用于鑒定黃連木雌性性別的ssr分子標(biāo)記及其引物對(duì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于鑒定黃連木雌性性別的SSR分子標(biāo)記及其引物對(duì)。本發(fā)明可在黃連木生長早期利用該SSR分子標(biāo)記及其引物對(duì)進(jìn)行性別鑒定，避免了無謂的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本耗費(fèi)，且對(duì)黃連木性別鑒定的準(zhǔn)確率高，且鑒定快速，簡單易行。
【專利說明】
用于鑒定黃連木雌性性別的SSR分子標(biāo)巧及其引物對(duì)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一種用于鑒定黃連木雌性性 別的SSR分子標(biāo)記及其引物對(duì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃連木(Pistacia chinensis Bunge)是漆樹科黃連木屬，雌雄異株落葉喬木植 物，是一類非常重要的潛在的生物質(zhì)能源樹種。黃連木的種子含油率高達(dá)40%，且是不干性 油，制備出的生物柴油十六燒值高達(dá)51.3,符合要求最高的歐盟標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，黃連木的生長 適應(yīng)范圍廣，不占用耕地，可W有效減緩生物液體燃料發(fā)展對(duì)農(nóng)產(chǎn)品價(jià)格與糧食安全的可 能影響。此外，中國山地資源豐富，發(fā)展種植黃連木生物柴油原料林，符合國家"不與糧爭 地，不與人爭糧"的原則，還可達(dá)到促進(jìn)綠化和增加農(nóng)民收入的目的?；谏鲜霭l(fā)展優(yōu)勢，黃 連木受到國家的重視，被國家林業(yè)局定為十一五期間重點(diǎn)發(fā)展的林業(yè)生物能源樹種之一。
[0003] 目前，在黃連木的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)過程中，由于種子原料供不應(yīng)求，導(dǎo)致原料基地建設(shè) 發(fā)展遲緩。黃連木原料種子的短缺問題已經(jīng)嚴(yán)重制約黃連木的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。同時(shí)，黃連木作 為生物質(zhì)能源植物，需要利用它的種子制備生物柴油，而黃連木為雌雄異株植物雄株僅能 提供花粉，那么就希望雌株的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于雄株的數(shù)量。此外，黃連木在童期難辨雌雄，且 童期長達(dá)5~8年W上。由于黃連木基因組信息未知，缺乏可用的黃連木性別鑒定的分子標(biāo) 記，黃連木的早期性別鑒定工作一直難W開展。
[0004] SSR(simple sequence repeat)分子標(biāo)記具有簡單、重復(fù)性好、共顯性、操作簡便 等優(yōu)勢。因此利用二代測序技術(shù)開發(fā)大量的SSR，結(jié)合BSA法尋找到與黃連木性別緊密連鎖 的SSR分子標(biāo)記，建立適用于高通量、快速、準(zhǔn)確鑒定黃連木早期性別鑒定的分子標(biāo)記輔助 選擇體系，可為黃連木性別決定機(jī)制提供一些分子方面的證據(jù)，促進(jìn)黃連木分子選擇育種 進(jìn)程，也可為黃連木產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的早期性別鑒定技術(shù)。
[0005] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種SSR分子標(biāo)記PCSSR55的引物對(duì)，該引物特異性 好，擴(kuò)增效率高，可用于黃連木的性別鑒定。
[0007] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種鑒定黃連木雌雄性別的方法，該方法可W解決現(xiàn) 有技術(shù)中，鑒定黃連木雌性性別時(shí)間長，效率低的問題。
[000引為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用W下技術(shù)方案：
[0009] SSR分子標(biāo)記PCSSR55的引物對(duì)，所述引物對(duì)的上游引物和下游引物的核巧酸序列 分別如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2所示。
[0010] 在黃連木運(yùn)類雌雄異株植物的發(fā)展史中，很難在幼年期分辨出雌株或雄株。DM分 子標(biāo)記不受發(fā)育時(shí)間及組長特異性的影響，用于雌雄異株植物的早期性別鑒定可W得到常 用方法無法獲得的可靠的鑒定信息。且具有快速、高通量、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
[0011] 本發(fā)明通過對(duì)黃連木雌、雄花芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，批量獲得SSR并設(shè)計(jì)成引物，自 主構(gòu)建了雌株和雄株的基因池，用自主開發(fā)的SSR分子標(biāo)記篩選基因池并進(jìn)行群體驗(yàn)證，最 終得到能用于黃連木早期性別鑒定的SSR分子標(biāo)記PCSSR55,形成本項(xiàng)目發(fā)明的技術(shù)方案。
[0012] 通常說來，每增加一個(gè)核巧酸引物特異性提高4倍，運(yùn)樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物 長度為18個(gè)核巧酸。引物長度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。
[0013] 一般引物長度為18~30堿基，本發(fā)明所述引物長度為22和23個(gè)堿基，相對(duì)較短。由 于賭的原因，較短的引物退火結(jié)合到祀DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率 越大，因而本發(fā)明所述的引物具有很高的擴(kuò)增效率。
[0014] 一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。 本發(fā)明所述引物中G+C含量適中，且堿基分布隨機(jī)，因而具有適中的解鏈溫度，便于擴(kuò)增。
[0015] 所述引物自身不存在互補(bǔ)序列（連續(xù)互補(bǔ)堿基小于3bp);引物3'端無修飾不易錯(cuò) 配;最終擴(kuò)增產(chǎn)物長度為15化P，容易成功擴(kuò)增出目的片段。
[0016] 綜上，該引物特異性好，擴(kuò)增效率高，可很好的用于黃連木雌性性別的分子鑒定。
[0017] 一種553分子標(biāo)記?〔551?55，所述分子標(biāo)記的核巧酸序列如569 10^:3所示。
[0018] 基因組中存在許多簡單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeats,SSR)單元，其數(shù)目 存在高度變異。由于特定的SSR的側(cè)翼序列通常都是保守性較強(qiáng)的單一序列，因而可W根據(jù) 偵螺序列合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而將單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出來。由于單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)重 復(fù)單元在數(shù)量上的變異，個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物就產(chǎn)生長度的多態(tài)性，W此來檢測等位基因的多 態(tài)性。
[0019] 如上所述的引物對(duì)和如上所述的SSR分子標(biāo)記在黃連木性別鑒定中的應(yīng)用。
[0020] 如上所述的引物對(duì)和如上所述的SSR分子標(biāo)記在黃連木性別相關(guān)的輔助育種中的 應(yīng)用。
[0021] -種鑒定黃連木性別的方法，包括如下步驟：
[0022] 利用如上所述的引物對(duì)擴(kuò)增待測黃連木基因組DNA;
[0023] 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，若產(chǎn)物中包含與如上所述的分子標(biāo)記的分子量相符的 條帶，則所述待測黃連木為雌株，反之為雄株。
[0024] 優(yōu)選的，如上所述的鑒定黃連木性別的方法，在其擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，上游引物和 下游引物的濃度為0.1~0.3iiM，DNA模板的濃度> 4ng Ai 1。
[0025] 本發(fā)明設(shè)及同一體系或配比中各組分的量，應(yīng)視為對(duì)相關(guān)各組分之間比例關(guān)系的 限定，而不是對(duì)各自用量絕對(duì)值的限定，各組分之間的比例關(guān)系可適當(dāng)改變。
[0026] 擴(kuò)增時(shí)還需要用到化q DNA聚合酶、Mgh'dNTPs、緩沖液。Taq DNA聚合酶具有良好 的熱穩(wěn)定性，可在PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的催化活性;Mgh是化q DNA聚合酶的 輔酶，其濃度直接影響著酶的活性與特異性;dNTPs是DNA擴(kuò)增的原料;緩沖液可為化q DNA 聚合酶的擴(kuò)增提供合適的催化條件。
[0027] 優(yōu)選的，如上所述的鑒定黃連木性別的方法，所述擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0028
[0029] 通常PCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度為40°C~60°C。退火溫度是由引物的Tm值來決定的，在 Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR 反應(yīng)的特異性。本發(fā)明所采用的引物退火溫度為56°C，具有較高的特異性。
[0030] 隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶會(huì)逐漸失活、dNTPs等原料會(huì)逐漸消耗掉，此外有一些非特異 產(chǎn)物的擴(kuò)增也會(huì)相應(yīng)增加。因此雖然隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，產(chǎn)物會(huì)增多，但循環(huán)次數(shù)依然 不宜過多，因而本發(fā)明限定為38~42個(gè)循環(huán)。
[0031] 優(yōu)選的，如上所述的鑒定黃連木性別的方法，在所述電泳鑒定時(shí)，所用的凝膠為 5 %~7 %的聚丙締酷胺凝膠。
[0032] 如上所述的SSR分子標(biāo)記的獲得方法，包括如下步驟：
[0033] 1)、分別對(duì)雌、雄黃連木單株花芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析測序數(shù)據(jù)中的SSR分布特 征并設(shè)計(jì)SSR引物；
[0034] 2)、構(gòu)建雌、雄黃連木基因池，用所述SSR引物篩選基因池；
[0035] 3)、用構(gòu)建基因池的群體進(jìn)行性別驗(yàn)證。
[0036] 優(yōu)選的，所述的SSR分子標(biāo)記的獲得方法，在步驟2)中，構(gòu)建雌、雄黃連木基因池時(shí) 所用的樣本量為：
[0037] 雌株18~25株，雄株18~25株。
[0038] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0039] 1)、傳統(tǒng)的鑒定方法(在黃連木第一次開花時(shí)進(jìn)行雌性簡單)所耗費(fèi)的時(shí)間W年計(jì) 算，無法滿足實(shí)際生產(chǎn)中黃連木大面積種植W滿足對(duì)能源的日益需求。黃連木童期長達(dá)5~ 8年W上，W往在開花前沒有一種確切的方法能對(duì)黃連木雌雄株進(jìn)行性別鑒定，顯然從外部 形態(tài)對(duì)黃連木雌雄株進(jìn)行早期性別鑒定不切實(shí)際。本發(fā)明可在黃連木生長早期即進(jìn)行性別 鑒定，避免了無謂的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本耗費(fèi)，且對(duì)黃連木性別鑒定的準(zhǔn)確率可達(dá)95% W 上，且快速，簡單易行。
[0040] 2)、本發(fā)明所用引物特異性好，擴(kuò)增效率高，且所需模板量較少即可完成PCR反應(yīng)， 可很好的用于黃連木性別的分子鑒定。
[0041] 3)、很多分子鑒定實(shí)驗(yàn)都需要兩對(duì)或多對(duì)引物來擴(kuò)增出多條擴(kuò)增產(chǎn)物，有的方法 還需要酶切反應(yīng)來進(jìn)行輔助鑒定，運(yùn)些操作無疑增加了鑒定的時(shí)間成本和金錢成本;并且 多對(duì)引物還容易造成引物之間的交叉污染，不同引物還可能會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合；同時(shí)不 同引物間的Tm值也可能存在差異，還會(huì)對(duì)退火溫度的選定造成影響，進(jìn)而影響擴(kuò)增效率。本 發(fā)明采用一對(duì)引物即可鑒定出黃連木性別，避免了 W上問題。
【附圖說明】
[0042] 為了更清楚地說明本發(fā)明【具體實(shí)施方式】或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體 實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的 附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前 提下，還可W根據(jù)運(yùn)些附圖獲得其他的附圖。
[0043] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中分子標(biāo)記PCSSR55在基因池及群體篩選中擴(kuò)增的聚丙締酷 氨凝膠電泳圖；
[0044] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中分子標(biāo)記PCSSR55在黃連木天然群體雌株和雄株中擴(kuò)增的 聚丙締酷氨凝膠電泳圖。
[0045] 英譯漢
[0046] l、SSR(Simple Sequence Repeats)標(biāo)記：是近年來發(fā)展起來的一種W特異引物 PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)，是一類由幾個(gè)核巧 酸(一般為1~6個(gè))為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核巧酸的串聯(lián)重復(fù)序列。
[0047] 2、PCR:Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng)，是80年代中期發(fā)展起來的體 外核酸擴(kuò)增技術(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可W通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0049] 實(shí)施例1
[(K)加]分子標(biāo)記PCSSR55的獲得。
[0051 ] 1 )、分別對(duì)雌、雄黃連木單株花芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序；
[0052] 材料:2016年3月份在云南省昆明市西南林業(yè)大學(xué)校園選取雌、雄株各1株，分別采 集雌、雄花芽，保存于液氮中。樣品寄送杭州和壹基金科技有限公司，委托其完成轉(zhuǎn)錄組測 序工作。
[0053] 2)、對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，挖掘SSR，分析SSR分布特征并設(shè)計(jì)SSR引物；
[0054] 轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星的捜索使用本地捜索軟件Perl腳本MicroSAtelitte(MISAKSSR位 點(diǎn)捜索motif為2至6個(gè)核巧酸重復(fù)，捜索標(biāo)準(zhǔn):2-、3-、4-、5-、6-.和7-.核巧酸重復(fù)次數(shù)至少 分別大于5、4、3、2、2和2次。通過MISA捜索獲得的SSR位點(diǎn)，對(duì)其兩側(cè)分別設(shè)計(jì)正向和反向引 物，引物設(shè)計(jì)使用Primer SsPrimer 3設(shè)計(jì)引物使用如下標(biāo)準(zhǔn):正、反方向引物長度為18bp- 28bp，W23bp為最合適；引物的Tm溫度為55°C-65°C，W60°C為最合適;預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為 80bp-160bp。
[0化5] 3)、構(gòu)建雌、雄基因池(雌株20株，雄株20株），用SSR引物篩選基因池；
[0056] 利用合成的SSR對(duì)構(gòu)建雌、雄基因池(雌株20株，雄株20株)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，篩選 在雌、雄基因池間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR引物。
[0057] 4)、用構(gòu)建基因池的群體進(jìn)行性別驗(yàn)證。
[005引用在雌、雄基因池間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR標(biāo)記對(duì)20株雌株和20株雄株DNA模板進(jìn)行擴(kuò) 增，篩選獲得的本分子標(biāo)記PCSSR55能在雌株中擴(kuò)增得到兩條譜帶，而雄株中僅第19株擴(kuò)增 得到兩條譜帶，其它雄株均為一條譜帶。
[0059] 擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。
[0060] 實(shí)施例2
[0061 ] 分子標(biāo)記PCSSR55R的應(yīng)用。
[0062] 采集中國河南省安陽市陳家溝黃連木天然群體中100份雌株和102份雄株的嫩葉 片，提取植株基因組DNA;采用分子標(biāo)記引物PCSSR55F和PCSSR55R對(duì)202份黃連木DNA樣本進(jìn) 行擴(kuò)增。
[0063] LU1 Oul巧脈化系計(jì)，所沐擴(kuò)譜的巧脈化系甸巧！
[0064]
[00 化]
[0066]
[0067]
[0068] 圖2顯示了本分子標(biāo)記PCSSR55在黃連木天然群體雌株和雄株中擴(kuò)增的聚丙締凝 膠電泳圖：
[0069] 本發(fā)明對(duì)100份雌株和102份雄株的樣本進(jìn)行擴(kuò)增，在100份雌株均擴(kuò)增到兩條譜 帶，特異譜帶片段大小為15化P;
[0070] 在所有的102份雄株中，僅有4株擴(kuò)增得到兩條譜帶，其余98株雄株均得到一條擴(kuò) 增譜帶。
[0071] 當(dāng)前，化石能源急劇消耗，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和能源短缺，因而開發(fā)一種清 潔、可再說的新能源來替代石油染料收到了各國的普遍重視。近年來，我國加快了發(fā)展生物 柴油產(chǎn)業(yè)的步伐，各地方將目光集中在幾種目前生產(chǎn)技術(shù)都較為完善的燃料油樹種上，其 中黃連木雌株W其種子含油量高達(dá)35~50%成為近年來生物柴油原料的焦點(diǎn)，隨著黃連木 資源不斷的被開發(fā)利用，其應(yīng)用范圍不斷的擴(kuò)大，市場需求量劇增，合理的種植并在較短的 時(shí)間內(nèi)獲得大量含油的種子，是當(dāng)前首要解決的問題。
[0072] 本發(fā)明可在黃連木生長早期即進(jìn)行性別鑒定，避免了無謂的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本 耗費(fèi)，且根據(jù)實(shí)施例2中的記載，本發(fā)明提供的方法對(duì)黃連木性別鑒定的準(zhǔn)確率可達(dá)95% W 上，且快速，簡單易行。
[0073] 最后應(yīng)說明的是：W上各實(shí)施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制;盡 管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其 依然可W對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征 進(jìn)行等同替換；而運(yùn)些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技 術(shù)方案的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. SSR分子標(biāo)記PCSSR55的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)的上游引物和下游引物的 核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示。2. -種SSR分子標(biāo)記PCSSR55，其特征在于，所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3 所示。3. 權(quán)利要求1所述的引物對(duì)和權(quán)利要求2所述的SSR分子標(biāo)記在黃連木性別鑒定中的應(yīng) 用。4. 權(quán)利要求1所述的引物對(duì)和權(quán)利要求2所述的SSR分子標(biāo)記在黃連木性別相關(guān)的輔助 育種中的應(yīng)用。5. -種鑒定黃連木性別的方法，其特征在于，包括如下步驟： 利用權(quán)利要求1中的引物對(duì)擴(kuò)增待測黃連木基因組DNA; 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，若產(chǎn)物中包含與權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記的分子量相符 的條帶，則所述待測黃連木為雌株，反之為雄株。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒定黃連木性別的方法，其特征在于，在其擴(kuò)增的反應(yīng)體系 中，上游引物和下游引物的濃度為0.1~0.3yM，DNA模板的濃度彡4ng/y 1。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒定黃連木性別的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增的反應(yīng)程序 為： ① 94。。 2~4mm； (2)94 °C 25 ~3 5s; ③ 56°C 25~3:5s; ④ 72 V 0.8~1.2min； ⑤ 將②③④重復(fù)38~42個(gè)循環(huán)； ⑥ 72。〇 4 ~6min。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒定黃連木性別的方法，其特征在于，在所述電泳鑒定時(shí)，所 用的凝膠為5 %~7 %的聚丙烯酰胺凝膠。9. 權(quán)利要求2所述的SSR分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于，包括如下步驟： 1)、分別對(duì)雌、雄黃連木單株花芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析測序數(shù)據(jù)中的SSR分布特征并 設(shè)計(jì)SSR引物； 2 )、構(gòu)建雌、雄黃連木基因池，用所述SSR引物篩選基因池； 3)、用構(gòu)建基因池的群體進(jìn)行性別驗(yàn)證。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的SSR分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于，在步驟2)中，構(gòu)建雌、 雄黃連木基因池時(shí)所用的樣本量為： 雌株18~25株，雄株18~25株。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106048064SQ201610662552
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月12日 公開號(hào)201610662552.8, CN 106048064 A, CN 106048064A, CN 201610662552, CN-A-106048064, CN106048064 A, CN106048064A, CN201610662552, CN201610662552.8
【發(fā)明人】程小毛, 黃曉霞
【申請(qǐng)人】西南林業(yè)大學(xué)