苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的分子標(biāo)記篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的分子標(biāo)記篩選方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。該方法包括：步驟A：提取苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽總基因組DNA，進(jìn)行濃度及OD值檢測(cè)，并稀釋備用；步驟B：設(shè)計(jì)苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的線粒體、核糖體的分子標(biāo)記的特異性引物；步驟C：使用特異性引物對(duì)苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽每個(gè)單獨(dú)個(gè)體的總基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟D：對(duì)PCR分子反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化；步驟E：采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；步驟F：根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小及目的條帶顯現(xiàn)程度確定其準(zhǔn)確性及擴(kuò)增效果的穩(wěn)定性。
【專利說明】
苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的分子標(biāo)記篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的線粒體和核糖體的分子標(biāo)記篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]線粒體基因序列中由于無間隔區(qū)和內(nèi)含子，不存在重復(fù)序列和不等交換，在遺傳過程中不易發(fā)生基因的重組、倒位、易位等突變，并且嚴(yán)格遵守母系遺傳；同時(shí)，線粒體基因能夠在較短時(shí)間內(nèi)丟失祖先單倍型，完成譜系分化。正是由于線粒體基因組的特殊結(jié)構(gòu)與進(jìn)化特點(diǎn)，使其成為昆蟲種群遺傳學(xué)與系統(tǒng)進(jìn)化研究的重要物質(zhì)。在種群遺傳學(xué)研究中，線粒體COI (cytochrome oxidase I，COI)、CYTB(Cytochrome b)和ND5(NADH dehydrogenasesubunit 5)基因是研究人員篩選和應(yīng)用頻率較高的一組分子標(biāo)記，其中COI基因的使用頻率為最高，特別是在種群遺傳研究中。
[0003]核糖體基因中含有豐富的生物學(xué)信息，采用合適的核糖體分子標(biāo)記研究昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育能夠相對(duì)真實(shí)的反映昆蟲的進(jìn)化歷史。核糖體DNA為中度重復(fù)的DNA序列，以串聯(lián)多拷貝形式存在，主要編碼核糖體RNA。目前研究中應(yīng)用較多的為轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列，28SrRNA基因編碼區(qū)，以及部分編碼蛋白質(zhì)的核基因序列。EF-1a基因作為一種編碼蛋白的核基因，涉及依賴GTP氨酰tRNA和核糖體受位的結(jié)合，由于其既具有氨基酸序列的保守性，又存在進(jìn)化速率比較快的內(nèi)元，因此它不僅應(yīng)用于研究高級(jí)階元系統(tǒng)發(fā)育，而且用于分析低階元的系統(tǒng)發(fā)育問題。相關(guān)學(xué)者曾一度主張將EF-1a作為分子系統(tǒng)學(xué)研究中的標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)記。
[0004]苜蓿盲蝽AdelphocorisIineolatus(Goeze)和三點(diǎn)苜蓿盲蝽Adelphocorisfasciaticollis(Reuter)屬于半翅目(Hemiptera)盲疇科(Miridae)首猜盲疇屬(Adelphocoris)。苜蓿盲蝽廣泛分布于全北區(qū)和東洋區(qū)，在我國(guó)主要分布在黃河流域和西北內(nèi)陸地區(qū)。三點(diǎn)苜蓿盲蝽是我國(guó)的特有種，重點(diǎn)分布在華北、西北地區(qū)。兩種盲蝽均為棉花上的重要害蟲，尤其是近十年來，隨著轉(zhuǎn)基因棉花的大量種植，化學(xué)農(nóng)藥的減少使用，該蟲已經(jīng)從次要害蟲上升為主要害蟲，嚴(yán)重危害棉花的正常生長(zhǎng)，影響產(chǎn)量和質(zhì)量，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。為了更有效及有針對(duì)性的對(duì)其進(jìn)行防治，對(duì)其種群遺傳結(jié)構(gòu)、種群遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究是非常有必要的。線粒體與核糖體分子標(biāo)記是開展這方面研究非常理想的標(biāo)記，但是目前僅有很少關(guān)于苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽線粒體及核糖體分子標(biāo)記可用，這種現(xiàn)狀制約了兩種盲蝽種群遺傳及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究的開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于此，有必要針對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)存在的問題，提供了一種苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的分子標(biāo)記篩選方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
[0006]為達(dá)到發(fā)明目的，提供一種苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的分子標(biāo)記篩選方法，包括:步驟A:提取苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽總基因組DNA，進(jìn)行濃度及OD值檢測(cè)，并稀釋備用；步驟B:設(shè)計(jì)苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的線粒體、核糖體的分子標(biāo)記的特異性引物，其中苜蓿盲蝽與三點(diǎn)苜蓿盲蝽線粒體與核糖體分子標(biāo)記及其對(duì)應(yīng)的9對(duì)特異引物序列和I對(duì)通用引物序列如下所示:
[0007]苜蓿盲蝽線粒體分子標(biāo)記:
[0008]COI標(biāo)記:如SEQ ID NO:1所示；
[0009]COI標(biāo)記的特異性引物序列:
[0010]Lin-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAATC[0011 ]Lin-CO1-R:CTGAATAATTAATATTTGTGCCATGA
[0012]CYTB標(biāo)記:如SEQ ID NO:2所示；
[0013]CYTB標(biāo)記的特異性引物序列:
[0014]Lin-CYTB-F:ATGAATAAACCTATACGAAAAAAACAC
[0015]Lin-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA
[0016]ND5標(biāo)記:如SEQ ID NO:3所示；
[0017]ND5標(biāo)記的特異性引物序列:
[0018]Lin-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAA
[0019]Lin-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATTT
[0020]苜蓿盲蝽核糖體分子標(biāo)記:
[0021]16S rDNA標(biāo)記:如SEQ ID NO:4所示；
[0022]16S rDNA標(biāo)記的特異性引物序列:
[0023]Lin-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT
[0024]Lin-16S-R:TTATTAGTAATTTTGTTGTAGTGAATATATTTTATTEF-1a標(biāo)記:如SEQ ID NO:5所示；
[0025]Lin-EF-1a-F:CCTAAGAACCCTGCTGATCTG
[0026]Lin-EF-1a-R:GACCTTTCCTCTTCCTGGTATC
[0027]三點(diǎn)苜蓿盲蝽線粒體分子標(biāo)記:
[0028]COI標(biāo)記:如SEQ ID NO:6所示；
[0029]COI標(biāo)記的特異性引物序列:
[0030]Fas-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAAT[0031 ]Fas-CO1-R:TTAGAATGATCTAATGATAGGTAATTCA
[0032]CYTB標(biāo)記:如SEQ ID NO:7所示；
[0033]CYTB標(biāo)記的特異性引物序列:
[0034]Fas-CYTB-F:ATGAATAAACCCATACGAAAAAAAC
[0035]Fas-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA
[0036]ND5標(biāo)記:如SEQ ID NO:8所示；
[0037]ND5標(biāo)記的特異性引物序列:
[0038]Fa s-ND 5-F: A AA T T A T T A T T A T A AT G AT A AA A AA A AT AA AAFa s-ND 5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATT
[0039]16S rDNA標(biāo)記:如SEQ ID NO:9所示；
[0040]16S rDNA標(biāo)記的特異性引物序列:
[0041 ]Fas-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT
[0042]Fas-16S-R:GAAAATTATATTAATTATTCTTTTTAAAAAAAATAG
[0043]rDNA-1TS標(biāo)記:如SEQ ID NO: 10所示；
[0044]rDNA-1TS標(biāo)記的通用引物序列:
[0045]28Z:AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC
[0046]Pl:ATCACTCGGCTCGTGGATCG
[0047]步驟C:使用特異性引物對(duì)苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽每個(gè)單獨(dú)個(gè)體的總基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟D:對(duì)PCR分子反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化;步驟E:采用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;步驟F:根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小及目的條帶顯現(xiàn)程度確定其準(zhǔn)確性及擴(kuò)增效果的穩(wěn)定性。
[0048]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟A中采用天根公司生產(chǎn)的TIANamp Genomic DNA試劑盒提取苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽總基因組DNA，具體過程包括:步驟Al:取昆蟲除腹部以外的組織放入1.5ml的離心管中，再加入200ul緩沖液GA，均勻震蕩；步驟A2:加入20_30ul蛋白酶K溶液混勻；步驟A3:放入560C水浴鍋中水浴3-4h，每半小時(shí)震蕩一次，直至組織完全溶解；步驟A4:加入200ul緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C水浴1min，簡(jiǎn)短離心使管壁的水珠沉入管底部；步驟A5:加入200ul無水乙醇，來回混勻震蕩，簡(jiǎn)短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠;步驟A6:將上一步所得溶液及沉淀加入組裝好的吸附柱CB3中，12000rpm離心30s-lmin，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；步驟A7:向吸附柱CB3中加入500ul已加入無水乙醇的緩沖液⑶，12000rpm離心Imin，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；步驟A8:向吸附柱CB3中加入700ul已加入無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；步驟A9:再次向吸附柱CB3中加入600ul已加入無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心Imin，倒掉廢液;步驟AlO:將吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm離心3min，倒掉廢液;將吸附柱CB3開蓋置于超凈工作臺(tái)中，室溫放置20-30分鐘，達(dá)到徹底晾干吸附材料中殘余漂洗液的目的；步驟All:將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200ul洗脫緩沖液TE或者加入無菌水，室溫放置2-5min，12000rpm離心3min，將溶液收集到離心管中，最后將DNA產(chǎn)物保存在-20°C冰箱中備用;步驟A12:將離心得到的DNA溶液再次加入吸附柱CB3中，室溫放置2min，12000rpm離心2min，將溶液再次收集到離心管中；步驟A13:使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段的大小和純度，使用Nanodrop儀器檢測(cè)提取的總DNA的濃度與純度，即D260，D280及D260/D280的比值。
[0049]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟B包括:步驟B1:從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記的序列，或者通過實(shí)驗(yàn)室已測(cè)得的苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選相應(yīng)分子標(biāo)記的序列;步驟B2:采用Primer 5.0軟件，按照引物設(shè)計(jì)需要滿足的條件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，所述條件包括下列項(xiàng)目中的一種或多種:Tm值的范圍、引物序列的最適長(zhǎng)度范圍、擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期長(zhǎng)度范圍、GC含量。
[0050]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟C中采用的PCR擴(kuò)增體系為:總量為25ul，其中模板DNA2ul，1uM 正向引物 Iul，1uM 反向引物 Iul，1mM dNTP mix0.5ul，5x PCR Buffer 5ul，TaqDNA Polymerase 0.5ul，dd H2O 15ul 0
[0051 ] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟D包括:步驟Dl: 94 °C預(yù)變性3min;步驟D2:之后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括:94°C變性Imin，50-59°C退火Imin，72°C延伸lmin-lmin 30s，末次循環(huán)72°C延伸5min，4°C保存。
[0052]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟E中采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物純化，步驟E包括:步驟El:取3μ1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加Ιμ?左右上樣緩沖液，混合均勻，加樣于I XTAE緩沖液配制的2%瓊脂糖凝膠孔中，點(diǎn)樣后，150V恒壓條件下電泳25min;步驟Ε2:將含有目的片段的凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中初步觀察目的片段的大小，對(duì)凝膠進(jìn)行照相并記錄PCR產(chǎn)物電泳圖像;步驟E3:對(duì)PCR產(chǎn)物純化采用2 %瓊脂糖凝膠檢測(cè)，核酸染料染色，在凝膠成像儀器中將PCR產(chǎn)物切膠回收，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。
[0053]本發(fā)明的技術(shù)方案至少具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0054](I)本發(fā)明提供了一種苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽線粒體和核糖體共9對(duì)PCR擴(kuò)增穩(wěn)定特異性強(qiáng)的引物序列和I對(duì)適用于兩種盲蝽的通用引物。
[0055](2)本發(fā)明提供了一種篩選線粒體和核糖體分子標(biāo)記簡(jiǎn)單、快速的方法，利用GenBank中已有的基因序列和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以方便、準(zhǔn)確的篩選到大量用于種群遺傳及系統(tǒng)發(fā)育研究的有效分子標(biāo)記。
【附圖說明】
[0056]圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的一種苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的分子標(biāo)記篩選方法的步驟流程圖；
[0057]圖2(a)_(f)為本發(fā)明實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0058]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法、裝置和系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0059]如圖1所示，為一個(gè)實(shí)施例中的一種苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的分子標(biāo)記篩選方法的步驟流程圖。具體包括以下步驟A至步驟F。
[0060]步驟A:提取苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽總基因組DNA，進(jìn)行濃度及OD值檢測(cè)，并稀釋備用。
[0061]步驟B:設(shè)計(jì)苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的線粒體、核糖體的分子標(biāo)記的特異性引物。
[0062]其中苜蓿盲蝽與三點(diǎn)苜蓿盲蝽線粒體與核糖體分子標(biāo)記及其對(duì)應(yīng)的9對(duì)特異引物序列和I對(duì)通用引物序列如下所示:
[0063]苜蓿盲蝽線粒體分子標(biāo)記:
[0064]COI標(biāo)記:如SEQ ID NO:1所示；
[0065]COI標(biāo)記的特異性引物序列:
[0066]Lin-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAATC
[0067]Lin-CO1-R:CTGAATAATTAATATTTGTGCCATGA
[0068]CYTB標(biāo)記:如SEQ ID NO:2所示；
[0069]CYTB標(biāo)記的特異性引物序列:
[0070]Lin-CYTB-F:ATGAATAAACCTATACGAAAAAAACAC[0071 ] Lin-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA
[0072]ND5標(biāo)記:如SEQ ID NO:3所示；
[0073]ND5標(biāo)記的特異性引物序列:
[0074]Lin-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAA
[0075]Lin-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATTT
[0076]苜蓿盲蝽核糖體分子標(biāo)記:
[0077]16S rDNA標(biāo)記:如SEQ ID NO:4所示；
[0078]16S rDNA標(biāo)記的特異性引物序列:
[0079]Lin-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT
[0080]Lin-16S-R:TTATTAGTAATTTTGTTGTAGTGAATATATTTTATT[0081 ]EF-1a標(biāo)記:如SEQ ID NO:5所示；
[0082]Lin-EF-1a-F:CCTAAGAACCCTGCTGATCTG
[0083]Lin-EF-1a-R:GACCTTTCCTCTTCCTGGTATC
[0084]三點(diǎn)苜蓿盲蝽線粒體分子標(biāo)記:
[0085]COI標(biāo)記:如SEQ ID NO:6所示；
[0086]COI標(biāo)記的特異性引物序列:
[0087]Fas-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAAT
[0088]Fas-CO1-R:TTAGAATGATCTAATGATAGGTAATTCA
[0089]CYTB標(biāo)記:如SEQ ID NO:7所示；
[0090]CYTB標(biāo)記的特異性引物序列:
[0091 ]Fas-CYTB-F:ATGAATAAACCCATACGAAAAAAAC
[0092]Fas-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA
[0093]ND5標(biāo)記:如SEQ ID NO:8所示；
[0094]ND5標(biāo)記的特異性引物序列:
[0095]Fas-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAAA
[0096]Fas-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATT
[0097]16S rDNA標(biāo)記:如SEQ ID NO:9所示；
[0098]16S rDNA標(biāo)記的特異性引物序列:
[0099]Fas-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT
[0100]Fas-16S-R:GAAAATTATATTAATTATTCTTTTTAAAAAAAATAG
[0101]rDNA-1TS標(biāo)記:如SEQ ID NO:10所示；
[0102]rDNA-1TS標(biāo)記的通用引物序列:
[0103]28Z:AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC
[0104]Pl:ATCACTCGGCTCGTGGATCG
[0105]步驟C:使用特異性引物對(duì)苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽每個(gè)單獨(dú)個(gè)體的總基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0106]步驟D:對(duì)PCR分子反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。
[0107]步驟E:采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0108]步驟F:根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小及目的條帶顯現(xiàn)程度確定其準(zhǔn)確性及擴(kuò)增效果的穩(wěn)定性。
[0109]為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解，現(xiàn)列舉具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0110]首先，進(jìn)行苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽分子標(biāo)記篩選的PCR引物組合的設(shè)計(jì)與合成。
[0111]根據(jù)苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽線粒體細(xì)胞色素氧化酶I(COI)、細(xì)胞色素b(Cytb)基因、線粒體NADH脫氫酶亞基5(ND5)基因、16S rDNA基因、編碼蛋白質(zhì)的核基因EF-1a序列，利用Primer Primer5軟件分別設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的特異性引物。引物序列參見上文。本實(shí)施例中的引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0112]其次，利用線粒體和核糖體分子標(biāo)記快速擴(kuò)增苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽寧夏、吉林、陜西、黑龍江、山西以及河北種群。
[0113](I)采集寧夏、吉林、陜西的苜蓿盲蝽個(gè)體和黑龍江、山西以及河北的三點(diǎn)苜蓿盲蝽個(gè)體，提取全基因組DNA。
[0114]分別選取代表種群，即選取寧夏的青銅峽、吉林長(zhǎng)嶺、陜西商洛地區(qū)的苜蓿盲蝽個(gè)體；同時(shí)選取黑龍江肇東、山西太古、河北涿州地區(qū)的三點(diǎn)苜蓿盲蝽個(gè)體。兩種盲蝽的野外采集使用網(wǎng)捕法，采用吸蟲管收集成蟲，然后將成蟲放入無水乙醇中，最后帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，采用體式解剖鏡參照鑒定書籍及相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)一步對(duì)成蟲形態(tài)特征進(jìn)行鑒定確認(rèn)，確保種類鑒定正確無誤。
[0115]提取總基因組DNA時(shí)，將成蟲腹部去除，剩余組織結(jié)構(gòu)作為試驗(yàn)材料，采用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的TIANamp Genomic DNA試劑盒提取因組DNA。參照說明書操作。
[0116](2)線粒體和核糖體分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增
[0117]利用實(shí)施例1合成的引物進(jìn)行四種線粒體和2種核糖體分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)在美國(guó)B1-RAD公司生產(chǎn)的Myclycler，S100PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括25ul，其中模板DNA 2ul，1uM正向引物Iul，1uM反向引物Iul，1mM dNTP mix 0.5ul，5xPCR Buffer 5ul，Taq DNA Polymerase 0.5ul，ddH20 15ulICR反應(yīng)體系包括94°C預(yù)變性3min ；之后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括:94 °C變性Imin，50-59 °C退火Imin(不同分子標(biāo)記退火溫度存在一定差異)，72°C延伸lmin-lmin 30s(視PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度而定)，末次循環(huán)72°C延伸5min，4°C保存。
[0118](3)PCR產(chǎn)物純化
[0119]PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，核H2酸染料染色，在凝膠成像儀器中將PCR產(chǎn)物切膠回收，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行純化，參照說明書操作。
[0120](4)純化PCR產(chǎn)物測(cè)序和序列比對(duì)
[0121]將純化的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，采用雙向測(cè)序方法，測(cè)序反應(yīng)在3730XL DNA Genetic Analyser(ABI)測(cè)序儀上進(jìn)行。獲得測(cè)序結(jié)果后，利用ContigExpress序列分析軟件進(jìn)行雙向測(cè)序結(jié)果的拼接及序列的校對(duì)。在GenBank中通過Blast工具進(jìn)行目的序列的比對(duì)，確定擴(kuò)增序列是否為所擴(kuò)增種類的目的片段。
[0122]圖2為本發(fā)明實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。具體地:
[0123]圖2(a)是本發(fā)明實(shí)施例中苜蓿盲蝽利用引物L(fēng)in-⑶1-F/Lin-⑶1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果;泳道1-3為寧夏青銅峽苜蓿盲蝽樣本，泳道4-6為吉林長(zhǎng)嶺樣本，6-9為陜西商洛樣本，10-12為陰性對(duì)照，M為2000bp DNA Marker。
[0124]圖2(b)是本發(fā)明實(shí)施例中苜蓿盲蝽利用引物L(fēng)in-CYTB-F/Lin-CYTB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果;泳道1-3為寧夏青銅峽苜蓿盲蝽樣本，泳道4-6為吉林長(zhǎng)嶺樣本，6-9為陜西商洛樣本，10-12為陰性對(duì)照，]?為200(^口 DNA Marker。
[0125]圖2(c)是本發(fā)明實(shí)施例中苜蓿盲蝽利用引物L(fēng)in-ND5-F/Lin-ND5-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果;泳道1-3為寧夏青銅峽苜蓿盲蝽樣本，泳道4-6為吉林長(zhǎng)嶺樣本，6-9為陜西商洛樣本，10-12為陰性對(duì)照，M為2000bp DNA Marker。
[0126]圖2(d)是本發(fā)明實(shí)施例中苜蓿盲蝽利用引物L(fēng)in-EF-la-F/Lin-EF-la-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果;泳道1-3為寧夏青銅峽苜蓿盲蝽樣本，泳道4-6為吉林長(zhǎng)嶺樣本，6-9為陜西商洛樣本，10-12為陰性對(duì)照，M為2000bp DNA Marker。
[0127]圖2(e)是本發(fā)明實(shí)施例中三點(diǎn)苜蓿盲蝽利用引物Fas-⑶1-F/Fas-CO1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果;泳道1-3為黑龍江肇東苜蓿盲蝽樣本，泳道4-6為山西太古樣本，6-9為河北涿州樣本，10-12為陰性對(duì)照，M為2000bp DNA Marker。
[0128]圖2(f)是本發(fā)明實(shí)施例中三點(diǎn)苜蓿盲蝽利用引物Fas-CYTB-F/Fas-CYTB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果;泳道1-3為黑龍江肇東苜蓿盲蝽樣本，泳道4-6為山西太古樣本，6-9為河北涿州樣本，10-12為陰性對(duì)照，M為2000bp DNA Marker。
[0129]以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。
[0130]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的分子標(biāo)記篩選方法，其特征在于，包括: 步驟A:提取苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽總基因組DNA，進(jìn)行濃度及OD值檢測(cè)，并稀釋備用； 步驟B:設(shè)計(jì)苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的線粒體、核糖體的分子標(biāo)記的特異性引物，其中苜蓿盲蝽與三點(diǎn)苜蓿盲蝽線粒體與核糖體分子標(biāo)記及其對(duì)應(yīng)的9對(duì)特異引物序列和I對(duì)通用引物序列如下所示: 苜蓿盲蝽線粒體分子標(biāo)記: COI標(biāo)記:如SEQ ID NO:1所示； COI標(biāo)記的特異性引物序列: Lin-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAATC Lin-CO1-R:CTGAATAATTAATATTTGTGCCATGA CYTB標(biāo)記:如SEQ ID NO:2所示； CYTB標(biāo)記的特異性引物序列: Lin-CYTB-F:ATGAATAAACCTATACGAAAAAAACAC Lin-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA ND5標(biāo)記:如SEQ ID NO:3所示； ND5標(biāo)記的特異性引物序列: Lin-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAA Lin-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATTT 苜蓿盲蝽核糖體分子標(biāo)記: 16S rDNA標(biāo)記:如SEQ ID NO:4所示； 16S rDNA標(biāo)記的特異性引物序列: Lin-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT Lin-16S-R:TTATTAGTAATTTTGTTGTAGTGAATATATTTTATT EF-1a標(biāo)記:如SEQ ID NO:5所示； Lin-EF-1a-F:CCTAAGAACCCTGCTGATCTG Lin-EF-1a-R:GACCTTTCCTCTTCCTGGTATC 三點(diǎn)苜蓿盲蝽線粒體分子標(biāo)記: COI標(biāo)記:如SEQ ID NO:6所示； COI標(biāo)記的特異性引物序列: Fas-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAAT Fas-CO1-R:TTAGAATGATCTAATGATAGGTAATTCA CYTB標(biāo)記:如SEQ ID NO:7所示; CYTB標(biāo)記的特異性引物序列: Fas-CYTB-F:ATGAATAAACCCATACGAAAAAAAC Fas-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA ND5標(biāo)記:如SEQ ID NO:8所示； ND5標(biāo)記的特異性引物序列: Fas-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAAA Fas-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATT 16S rDNA標(biāo)記:如SEQ ID NO:9所示； 16S rDNA標(biāo)記的特異性引物序列: Fas-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT Fas-16S-R:GAAAATTATATTAATTATTCTTTTTAAAAAAAATAG rDNA-1TS標(biāo)記:如SEQ ID NO:10所示； rDNA-1TS標(biāo)記的通用引物序列: 28Z:AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC Pl:ATCACTCGGCTCGTGGATCG 步驟C:使用特異性引物對(duì)苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽每個(gè)單獨(dú)個(gè)體的總基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟D:對(duì)PCR分子反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化； 步驟E:采用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 步驟F:根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小及目的條帶顯現(xiàn)程度確定其準(zhǔn)確性及擴(kuò)增效果的穩(wěn)定性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟A中采用天根公司生產(chǎn)的TIANampGenomic DNA試劑盒提取苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽總基因組DNA，具體過程包括: 步驟Al:取昆蟲除腹部以外的組織放入1.5ml的離心管中，再加入200ul緩沖液GA，均勻震蕩； 步驟A2:加入20-30ul蛋白酶K溶液混勻； 步驟A3:放入56 0C水浴鍋中水浴3-4h，每半小時(shí)震蕩一次，直至組織完全溶解； 步驟A4:加入200ul緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C水浴1min，簡(jiǎn)短離心使管壁的水珠沉入管底部； 步驟A5:加入200ul無水乙醇，來回混勻震蕩，簡(jiǎn)短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠； 步驟A6:將上一步所得溶液及沉淀加入組裝好的吸附柱CB3中，12000rpm離心30s-1min，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中； 步驟A7:向吸附柱CB3中加入500ul已加入無水乙醇的緩沖液⑶，12000rpm離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中； 步驟A8:向吸附柱CB3中加入700ul已加入無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心Imin，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中； 步驟A9:再次向吸附柱CB3中加入600ul已加入無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心Imin，倒掉廢液； 步驟AlO:將吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm離心3min，倒掉廢液;將吸附柱CB3開蓋置于超凈工作臺(tái)中，室溫放置20-30分鐘，達(dá)到徹底晾干吸附材料中殘余漂洗液的目的；步驟A11:將吸附柱C B 3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加5 O -200ul洗脫緩沖液TE或者加入無菌水，室溫放置2-5min，12000rpm離心3min，將溶液收集到離心管中，最后將DNA產(chǎn)物保存在-20°C冰箱中備用； 步驟A12:將離心得到的DNA溶液再次加入吸附柱CB3中，室溫放置2min，12000rpm離心2min，將溶液再次收集到離心管中； 步驟A13:使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段的大小和純度，使用Nanodrop儀器檢測(cè)提取的總DNA的濃度與純度，S卩D260，D280及D260/D280的比值。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B包括: 步驟B1:從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記的序列，或者通過實(shí)驗(yàn)室已測(cè)得的苜蓿盲蝽和三點(diǎn)苜蓿盲蝽的相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選相應(yīng)分子標(biāo)記的序列； 步驟B2:采用Primer 5.0軟件，按照引物設(shè)計(jì)需要滿足的條件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，所述條件包括下列項(xiàng)目中的一種或多種:Tm值的范圍、引物序列的最適長(zhǎng)度范圍、擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期長(zhǎng)度范圍、GC含量。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C中采用的PCR擴(kuò)增體系為:總量為25ul，其中模板DNA 2ul，1uM正向引物Iul，1uM反向引物Iul，1mM dNTP mix 0.5ul，5xPCR Buffer 5ul，Taq DNA Polymerase 0.5ul，dd H2O 15ul。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟D包括: 步驟01:94°(:預(yù)變性311^11; 步驟D2:之后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括:94°C變性Imin，50-59 °C退火Imin，72 V延伸lmin-lmin 30s，末次循環(huán)72°C延伸5min，4°C保存。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟E中采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物純化，步驟E包括: 步驟EI:取3μ1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加Ιμ?左右上樣緩沖液，混合均勻，加樣于I X TAE緩沖液配制的2%瓊脂糖凝膠孔中，點(diǎn)樣后，150V恒壓條件下電泳25min; 步驟E2:將含有目的片段的凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中初步觀察目的片段的大小，對(duì)凝膠進(jìn)行照相并記錄PCR產(chǎn)物電泳圖像； 步驟E3:對(duì)PCR產(chǎn)物純化采用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，核酸染料染色，在凝膠成像儀器中將PCR產(chǎn)物切膠回收，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106048063SQ201610662094
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月12日 公開號(hào)201610662094.8, CN 106048063 A, CN 106048063A, CN 201610662094, CN-A-106048063, CN106048063 A, CN106048063A, CN201610662094, CN201610662094.8
【發(fā)明人】王景順, 李曉珍, 侯相全, 張花偉, 邢盛偉, 徐會(huì), 王青秀, 尚玲飛, 栗如峰, 王英霞, 李現(xiàn)社
【申請(qǐng)人】安陽(yáng)工學(xué)院