一種快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及分子生物學領域中DNA多態(tài)位點的檢測方法，具體說是一種快速檢測 不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法。
【背景技術】
[0002] 線粒體是動物細胞的動力工廠，機體內(nèi)90% W上的能量都是由線粒體內(nèi)膜呼吸鏈 復合體氧化磯酸化合成的ATP提供。線粒體基因組（mitochon化ial genome，mtDNA，線粒 體DM)是動物體內(nèi)唯一長期、穩(wěn)定存在的核外基因組。動物線粒體基因組因其在世代間沒 有基因重組、呈現(xiàn)嚴格母系遺傳、拷貝數(shù)高等特點，被廣泛用于動物起源進化、物種鑒定、疾 病診斷、衰老、抗病力W及動物經(jīng)濟性狀的研究與應用。
[0003] 線粒體基因組多態(tài)分析是開展線粒體功能相關研究與應用的前提。目前，線粒體 基因組多態(tài)分析沒有系統(tǒng)的方法報道，特別是缺少針對不同群體（品種）間的線粒體基因 組多態(tài)分析方法。針對線粒體基因組多態(tài)分析方法，目前使用較為廣泛的是利用線粒體基 因組覆蓋引物的PCR測序技術，即針對來自不同母系的個體，逐一進行線粒體基因組分段 引物的PCR擴增及PCR產(chǎn)物的測序。該方法存在兩個缺陷：一是該方法費時、費力，需要大 量的PCR擴增和PCR產(chǎn)物測序的重復操作；二是更為關鍵的缺陷，該方法沒有考慮核線粒體 假基因可能存在的干擾，因此在檢測DNA多態(tài)的結果上存在假陽性的風險，即可能導致對 線粒體基因組多態(tài)的分析出現(xiàn)錯判。
[0004] 核線粒體假基因（Nuclear mitochon化ial pseudogen，NUMT)是線粒體基因組 (線粒體DNA)序列在物種進化過程中插入到核基因中的DNA片段。自1967年第一次通過 核DNA和mtDNA雜交在小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)NUMT W來，幾乎所有的高等動物核基因組都發(fā)現(xiàn) 了 NUMT的存在。通常情況下，利用常規(guī)PCR和通用引物會將mtDNA和NUMT的祀序列共擴 增出來，導致mtDNA多態(tài)檢測出現(xiàn)假陽性的結果。例如，mtDNA條形碼是為了快速鑒定物種 而設計的一小段標準基因序列作為物種特異標記，比如說選擇物種保守基因C0I作為一個 DNA條形碼，但是在此序列存在NUMT的對應序列，如果引物設計不當，很容易導致mtDNA與 NUMT的共擴增而不能有效鑒定物種來源（Moulton et al. ,2010)。另一個典型的例子是 mtDNA突變與Alzheimer' S疾病之間的關系，同樣也是因為有NUMT的存在而影響了對該 mtDNA突變的判斷（Wallace et al. ,1997)。該兩個例子都說明了 NUMT已經(jīng)成為mtDNA多 態(tài)研究的影響因素。所W，有效排查NUMT是開展mtDNA研究必要的環(huán)節(jié)。
[0005] 因此，開展線粒體功能相關研究與應用需要建立一整套系統(tǒng)的群體（品種）間線 粒體基因組多態(tài)分析的技術方法，同時，群體（品種）內(nèi)線粒體基因組多態(tài)檢測技術也需要 完善（排查NUMT)，現(xiàn)行方法中大量的PCR擴增和PCR產(chǎn)物測序的重復操作也需要從分析策 略上加W改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測不同品種豬線 粒體基因組多態(tài)位點的方法，運用全基因組測序策略，采用DM混池測序技術，通過線粒體 基因組覆蓋引物設計、NUMT排查、基因組混池構建、PCR擴增、DNA測序、序列拼接和SNP分 析，建立了一整套線粒體基因組多態(tài)分析的方法，既排除了 NUMT對線粒體基因多態(tài)分析的 潛在干擾，獲得了真實的線粒體基因組多態(tài)信息，又能高效、便捷地獲得品種內(nèi)、品種間的 多態(tài)倍息。
[0007] 為達到W上目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[000引一種快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，其特征在于，包括如下 步驟：
[0009] 步驟1，線粒體基因組覆蓋引物設計；
[0010] 步驟2, NUMT排查，得到覆蓋全線粒體基因組的特異PCR引物；
[0011] 步驟3，基因組混池構建；
[001引步驟4, PCR擴增、DNA測序、序列拼接和SNP分析。
[0013] 在上述技術方案的基礎上，步驟1中，參照已有線粒體基因組序列，設計線粒體基 因組PCR引物，所述線粒體基因組PCR引物擴增覆蓋線粒體基因組片段，且保證每對引物在 擴增單一 DNA模板（樣品）時只特異擴增mtDM片段，無測序套峰出現(xiàn)。
[0014] 在上述技術方案的基礎上，步驟2中，用步驟1設計的線粒體基因組PCR引物分別 對單一 DNA模板（樣品）進行擴增和PCR產(chǎn)物測序，其中：
[0015] 擴增片段應為單一特異條帶，否則需要優(yōu)化擴增條件或重新設計引物直至出現(xiàn)單 一特異條帶；
[0016] PCR產(chǎn)物的測序結果應為特異峰圖，無套峰出現(xiàn)，否則需要優(yōu)化擴增條件或重新設 計引物直至無測序套峰出現(xiàn)；
[0017] 同時滿足擴增片段為單一特異條帶和PCR產(chǎn)物的測序結果為特異峰圖，即得到所 需的覆蓋全線粒體基因組的特異PCR引物。
[0018] 在上述技術方案的基礎上，步驟3中，采用DNA混池測序技術，將不同母系來源的 豬基因組DNA樣品濃度標定為10化g/ y L，并等量混合，每個混池的最大樣本量為20個。
[0019] 在上述技術方案的基礎上，步驟4中，使用步驟2得到的覆蓋全線粒體基因組的特 異PCR引物進行擴增、測序及序列比對分析，從而獲得品種內(nèi)、品種間多態(tài)位點。
[0020] 在上述技術方案的基礎上，品種內(nèi)多態(tài)通過混池測序出現(xiàn)的套峰直接獲得；品種 間多態(tài)的查找方法為；W單字母定義品種內(nèi)多態(tài)類型，規(guī)則為；R表示A+G，Y表示C+T，M表 示A+C，K表示G+T，S表示C+G，W表示A+T ;通過定義字母替代堿基多態(tài)類型即可獲得品種 特異的線粒體基因組定義DNA序列，通過比對不同品種的定義序列，即可獲得品種間多態(tài) 位點。
[0021] 本發(fā)明所述的快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，簡便、快捷、準 確，具有W下優(yōu)點：
[0022] (1)本發(fā)明建立了一整套獲得不同群體（品種）線粒體基因組多態(tài)檢測的分子生 物學方法，包括品種內(nèi)和品種間線粒體基因組多態(tài)的檢測方法。
[0023] (2)建立了系統(tǒng)的品種內(nèi)線粒體基因組多態(tài)的檢測方法，包括線粒體基因組引物 的NUMT排查步驟，從而避免了 NUMT共擴增而出現(xiàn)假陽性的潛在風險，為獲得真實線粒體基 因組多態(tài)提供了保障，并采用DNA混池測序技術獲得線粒體基因組多態(tài)信息，提高了實驗 檢測效率，降低了實驗費用。
[0024] (3)利用單字母定義品種內(nèi)多態(tài)類型的設計，建立了品種間線粒體基因組多態(tài)的 分析方法。
[0025] 本發(fā)明所述的快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，具有社會效益 及經(jīng)濟效益。
[0026] 1、社會效益：線粒體基因組多態(tài)在動物起源與進化、群體遺傳結構分析、疾病、經(jīng) 濟性狀（產(chǎn)奶量、日增重、肉質、繁殖、抗病力等）等領域的研究與應用緊密相關。本發(fā)明是 真實檢測動物群體線粒體基因組多態(tài)的有效方法，對開展動物線粒體基因效應分析、群體 遺傳結構、起源、進化的研究具有重要的現(xiàn)實意義。
[0027] 2、經(jīng)濟效益：本發(fā)明具有簡便、經(jīng)濟的特點。針對1個具有20個實驗樣本（混池 的最大實驗樣品量），與常規(guī)檢測方法相比，在不考慮相同的支出費用的情況下值NA提取、 線粒體基因組覆蓋引物合成），本方法的檢測費用僅為常規(guī)方法的1/20 (見下表）。如果檢 測樣本量或檢測群體增加，本方法的優(yōu)勢將更加明顯。因此，本方法具有操作簡便、費用低 廉的優(yōu)點。
[002引本發(fā)明與常規(guī)方法的成本核算（相同的支出的費用沒有羅列）
[0029]
【主權項】
1. 一種快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，其特征在于，包括如下步 驟： 步驟1，線粒體基因組覆蓋引物設計； 步驟2, NUMT排查，得到覆蓋全線粒體基因組的特異PCR引物； 步驟3,基因組混池構建； 步驟4, PCR擴增、DNA測序、序列拼接和SNP分析。
2. 如權利要求1所述的快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，其特征在 于：步驟1中，參照已有線粒體基因組序列，設計線粒體基因組PCR引物，所述線粒體基因組 PCR引物擴增覆蓋線粒體基因組片段，且保證每對引物在擴增單一 DNA模板（樣品）時只特 異擴增mtDNA片段，無測序套峰出現(xiàn)。
3. 如權利要求1所述的快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，其特征在 于：步驟2中，用步驟1設計的線粒體基因組PCR引物分別對單一 DNA模板（樣品）進行擴 增和PCR產(chǎn)物測序，其中： 擴增片段應為單一特異條帶，否則需要優(yōu)化擴增條件或重新設計引物直至出現(xiàn)單一特 異條帶； PCR產(chǎn)物的測序結果應為特異峰圖，無套峰出現(xiàn)，否則需要優(yōu)化擴增條件或重新設計引 物直至無測序套峰出現(xiàn)； 同時滿足擴增片段為單一特異條帶和PCR產(chǎn)物的測序結果為特異峰圖，即得到所需的 覆蓋全線粒體基因組的特異PCR引物。
4. 如權利要求1所述的快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，其特征 在于：步驟3中，采用DNA混池測序技術，將不同母系來源的豬基因組DNA樣品濃度標定為 IOOng/ μ L，并等量混合，每個混池的最大樣本量為20個。
5. 如權利要求1所述的快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，其特征在 于：步驟4中，使用步驟2得到的覆蓋全線粒體基因組的特異PCR引物進行擴增、測序及序 列比對分析，從而獲得品種內(nèi)、品種間多態(tài)位點。
6. 如權利要求5所述的快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，其特征在 于：品種內(nèi)多態(tài)通過混池測序出現(xiàn)的套峰直接獲得；品種間多態(tài)的查找方法為：以單字母 定義品種內(nèi)多態(tài)類型，通過定義字母替代堿基多態(tài)類型即可獲得品種特異的線粒體基因組 定義DNA序列，通過比對不同品種的定義序列，即可獲得品種間多態(tài)位點。
7. 如權利要求6所述的快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，其特征在 于：以單字母定義品種內(nèi)多態(tài)類型，規(guī)則為：R表示A+G，Y表示C+T，M表示A+C，K表示G+T， S表示C+G，W表示Α+Τ。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速檢測不同品種豬線粒體基因組多態(tài)位點的方法，包括如下步驟：步驟1，線粒體基因組覆蓋引物設計；步驟2，NUMT排查；步驟3，基因組混池構建；步驟4，PCR擴增、DNA測序、序列拼接和SNP分析。本發(fā)明所述的方法，運用全基因組測序策略，采用DNA混池測序技術，建立了一整套線粒體基因組多態(tài)的分析方法，既排除了NUMT對線粒體基因多態(tài)分析的潛在干擾，獲得真實的線粒體基因組多態(tài)信息，又能高效、便捷地獲得品種內(nèi)、品種間的多態(tài)信息。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104630370
【申請?zhí)枴緾N201510077296
【發(fā)明人】趙興波
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月13日