中華鱘環(huán)境dna檢測pcr擴(kuò)增引物及其檢測方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及中華鱘環(huán)境DNA檢測PCR擴(kuò)增引物及其檢測方法和應(yīng)用。所述PCR擴(kuò)增引物ASCB1F序列為：5’?ACAATGCCACCCTTAC?3’，ASCB1R序列為：5’?TGTCTGCGTCTGAGTTT?3’。中華鱘物種的DNA分子標(biāo)記位點(diǎn)位于中華鱘線粒體CYTB基因，DNA片段長度為138bp，DNA序列如SEQ ID NO.1所示，利用所述PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行環(huán)境DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與所述DNA分子標(biāo)記位點(diǎn)位序列進(jìn)行比對，非引物區(qū)100％匹配即為中華鱘物種。本發(fā)明利用環(huán)境DNA檢測實(shí)現(xiàn)了對中華鱘物種的鑒定，無需采集魚體樣本，可避免對魚體的損傷。
【專利說明】
中華轉(zhuǎn)環(huán)境DNA檢測PCR擴(kuò)増引物及其檢測方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及了中華鑄環(huán)境DNA檢巧UPCR擴(kuò)增引物及其檢測 方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中華鑄（Ac ipenser S inens i S )，隸屬鑄形目（Acipenser if ormes )，鑄科 (Acipenseridae)，鑄屬(Acipenser)，是一種典型的溯河徊游性魚類，歷史上主要分布于我 國的長江干流和長江口的淺海區(qū)域，長江上游江段產(chǎn)卵解化的中華鑄幼鑄降河徊游到長江 口，育肥后進(jìn)入海洋生長，每年9~11月繁殖期，成熟的中華鑄個體溯河而上，到長江上游金 沙江下游江段產(chǎn)卵。自1981年葛洲巧水利樞截流成后，長江中華鑄被阻隔在巧下，并在巧下 形成了新的產(chǎn)卵場，自然繁殖規(guī)模遠(yuǎn)小于葛洲巧水利樞紐修建之前，其資源量逐年下降。 2003年=峽大巧蓄水后改變了河道水文學(xué)特征，對中華鑄繁殖行為造成了進(jìn)一步影響。 1988年，中華鑄被列入我國首次公布的重點(diǎn)保護(hù)野生動物名錄，并被定為國家一級保護(hù)動 物，2010年，中華鑄被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)列為國際極危物種。我國從1983年起全面禁 止對中華鑄的商業(yè)捕拱，并嚴(yán)格限制科研用魚，1984年開始實(shí)施中華鑄人工增殖放流，2009 年起停止了對中華鑄親魚的科研捕拱，盡管采取了大量保護(hù)措施，仍難W挽回中華鑄天然 群體持續(xù)衰退的趨勢。2013年至2015年，連續(xù)=年未在長江干流監(jiān)測到中華鑄自然繁殖行 為，如果不及時加強(qiáng)保護(hù)，野生中華鑄將很可能面臨滅絕危機(jī)。中華鑄群體監(jiān)測及物種鑒定 對中華鑄物種保護(hù)具有重要意義，但由于目前中華鑄天然群體數(shù)量稀少，傳統(tǒng)調(diào)查方法面 臨困難，聲學(xué)探測在對目標(biāo)物種的識別率低，誤差較大，傳統(tǒng)捕拱對中華鑄個體產(chǎn)生較大損 傷，目前已全面禁止；同時人工增殖放流是目前中華鑄物種保護(hù)的重要措施，人工繁殖中中 華鑄物種DNA鑒定是確保種質(zhì)的重要方法，而剪取罐條獲得DNA會對中華鑄個體造成損傷且 對于較大個體操作困難。
[0003] 環(huán)境DNA檢測技術(shù)為存在采樣困難的物種監(jiān)測提供了新的方法。生物體通過皮膚、 粘液、尿液、糞便、血液、精卵和腐爛的尸體等多種途徑將自身的DNA釋放到其生存的環(huán)境 中，稱為環(huán)境DNA。任何環(huán)境樣本中都包含大量的環(huán)境DNA，樣品處理和測序技術(shù)的發(fā)展使得 環(huán)境DNA檢測成為可能，環(huán)境DNA所包含的大量信息正逐漸為科學(xué)家們所掲示。環(huán)境DNA檢測 不分離目標(biāo)個體，直接從環(huán)境樣本(如上壤、水或空氣）中提取的DNA，通過特異性DNA分子標(biāo) 記檢測樣本中的特定種屬。大型生物環(huán)境DNA檢測所用的分子標(biāo)記主要為線粒體DNA標(biāo)記， 現(xiàn)有線粒體DNA序列數(shù)據(jù)庫已涵蓋眾多物種，且線粒體DNA序列在物種鑒定中應(yīng)用廣泛，有 利于尋找物種特異性區(qū)段和進(jìn)行序列比對。由于環(huán)境DNA檢測方法改善了傳統(tǒng)調(diào)查方法對 標(biāo)祀生物捕獲率低W及人力和時間消耗較大的缺陷，同時具有更高的敏感度和對生物體無 傷害等特點(diǎn)，近年來在國際上得到了廣泛關(guān)注和快速發(fā)展。利用環(huán)境DNA進(jìn)行中華鑄物種檢 測可免除對中華鑄個體的損傷，在野外調(diào)查中可降低調(diào)查研究對個體及其生境的影響。
[0004] 環(huán)境DNA與生物組織DNA的存在方式不同，在不同條件下環(huán)境DNA會發(fā)生不同程度 的降解，因此用于環(huán)境DNA檢測的引物須具有擴(kuò)增片段短、靈敏度高、擴(kuò)增產(chǎn)物清晰穩(wěn)定的 特點(diǎn)，同時進(jìn)行物種鑒定還須在較短DM片段區(qū)域具有可與其他物種區(qū)分的穩(wěn)定突變位點(diǎn)， 才可W作為環(huán)境DNA物種檢測引物。對于中華鑄物種鑒定，由于達(dá)氏鑄與中華鑄線粒體DNA 具有99% W上的相似性，要在2(K)bp長度W內(nèi)的DNA片段鑒別中華鑄物種，需要尋找特定的 分子標(biāo)記位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，目的在于提供一種適用于中華鑄環(huán)境DNA檢 測鑒定中華鑄物種的PCR擴(kuò)增引物及檢測方法和應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種適用于中華鑄環(huán)境DNA檢測鑒定中華鑄物種的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，上 游引物45〔81尸序列為：5'-4〔4416(^4(：(：(：門4(：-3'，下游引物45〔811?序列為：5'- TGTCTGCGTCTGAGTTT-3'。
[000引上述PCR擴(kuò)增引物在進(jìn)行中華鑄環(huán)境DNA檢測鑒定中華鑄物種中的應(yīng)用，用于鑒定 中華鑄物種的DNA分子標(biāo)記位點(diǎn)位于中華鑄線粒體CYTB基因，DNA片段長度為138bp，DNA序 列如SEQ ID NO. 1所示，將環(huán)境DNA檢測結(jié)果與所述DNA分子標(biāo)記位點(diǎn)序列進(jìn)行比對，非引物 區(qū)100%匹配即為中華鑄物種。
[0009] 上述PCR擴(kuò)增引物用于中華鑄環(huán)境DNA檢測鑒定中華鑄物種的檢測方法，其特征在 于，包括如下步驟：
[0010] (1)采集表層水樣，用0.45化微孔濾膜真空抽濾，濾膜于-2(TC保存?zhèn)溆茫?br>[0011] (2)采用DNA提取試劑盒提取濾膜上的DNA;
[001。 （ 3)利用PCR上游引物ASCB1巧日下游引物ASCB1R對步驟(2)提取所得DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性條帶進(jìn)行DNA片段測序，得到的DNA片段序 列與用于鑒定中華鑄物種的DNA分子標(biāo)記位點(diǎn)序列進(jìn)行比對，非引物區(qū)100%匹配即為中華 鑄物種。
[001引上述方案中，所述PCR擴(kuò)增的40化反應(yīng)體系包括：上下游引物各0.5iiM，dNTP 0.2mM，2U hq DM聚合酶和祉L模板DM。
[0014] 上述方案中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性lmin，56°C退 火lmin，72°C延伸1.5min，45個循環(huán)；72°C最后延伸7min。
[0015] 本發(fā)明的有益效果：（1)本發(fā)明提供了一個用于鑒定中華鑄物種的特定的DNA分子 標(biāo)記位點(diǎn)，利用該DNA分子標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行中華鑄環(huán)境DNA檢測可W有效地將中華鑄與其他物 種區(qū)別開來；（2)本發(fā)明提供了一對適用于中華鑄環(huán)境DNA檢測的PCR擴(kuò)增引物，該P(yáng)CR擴(kuò)增 引物具有擴(kuò)增片段短、靈敏度高、擴(kuò)增產(chǎn)物清晰穩(wěn)定等特點(diǎn)；（3)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所 述檢測方法僅從水體中采集水樣進(jìn)行環(huán)境DNA檢測就可W實(shí)現(xiàn)對中華鑄物種的鑒定，無需 采集魚體樣本，可避免對魚體的損傷，且通過DNA序列比對進(jìn)行物種鑒定的準(zhǔn)確度非常高。
【附圖說明】
[0016] 圖1為采用引物ASCB1擴(kuò)增中華鑄組織DNA的檢測電泳圖。
[0017] 圖2為采用引物ASCB1擴(kuò)增中華鑄人工循環(huán)水養(yǎng)殖水樣DNA檢測的電泳圖，第1、2泳 道為空白對照，第3~6泳道為養(yǎng)殖水樣DNA檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的 內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
[0019]實(shí)施例1
[0020] 中華鑄環(huán)境DNA檢測鑒定中華鑄物種的檢測方法，包括如下步驟：
[0021] (1)用化全新無菌密封廣口瓶于待測水體表層采集化水樣，用0.45iiL微孔濾膜真 空抽濾，室溫條件下8小時內(nèi)完成水樣抽濾，濾膜于-20°C保存直至DNA提取；
[0022] (2)用Mobio化werwater DNA提取試劑盒提取濾膜DNA;
[0023] (3) W水樣DNA為模板，ASCB1F(序列為：5 ' -ACAATGCCACCCTTAC-3'）和ASCB1R(序列 為:5 ' -TGTCTGCGTCTGAGTTT-3 '）為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，4化LPCR反應(yīng)體系包括:上下游 引物各〇.5iiM，dNTP 0.2mM，2U Taq DNA聚合酶和祉L模板DNA;PCR反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變 性 5min;94°C 變性 lmin，56°C 退火 lmin，72°C 延伸 1.5min，45 個循環(huán)；72°C 最后延伸 7min;
[0024] (4)擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小138bp的為陽性條帶，將含有 陽性條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物回收和DNA片段測序，測序得到的DNA片段序列與中華鑄DNA分 子標(biāo)記位點(diǎn)（DNA序列如SEQ ID NO. 1所示)進(jìn)行比對，非引物區(qū)域100 %匹配即為中華鑄物 種。
[0025] 實(shí)施例2
[0026] 中華鑄環(huán)境DNA檢測近源物種區(qū)分：
[0027] (1)利用NCBI在線引物檢索軟件Primer Blast對擴(kuò)增引物ASCB1F和ASCB1R進(jìn)行所 有生物物種的GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫檢索。檢索結(jié)果顯示，除中華鑄外，擴(kuò)增引物僅在達(dá) 氏鑄、達(dá)氏避、施氏鑄、西伯利亞鑄、俄羅斯鑄和歐洲避中具有同源序列，其中DNA序列和中 華鑄最為相近的為達(dá)氏鑄，二者在該分子標(biāo)記核屯、序列有1個不匹配堿基，可辨別中華鑄物 種。
[0028] (2)取達(dá)氏鑄和中華鑄各3尾罐條樣本，利用高鹽法提取組織DNA作為PCR擴(kuò)增模 板，用ASCB1引物對進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收測序。比對6個樣本測序DNA片段序列，達(dá)氏鑄和 中華鑄具有穩(wěn)定不匹配堿基，驗(yàn)證了該引物可將二者明確區(qū)分，鑒定中華鑄物種。
[0029] 實(shí)施例3
[0030] 本發(fā)明所述PCR擴(kuò)增引物有效性檢測：
[0031] (1)采集人工循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中中華鑄養(yǎng)殖水體樣本并提取環(huán)境DNA，平均總DNA濃 度為15ng/iiL，用ASCB1引物對可檢測到中華鑄環(huán)境DNA，將此DNA原液稀釋1000倍，再用 ASCB1引物對進(jìn)行擴(kuò)增，仍可W得到清晰的目的條帶(PCR擴(kuò)增電泳圖如圖1所示，其中第1、2 泳道為空白對照，第3~6泳道為養(yǎng)殖水樣DNA檢測結(jié)果）。
[0032] (2)提取中華鑄組織DNA，稀釋至梯度濃度5 X 1〇-1叫/化、5 X l〇-3ng/iiL和5 X 1〇- Sng/iiL，用ASCB1引物對進(jìn)行擴(kuò)增，均可獲得目的條帶，表明ASCB1在低濃度DNA溶液中仍可 檢測到目的DNA(PCR擴(kuò)增電泳圖如圖1所示）。
[0033] (3)采集露天半人工池塘中華鑄養(yǎng)殖水體樣本并提取環(huán)境DNA，平均總DNA濃度約 為eOngAiL，其中包含大量微生物及其他水生生物DNA，用ASCB1進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得目的條帶， 對目的條帶進(jìn)行測序，核屯、區(qū)域與中華鑄DNA序列100%匹配，表明ASCB1在混合水生態(tài)系統(tǒng) 中可檢測并鑒定中華鑄物種。
[0034]顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的實(shí)例，而并非對實(shí)施方式的限制。對 于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可W做出其它不同形式的變化或 變動。運(yùn)里無需也無法對所有的實(shí)施方式予W窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變 動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種適用于中華舞環(huán)境DNA檢測鑒定中華舞物種的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，上游 引物八5〇81?序列為 ：5'-八0八八丁6(^八(：(：(：1^八(：-3'，下游引物八5〇811?序列為：5'-TGTCTGCGTCTGAGTTT-3'。2. 權(quán)利要求1所述PCR擴(kuò)增引物在進(jìn)行中華舞環(huán)境DNA檢測鑒定中華舞物種中的應(yīng)用， 其特征在于，用于鑒定中華舞物種的DNA分子標(biāo)記位點(diǎn)位于中華舞線粒體CYTB基因，DNA片 段長度為138bp，DNA序列如SEQ ID NO. 1所示，將環(huán)境DNA檢測結(jié)果與所述DNA分子標(biāo)記位點(diǎn) 序列進(jìn)行比對，非引物區(qū)100%匹配即為中華舞物種。3. 權(quán)利要求1所述PCR擴(kuò)增引物用于中華舞環(huán)境DNA檢測鑒定中華舞物種的檢測方法， 其特征在于，包括如下步驟： (1)采集表層水樣，用0.45nL微孔濾膜真空抽濾，濾膜于-20°C保存?zhèn)溆茫? (2 )采用DNA提取試劑盒提取濾膜上的DNA; (3)利用PCR上游引物ASCB1 F和下游引物ASCB1 R對步驟(2)提取所得DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性條帶進(jìn)行DNA片段測序，得到的DNA片段序列 與用于鑒定中華舞物種的DNA分子標(biāo)記位點(diǎn)序列進(jìn)行比對，非引物區(qū)100%匹配即為中華舞 物種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的40HL反應(yīng)體系包括:上 下游引物各0.5 yM，dNTP 0.2 mM，2 U Taq DNA聚合酶和8 yL模板DNA。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù) 變性5 min;94°C變性1 min，56°C退火1 min，72°C延伸1.5min，45個循環(huán)；72°C最后延 伸7 min〇
【文檔編號】C12N15/11GK106048065SQ201610662966
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月12日 公開號201610662966.0, CN 106048065 A, CN 106048065A, CN 201610662966, CN-A-106048065, CN106048065 A, CN106048065A, CN201610662966, CN201610662966.0
【發(fā)明人】徐念, 常劍波
【申請人】水利部中國科學(xué)院水工程生態(tài)研究所