1. 1. 2. 2)所得到的二種 多克隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為lmg/mL后備用；
[0029] 1. 2)免疫納米磁珠的包被：
[0030] 1. 2. 1)取5mg磁珠，用1mlMES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離 后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe304為內(nèi)核、粒徑為350nm的羧基磁珠；所述MES緩 沖液是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代）乙磺酸；所述MES緩沖液的pH= 6. 0 ;所述納米 磁分離器的磁性強(qiáng)度是〇. 4T;
[0031] 1. 2. 2)依次加入用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC 溶液以及用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各 0. 5ml，以10-40rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除 上清，用lml步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0032] 1.2. 3)取5個(gè)離心管，在每個(gè)離心管中加入200iiL步驟1.2. 2)所得到的活化 后的磁珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液 稀釋的濃度為50-200iig/ml的由步驟1. 1)所制備的兔抗人肺炎衣原體98KD膜蛋白多克 隆抗體IgG溶液各lml,室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2-6h，置于納米磁分離 器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入lml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以 15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖液中 各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04，所述PBS緩沖 液的pH= 7. 4 ;
[0033] 1. 2. 4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個(gè)離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移 除上清，各用lml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.5ml/LTween-20,所述洗滌緩沖液的pH= 7.4 ；
[0034] 1. 2. 5)向各個(gè)離心管中分別加入lml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)溆茫?所述保存緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/L Na2HP04,0. 3g/LNaN3,5g/L牛血清白蛋白（BSA)，所述保存緩沖液的pH= 7. 4 ;
[0035] 2)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎衣原體納米探針的制備：
[0036] 其具體制備方法包括：
[0037] 2. 1)向微量離心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子點(diǎn)、300nmolN-羥基琥珀酰 亞胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，混合溶液，37°C反 應(yīng)30min后，透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及E：DC，得到活化后的量子點(diǎn)；所述 磷酸鹽緩沖液中各成分含量