作為乳腺癌輔助檢測的lincRNA標記物及試劑盒、探針、芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一組用于輔助檢測乳腺癌的基 因間長片段非編碼RNA(lincRNA)標記物，該RNA(lincRNA)標記物是一類位于兩個基因間 區(qū)的非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄本長度超過200堿基的RNA，其長度介于200bp~100kb之間，此類 ncRNA不具有編碼蛋白質(zhì)的功能；另外本發(fā)明還涉及檢測該標記物的相關(guān)試劑盒、試劑盒 中的探針或探針組合以及用于檢測乳腺腫瘤或輔助檢測乳腺腫瘤的生物芯片。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是最常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)生率和致死率居各腫瘤之首。據(jù)統(tǒng)計，2013 年美國的癌癥統(tǒng)計研宄報告中，大約有23. 24萬女性罹患乳腺癌，占女性所有新發(fā)惡性腫 瘤的29%，占全部女性所患癌癥總?cè)藬?shù)的29%，位列婦女惡性腫瘤的首位，有約4萬人死于 乳腺癌，占因癌癥造成死亡的14%，在女性因癌癥死亡率居第二位，僅次于肺癌。其中50% 乳腺癌病例和60%因乳腺癌死亡均發(fā)生在經(jīng)濟發(fā)達國家。通常在北歐和西歐和北美的一些 國家，以及澳大利亞的發(fā)病率比較高。從20世紀90年代起，原屬于低發(fā)區(qū)的亞洲國家發(fā)病 率呈逐年升高趨勢，在我國，據(jù)上海、北京、等發(fā)達城市的統(tǒng)計，其發(fā)病率正逐年以2% -3% 的速度遞增，在女性惡性腫瘤中已屬首位并成為威脅婦女健康的重要因素。據(jù)2010年中國 腫瘤登記年報，城市居民發(fā)病率（51. 24/10萬）高于農(nóng)村居民（19. 6/10萬）。乳腺癌已成 為嚴重危及女性生命安全的惡性腫瘤。目前乳腺癌的病因尚不明確，遺傳、內(nèi)分泌、免疫功 能與環(huán)境因素等相互作用，可能共同參與了癌變的演進過程。
[0003] 在最初的研宄中，長片段非編碼RNA-直被認為基因組轉(zhuǎn)錄過程中的"噪聲"或者 是"暗物質(zhì)"，主要原因是其長度、數(shù)量、種類、產(chǎn)生和作用方式、功能狀況都不明確，并還缺 乏對此類RNA的研宄方法。之前的研宄認為IncRNA是轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)物，不編碼蛋白質(zhì)， 并不具備生物學上的功能，而近年來的研宄逐漸表明，IncRNA參與轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄的干擾以 及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控；同時在基因組印記、X染色體沉默、染色質(zhì)的修飾、以及原癌基因的活化 等過程中起到重要作用。
[0004] 目前的研宄將IncRNA大致分為五類：1)正義IncRNA (Sense IncRNA):當與同一鏈 上另一轉(zhuǎn)錄物的一個或者多個外顯子相重疊，即為正義IncRNA，也叫做同義IncRNA ;2)反 義IncRNA(atisense IncRNA):其轉(zhuǎn)錄結(jié)果與反義鏈上的轉(zhuǎn)錄物的外顯子相重疊時即為反 義IncRNA ;3)雙向IncRNA (bidirectional IncRNA):此類IncRNA的表達起始位點與其互 補鏈上相鄰編碼轉(zhuǎn)錄物的表達起始點十分靠近；4)內(nèi)含子lncRNA(Intronic IncRNA):其 序列來源于基因內(nèi)部的內(nèi)含子區(qū)域；5)基因間lincRNA(Long intergenic RNA，lincRNA): 位于兩個基因間的間隔區(qū)域。
[0005]長片段基因間非編碼 RNA (Long intergenic noncoding RNA，lincRNA)是一類數(shù) 量較多且功能研宄較為清楚的IncRNA。目前研宄已證明基因間存在大量的lincRNA，但其 結(jié)構(gòu)與功能方面研宄得較成熟的僅僅有十幾種。這些lincRNA具有不同的分子生物學功 能，如作為調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的作用因子、參與癌細胞的迀移。
[0006] 與此同時，乳腺癌是嚴重危害女性健康的主要惡性腫瘤，發(fā)病率有逐年增高且呈 趨于年輕化的趨勢。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，腫瘤的基因治療層面上的研宄已成為近 年來的熱點。在IncRNA的研宄領(lǐng)域中，microRNA研宄已逐漸明了，而與microRNA相比， IncRNA的研宄尚處于起步階段，而在乳腺癌的診斷和治療中，非編碼RNA表達與乳腺癌的 相關(guān)性研宄，報道很少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的LincRNA是一種位于兩個基因間區(qū)的非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄本長度超過200堿 基的RNA，其長度介于200bp~100kb之間，此類ncRNA不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，其結(jié)構(gòu)具 有多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠與DNA、RNA或者轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合共同調(diào)芐基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程， 從而起到調(diào)節(jié)機體功能的作用。發(fā)明人在這種基礎(chǔ)上，從乳腺癌組織及對應(yīng)的癌旁組織中 分離出檢測乳腺癌準確度高的lincRNA生物標記物，并在此基礎(chǔ)上，通過設(shè)計試劑盒來檢 測上述標記物，以及在設(shè)計試劑盒過程中設(shè)計的探針或探針組合、生物芯片。因此，本發(fā)明 具有如下四個發(fā)明目的，以及圍繞這四個發(fā)明目的多個技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明的第一個發(fā)明目的在于提供一組用于輔助檢測乳腺癌，并且檢測準確度高 的lincRNA生物標記物以及其在乳腺癌輔助檢測中的應(yīng)用；
[0009] 為了實現(xiàn)上述第一個發(fā)明目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0010] 一組作為乳腺癌輔助檢測的lincRNA生物標記物，所述lincRNA生物標記物包含 以下序列中的任意一種或者一種以上：
[0011] LincRNA-BC2:SEQIDNO. 1；
[0012] LincRNA-BC4:SEQIDNO. 2 ；
[0013]LincRNA-BC5:SEQIDNO. 3 ；
[0014]LincRNA-BC8:SEQIDNO. 4〇
[0015] 作為優(yōu)選，所述lincRNA生物標記物是采用高通量測序技術(shù)取自乳腺癌組織及對 應(yīng)的癌旁組織的lincRNA生物標記物。
[0016] 在提供lincRNA生物標記物的基礎(chǔ)上，本發(fā)明第二個發(fā)明目的在于提供一種采用 檢測上述lincRNA生物標記物表達情況以用于檢測乳腺腫瘤或輔助檢測乳腺腫瘤的試劑 盒；
[0017] 為了實現(xiàn)上述第二個發(fā)明目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0018] 一種用于檢測乳腺腫瘤或輔助檢測乳腺腫瘤的試劑盒，所述試劑盒用于檢測上述 lincRNA生物標記物的表達情況；所述試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄體系及擴增引物系統(tǒng)：
[0019] i所述反轉(zhuǎn)錄體系包括：反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑；
[0020] ii所述擴增引物系統(tǒng)包括 LincRNA-BC2,LincRNA-BC4,LincRNA-BC5和 LincRNA-BC8中的至少一種的擴增引物以及作為內(nèi)參基因的0-actin的擴增引物；其中前 述擴增引物相對應(yīng)地包括如下：
[0021] 上游擴增引物：
[0022] LincRNA-BC2(SEQIDN0. 5) :5'-CTGTTGAGGCCAGAATCCAG-3'
[0023]LincRNA-BC4(SEQIDNO. 6) :5'-GGGTCATCTGCATTCAGAGATT-3'
[0024] LincRNA-BC5(SEQ ID NO. 7) :5,-CGTGCCACGTTCCCACC-3'
[0025] LincRNA-BC8(SEQ ID NO. 8) :5'-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3'
[0026] 下游擴增引物：
[0027] LincRNA-BC2(SEQ ID NO. 9) :5'-GGGTTTGGGCTTCTTGGT-3'
[0028] LincRNA-BC4(SEQ ID NO. 10) :5'-TGGCTGGAATCATTCACATATC-3'
[0029] LincRNA-BC5(SEQ ID NO. 11) :5'-GGTGGTAGAAGTGGAGGGC-3'
[0030]LincRNA-BC8(SEQ ID NO. 12) :5,-GAACCGCCAGGTCCTTTGAG-3,〇
[0031] 作為優(yōu)選，所述的試劑盒為熒光定量染料法試劑盒，該試劑盒還包括DNA染料法 實時定量PCR檢測引物，用于實時定量PCR檢測的上、下游引物分別是：
[0032] DNA染料法熒光定量上游引物序列：
[0033] LincRNA-BC2(SEQ ID N0. 13) :5,-CCAAAACCTGTCCCTACC-3'
[0034] LincRNA-BC4(SEQ ID NO. 14) :5,-ACTTAGACTTGTGCTTCTGCTGTTG-3'
[0035] LincRNA-BC5(SEQ ID NO. 15) :5'-CGCCGCCTCTCAGCCTATC-3'
[0036] LincRNA-BC8(SEQ ID NO. 16) :5,-AACATAACTGCTTGCCAGAACACTAC-3，
[0037] DNA染料法熒光定量下游引物序列：
[0038] LincRNA-BC2(SEQ ID NO. 17) :5,-GCACCTTCATCTCTACCCCCA-3'
[0039] LincRNA-BC4(SEQ ID NO. 18) :5,-AATCATTCACCTATCTTGGGTTTGG-3'
[0040] LincRNA-BC5(SEQ ID NO. 19) :5,-GCCACATTCCC