一種乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒及其miRNA的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種miRNA的檢測(cè)產(chǎn)品W及miR-21、miR-191和miR-16作為乳腺癌分 子標(biāo)記物的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，全世界每年約有200萬(wàn)新增乳腺癌患者；我國(guó) 近年乳腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)迅速，高出發(fā)達(dá)國(guó)家1-2個(gè)百分點(diǎn)，且具有年輕化、家族聚集、遺傳 易感等特征。乳腺癌早早期時(shí)臨床無(wú)癥狀，隱匿階段平均為12年，等到有明顯癥狀時(shí)多已 是中晚期。
[0003] 應(yīng)用分子指標(biāo)來(lái)早期發(fā)現(xiàn)腫瘤是目前的研究熱點(diǎn)，其中微小RNA (mi croRNA， miRNA)作為早期診斷的新一代腫瘤標(biāo)志越來(lái)越引起臨床應(yīng)用的關(guān)注。miRNA是一類(lèi)高度保 守，長(zhǎng)度約在19 - 24個(gè)核巧酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，能通過(guò)與祀基因mRNA特 異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起祀基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、 分化及調(diào)亡過(guò)程，一些miRNA作為原癌基因或抑癌基因已被證實(shí)。lorio等的研究（Cancer Res, 2005,65 (16) ,7065-7070)首次指出，miRNA在乳腺癌和正常的乳腺組織中的表達(dá)存在 著明顯的差異。Seon曲0 等的研究（Plos one，2011,6(2)，el6403)利用 Illumina-S〇]_-exa 深度測(cè)序平臺(tái)的基因檢測(cè)技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞株中鑒定的189種明顯異常的miRNA,該些 miRNA均有不同程度的致癌潛能。miRNA對(duì)于早期癌癥的診斷具有重要意義。Mar-Aguilar F的研究（Asia Pac J Clin Oncol. 2013,9(1) :53-9)顯示miRNA的聯(lián)合表達(dá)分析比起單個(gè) miRNA分析在預(yù)測(cè)乳腺癌中的優(yōu)勢(shì)；miR-12化和miR-191的聯(lián)合檢測(cè)敏感度為100%，特異 性為94%;miR-21和miR-191聯(lián)合檢測(cè)敏感度為92%，特異性為100%。"miR-21、miR-155 在乳腺癌血清和腫瘤組織中表達(dá)水平相關(guān)性的研究"（卞國(guó)奉，2012，碩±論文）也指出血 清中miR-21和miR-155聯(lián)合檢測(cè)在乳腺癌早期診斷中的潛在價(jià)值。
[0004] 血清中的miRNA含量遠(yuǎn)低于組織，需要一種非常靈敏且特異的檢測(cè)方法；又由于 miRNA引物序列短，引物設(shè)計(jì)比較困難，沒(méi)有針對(duì)性的軟件可W直接利用，故引物及體系均 需篩選及優(yōu)化過(guò)程。目前對(duì)miRNA的高通量篩查一般采用巧片技術(shù)，成本高、特異性和靈敏 度有限，且不能滿(mǎn)足零散標(biāo)本實(shí)時(shí)檢測(cè)需求；對(duì)少數(shù)miRNA的實(shí)時(shí)檢測(cè)多采用化qman探針 法，部分已形成商業(yè)化試劑盒產(chǎn)品，但成本和售價(jià)高昂。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)快速方便、準(zhǔn)確率高，可W實(shí)現(xiàn)乳腺癌早期診斷的 miRNA檢測(cè)試劑盒，W及提供miR-21、miR-191和miR-16聯(lián)合使用作為乳腺癌分子標(biāo)記物 的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是；miR-21、miR-191、miR-16和 miR-39聯(lián)合使用在制備乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，其中miR-39作為內(nèi)參。
[0007] 基于上述應(yīng)用本發(fā)明提出的具體技術(shù)方案是；一種乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒， 其檢測(cè)體系包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、RCR反應(yīng)體系和內(nèi)參體系，所述RCR反應(yīng)體系中包括分 別針對(duì)miR-21、miR-191和miR-16的正向引物和反向通用引物；所述內(nèi)參體系包括內(nèi)參 miRNA-39和針對(duì)miR-39的正向引物；針對(duì)所述miR-21的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 1所示；針對(duì)所述miR-191的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 2所示；針對(duì)所述 miR-16的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 3所示；針對(duì)所述miR-39的正向引物的核 巧酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述反向通用引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[000引用于配制所述RCR反應(yīng)體系的試劑包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向通 用引物液和純水；用于配制所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的試劑包括多聚腺巧酸聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶 混合液、反轉(zhuǎn)錄緩沖液和無(wú)核酸酶純水。
[0009] 上述RCR反應(yīng)體系的總體積為10 y 1 ;其中，所述SYBR Green混合液的體積是 5 y 1，所述正向引物液的體積是1 y 1，所述反向通用引物液的體積是1 y 1，所述DNA模板 1 y 1，其余是純水；所述正向引物液的使用濃度為2 UM，所述反向通用引物液的使用濃度 為2 y M ;所述DNA模板是所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系反應(yīng)后的產(chǎn)物稀釋五倍獲得的。
[0010] 上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的總體積為12.5U1 ;其中，所述多聚腺巧酸聚合酶的體積 是0. 5 y 1，所述反轉(zhuǎn)錄酶混合液的體積是0. 5 y 1，所述反轉(zhuǎn)錄緩沖液的體積是2. 5 y 1，所 述miRNA樣品的加入量是20ng，其余是無(wú)核酸酶純水；所述多聚腺巧酸聚合酶的使用濃度 為2. 5U/ y 1 ;所述miRNA樣品中含有內(nèi)參miRNA-39。
[0011] 上述內(nèi)參miRNA-39是在抽提miRNA樣品過(guò)程中加入的體積為2 y 1的內(nèi)參 miRNA-39液，所述內(nèi)參miRNA-39的使用濃度為0. 2 y M。
[0012] 本發(fā)明具有積極的效果：
[0013] (l)miR-21、miR-191和miR-16作為組合分子標(biāo)記物，經(jīng)過(guò)大數(shù)據(jù)臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)， 在乳腺癌的輔助診斷指標(biāo)方面具有突出優(yōu)勢(shì)。該=個(gè)分子標(biāo)記物首次應(yīng)用于乳腺癌miRNA 檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)，該乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒運(yùn)用實(shí)時(shí)巧光定量PCR方法，可W實(shí)現(xiàn)早期 乳腺癌的輔助診斷，提高患者的生存率。
[0014] (2)本發(fā)明的乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒選擇了 miR-21、miR-191和miR-16該S個(gè) miRNA標(biāo)記物進(jìn)行組合，開(kāi)發(fā)成檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)快速方便、檢測(cè)靈敏度、特異度高、成本低， 可W滿(mǎn)足絕大多數(shù)腫瘤病人的檢測(cè)需求，應(yīng)用范圍極廣，經(jīng)臨床驗(yàn)證預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率高。
[0015] (3)本發(fā)明的乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒針對(duì)血清中作為定量反應(yīng)的內(nèi)參，不同樣 本中差異很大的因素，特別引入穩(wěn)定的外源RNA序列miR-39(來(lái)源于線蟲(chóng)）作為內(nèi)參對(duì)照 RNA，并優(yōu)化設(shè)計(jì)了針對(duì)miR-39的內(nèi)參正向引物，極大提高了進(jìn)行miRNA檢測(cè)時(shí)相對(duì)定量的 準(zhǔn)確度。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是采用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)樣本的miR-21的烙解曲線圖；
[0017] 圖2是采用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)樣本的miR-191的烙解曲線圖；
[001引圖3是采用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)樣本的miR-16的烙解曲線圖；
[0019] 圖4是采用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)樣本的miR-39的烙解曲線圖；
[0020] 圖5是采用本發(fā)明的試劑盒分別進(jìn)行miR-21、miR-191和miR-16單指標(biāo)及S個(gè)指 標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的R0C曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是W下實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可 W根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特意 表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南》一書(shū)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所 有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或 均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。
[00巧實(shí)施例1
[0023] 一、試劑盒的組成。
[0024] 本實(shí)施例的乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒，包括用于配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的試劑、用 于配制PCR體系的試劑和用于配制內(nèi)參體系的試劑。
[0025] 1、內(nèi)參體系：
[0026] 用于配制內(nèi)參體系的試劑包括內(nèi)參miRNA-39液和針對(duì)miR-39的正向引物液。內(nèi) 參 miRNA-39 液為現(xiàn)蟲(chóng) cel-miR-39 (Accession Number ;AJ487564)溶液，由英濰捷基（上 海）貿(mào)易有限公司合成，封裝在一個(gè)小瓶中，配制的濃度為20yM，共lOyl，使用濃度為 0. 2 yM ;針對(duì)miR-39的正向引物液封裝在一個(gè)小瓶中，體積是100 y 1，使用濃度為2 yM。 如表1所示。
[0027] 表1內(nèi)參體系組分表 [002引
【主權(quán)項(xiàng)】
1. miR-21、miR-191和miR-16聯(lián)合使用作為乳腺癌分子標(biāo)記物的應(yīng)用。 2. miR-21、miR-191、miR-16和miR-39聯(lián)合使用在制備乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒中的 應(yīng)用，其中miR-39作為內(nèi)參。
3. 如權(quán)利要求2所述的乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè)體系包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、 RCR反應(yīng)體系和內(nèi)參體系，其特征在于：所述RCR反應(yīng)體系中包括分別針對(duì)miR-21、miR-191 和miR-16的正向引物和反向通用引物；所述內(nèi)參體系包括內(nèi)參miRNA-39和針對(duì)miR-39 的正向引物；針對(duì)所述miR-21的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；針對(duì)所述 miR-191的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；針對(duì)所述miR-16的正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；針對(duì)所述miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示；所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒，其特征在于：用于配制所述RCR反 應(yīng)體系的試劑包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和純水；用于配制所 述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的試劑包括多聚腺苷酸聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶混合液、反轉(zhuǎn)錄緩沖液和無(wú)核 酸酶純水。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述RCR反應(yīng)體系 的總體積為1〇μ1 ;其中，所述SYBR Green混合液的體積是5μ1，所述正向引物液的體積是 ?μL，所述反向通用引物液的體積是?μL，所述DNA模板?μL，其余是純水；所述正向引物液 的使用濃度為2μΜ，所述反向通用引物液的使用濃度為2μΜ ;所述DNA模板是所述反轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)體系反應(yīng)后的產(chǎn)物稀釋五倍獲得的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體 系的總體積為12. 5μ1 ;其中，所述多聚腺苷酸聚合酶的體積是0. 5μ1，所述反轉(zhuǎn)錄酶混合液 的體積是〇. 5μ1，所述反轉(zhuǎn)錄緩沖液的體積是2. 5μ1，所述miRNA樣品的加入量是20ng，其余 是無(wú)核酸酶純水；所述多聚腺苷酸聚合酶的使用濃度為2. 5υ/μ1 ;所述miRNA樣品中含有內(nèi) 參 miRNA-39。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述內(nèi)參miRNA-39 是在抽提miRNA樣品過(guò)程中加入的體積為2 μL的內(nèi)參miRNA-39液，所述內(nèi)參miRNA-39的 使用濃度為〇. 2μΜ。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及miR-21、miR-191和miR-16聯(lián)合使用作為乳腺癌分子標(biāo)記物的應(yīng)用；涉及miR-21、miR-191、miR-16和miR-39聯(lián)合使用在制備乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用；涉及一種乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒，RCR反應(yīng)體系中包括分別針對(duì)miR-21、miR-191和 miR-16的正向引物和反向通用引物；內(nèi)參體系中包括內(nèi)參miRNA-39和針對(duì)miR-39的正向引物；針對(duì)miR-21的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；針對(duì)miR-191的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；針對(duì)miR-16的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；針對(duì)miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本發(fā)明的乳腺癌miRNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)快速方便、準(zhǔn)確率高，可以輔助乳腺癌早期診斷。
【IPC分類(lèi)】C12N15-11, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104630377
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510090768
【發(fā)明人】趙新泰, 王明
【申請(qǐng)人】上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月28日