基于磁性分離和多色量子點標(biāo)記的人流感病毒分型檢測的方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于磁性分離和多色量子點標(biāo)記的檢 測人流感病毒抗原的快速檢測方法及檢測試劑盒，以及該檢測試劑盒的制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒病毒，簡稱流感病毒，是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病 毒，在分類學(xué)上，流感病毒屬于正黏液病毒科，它會造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅 速的傳播，在世界各地常會有周期性的大流行。病毒最早是在1933年由英國人威爾遜?史 密斯（WilsonSmith)發(fā)現(xiàn)的，他稱為H1N1。H代表血凝素；N代表神經(jīng)氨酸酶。數(shù)字代表 不同類型。
[0003] 流感病毒呈球形或絲狀，直徑80~120nm。病毒由三層構(gòu)成，內(nèi)層為病毒核衣殼， 含核蛋白（NP)、P蛋白和RNA。NP是可溶性抗原（S抗原），具有型特異性，抗原性穩(wěn)定。P 蛋白（P1、P2、P3)可能是RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所需的多聚酶。中層為病毒囊膜，由一層類脂體和 一層膜蛋白（MP)構(gòu)成，MP抗原性穩(wěn)定，也具有型特異性。外層為兩種不同糖蛋白構(gòu)成的輻 射狀突起，即血凝素（hemagglutinin,H)和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase,N)。H能引起紅細 胞凝集，是病毒吸咐于敏感細胞表面的工具，N則能水解粘液蛋白，水解細胞表面受體特異 性糖蛋白末端的N-乙酰神經(jīng)氨酸，是病毒復(fù)制完成后脫離細胞表面的工具。H和N均有變 異特性，故只有株特異的抗原性，其抗體具有保護作用。
[0004] 根據(jù)NP抗原性，將流感病毒分為甲、乙、丙三型。按H和N抗原不同，同型病毒又 分若干亞型。臨床上流行的絕大部分為甲型及乙型，丙型較為罕見。流感病毒的臨床特征 與病毒毒株、人群年齡、生理狀況等相關(guān)，主要表現(xiàn)發(fā)熱、畏寒、干咳、頭痛、喉嚨痛、周身不 適、乏力、鼻塞和流涕等。該病潛伏期短，傳染性強，傳播迅速，對嬰幼兒、年邁者及體質(zhì)弱的 人危害較大。三型流感中以甲型流感威脅最大。由于流感病毒致病力強，易發(fā)生變異，若人 群對變異株缺乏免疫力，則易引起暴發(fā)流行，已有數(shù)千萬人死亡，對社會影響甚大。
[0005] 由于流感癥狀與副流感病毒肺炎、呼吸道合胞病毒肺炎及腺病毒肺炎臨床上幾乎 無法區(qū)別，不做病原學(xué)檢查，很難確診流感病毒感染。因此建立簡便、快速、可行、能早期診 斷流感病毒感染的方法非常必要。
[0006]目前流感病毒的檢測方法主要有3類：一是分離培養(yǎng)法，其是證實感染的"金標(biāo) 準(zhǔn)"，但由于培養(yǎng)周期較長，操作步驟較多，導(dǎo)致該法在臨床上不能進行快速診斷；二是血清 學(xué)方法，即采用酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法、微量免疫熒光法和間接血凝試驗等，檢測被檢 者血清中流感病毒抗體水平，可間接提示流感病毒感染的存在。然而，血清學(xué)試驗只能提供 一種回顧性的診斷，而且有時需要雙份血清。另外，抗體出現(xiàn)的時機不易掌握，兒童、青少 年與成人之間又存在流感病毒特異性抗體的差異，故現(xiàn)有血清學(xué)方法的檢測質(zhì)量受到一定 限制；三是利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測流感病毒DNA的存在，其中最常用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（PCR)，該方法快速、靈敏、特異，是目前研究人流感病毒感染的重要手段，但由于PCR對 實驗設(shè)備以及操作要求較高，且易出現(xiàn)假陽性，在我國還不能作為常用的臨床診斷方法。因 此，建立人流感病毒特異性抗原診斷方法十分必要。目前，已公開報道的檢測人流感病毒抗 原的方法主要為雙抗夾心ELISA法、膠體金免疫層析法、間接免疫熒光法等，但這些方法或 存在操作步驟繁多、檢測時間長，或存在檢測靈敏度低、檢測成本高等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對【背景技術(shù)】中存在的這些技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和多色量 子點標(biāo)記的能簡便、快速、高靈敏度的分型檢測人流感病毒抗原的檢測方法和試劑盒，以及 該試劑盒的制備及使用方法。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0009] -種基于磁性分離和多色量子點標(biāo)記的人流感病毒抗原分型檢測的方法，其特 征在于：所述方法包括以下步驟：
[0010] 1)分別將兔抗人甲、乙型流感病毒NP蛋白多克隆抗體與納米磁珠通過共價偶聯(lián)， 分別制備抗人甲型流感病毒免疫納米磁珠及抗人乙型流感病毒免疫納米磁珠；將抗人甲型 流感病毒免疫納米磁珠及抗人乙型流感病毒免疫納米磁珠等量混合即制得抗人流感病毒 免疫納米磁珠；
[0011] 2)將鼠抗人甲型流感病毒NP蛋白單克隆抗體與發(fā)射波長為520nm的納米量子點 通過共價偶聯(lián)，制備量子點標(biāo)記的抗人甲型流感病毒納米探針；將鼠抗人乙型流感病毒NP 蛋白單克隆抗體與發(fā)射波長為600nm的納米量子點通過共價偶聯(lián)，制備量子點標(biāo)記的抗人 乙型流感病毒納米探針；將抗人甲型流感病毒納米探針與抗人乙型流感病毒納米探針等量 混合即制得多色量子點標(biāo)記的抗人流感病毒納米探針；
[0012] 3)取人呼吸道分泌物樣本（包括但不限于咽拭子），用樣品處理液溶解后，加入步 驟1)制備得到的抗人流感病毒免疫納米磁珠，充分混合，反應(yīng)l〇_45min后進行磁分離，以 PBST緩沖液洗滌2遍后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟2)制備得到的多色量子點標(biāo)記 的抗人流感病毒納米探針，反應(yīng)l〇_45min后進行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，使用 熒光酶標(biāo)儀在Ex同為405nm，Em分別為520nm及600nm的參數(shù)下分別讀取熒光值；所述樣 品處理液中各組分含量分別為：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04， 0.3區(qū)/1^似隊，51111/11^〇111(16七？-40,51111/1^1'1'；[1:011父-100，所述樣品處理液卩11 = 7.4;所 述PBST緩沖液中各組分含量分別為：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/L Na2HP04,0. 3g/LNaN3,0. 5ml/LTween-20 ;所述PBST緩沖液pH= 7. 4 ;
[0013] 4)根據(jù)步驟1)-步驟3)的方法分別檢測四份經(jīng)臨床確定為人甲、乙型流感病毒均 為陰性的人群的呼吸道分泌物樣品，分別讀取Em分別為520nm及600nm下的熒光值；所述 人甲、乙型流感病毒均為陰性的人群的呼吸道分泌物樣品簡稱人流感病毒陰性對照樣品； 所述四份人流感病毒陰性對照樣品在Em為520nm的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和記 為CUT-0FF1值；所述四份人流感病毒陰性對照樣品在Em為600nm的熒光值的平均值與3 倍標(biāo)準(zhǔn)差之和記為⑶T-0FF2值；若步驟3)中人呼吸道分泌物樣本在Em為520nm的檢測 熒光值大于CUT-0FF1值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人甲型流感病毒抗原為陽性；若 步驟3)中人呼吸道分泌物樣本在Em為520nm的檢測熒光值小于⑶T-0FF1值，則判斷為人 呼吸道分泌物樣本中人甲型流感病毒抗原為陰性；若步驟3)中人呼吸道分泌物樣本在Em 為600nm的檢測熒光值大于CUT-0FF2值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人乙型流感病毒 抗原為陽性；若步驟3)中人呼吸道分泌物樣本在Em為600nm的檢測熒光值小于⑶T-0FF2 值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人乙型流感病毒抗原為陰性。
[0014] 一種基于磁性分離和多色量子點標(biāo)記的人流感病毒抗原分型檢測試劑盒，其特征 在于：所述試劑盒由具有富集人流感病毒抗原功能的抗人流感病毒免疫納米磁珠、多色量 子點標(biāo)記的抗人流感病毒納米探針、質(zhì)控品、樣品處理液以及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì) 控品包括陽性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；所述陽性質(zhì)控品由滅活的人甲、乙流感病毒共同干 燥結(jié)合到拭子上而成；所述陰性質(zhì)控品是經(jīng)臨床確定為人甲、乙流感病毒均為陰性的人群 的咽拭子。
[0015] -種用于制備基于磁性分離和多色量子點標(biāo)記的人流感病毒抗原分型檢測試劑 盒的方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：
[0016] 1)抗人流感病毒免疫納米磁珠的制備：
[0017] 1. 1)取5mg磁珠，用1mlMES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進行磁分離后 移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe304為內(nèi)核、粒徑為1150nm的羧基磁珠；所述MES緩沖 液是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代）乙磺酸；所述MES緩沖液的pH= 6. 0 ;所述納米磁 分離器的磁性強度是0.4T;
[0018] 1. 2)依次加入用步驟L1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC溶液 以及用步驟1. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0. 5ml，以 10-40rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，用 lml步驟1. 1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0019] 1. 3)取5個離心管，在每個離心管中加入200iiL步驟1. 2)所得到的活化后的 磁珠，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋 的濃度為50-200iig/ml的兔抗人甲型流感病毒NP蛋白多克隆抗體溶液各lml，室溫下以 15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2-6h，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清后，各 加入lml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h 以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/ LKC1，0. 24g/LKH2P04,1. 44g/LNa2HP04,所述PBS緩沖液的pH= 7. 4 ;
[0020] 1. 4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個離心管置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上 清，各用lml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/L KC1，0. 24g/LKH2P04,1. 44g/LNa2HP04,0. 5ml/LTween-20,所述洗滌緩沖液的pH= 7. 4 ;
[0021] 1. 5)向各個離心管中分別加入lml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)溆?，?此制得抗人甲型流感病毒免疫納米磁珠；所述保存緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL， 0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.3g/LNaN3,5g/L牛血清白蛋白（BSA)，所 述保存緩沖液的pH= 7. 4 ;
[0022] 1.6)按與步驟1. 1)-1.5)相同的方法利用兔抗人乙型流感病毒NP蛋白多克隆 抗體制得抗人乙型流感病毒免疫納米磁珠；將上述兩種免疫納米磁珠懸液按體積比1:1混 合，即制得抗人流感病毒免疫納米磁珠；
[0023] 2)多色量子點標(biāo)記的抗人流感病毒納米探針的制備：
[0024] 其具體制備方法包括：
[0025] 2. 1)向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點、600nmolN-羥基琥珀酰 亞胺sulfo-NHS以及600nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為2ml，混合溶液，37°C反 應(yīng)30min后，透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及E：DC，得到活化后的量子點；所述 羧基水溶性量子點的發(fā)射波長是520nm;所述磷酸鹽緩沖液中各成分含量如下：2. 9g/L磷 酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述磷酸鹽緩沖液的pH= 7. 4 ;
[0026] 2.2)在步驟2. 1)所得到的活化的量子點中，加入4-16nmol的鼠抗人甲型流感 病毒NP蛋白單克隆抗體，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為 1%，