一種擴(kuò)增禽流感病毒全基因組的引物體系及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種擴(kuò)增禽流感病毒全基因組的 引物體系及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒病毒簡(jiǎn)稱流感病毒，是危害最大的人獸共患病病原，至今不僅給養(yǎng)禽、 畜牧業(yè)帶來災(zāi)難性的破壞，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且常引起世界性人流感大流行，嚴(yán)重危 害人類生命健康。流感病毒分為A、B、CΞ型，其中A型流感病毒危害最大，分布最廣，且W 禽為敏感宿主。A型禽流感病毒基因組分為8個(gè)節(jié)段PB2/PB1/PA/HA/NP/NA/M/NS，表達(dá)12 種蛋白，運(yùn)12種蛋白分別在病毒吸附、融合、轉(zhuǎn)錄翻譯及新一代病毒粒子釋放中各司其職。 其中誘導(dǎo)家禽等宿主機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要表面抗原血凝素化emagglutinin，HA)、神經(jīng) 氨酸酶（Neuraminidase,NA)種類分為不同亞型，迄今所發(fā)現(xiàn)有17個(gè)HA亞型化1~化6)， 10個(gè)NA亞型（N1~N10)，HA/NA的多亞型、不斷變異，W及內(nèi)部基因的交叉重組給流感病 毒防治帶來困難。
[0003] 尤其是近年來出現(xiàn)的冊(cè)N1亞型禽流感、W及2009年的化N1大流感、2013年3月 出現(xiàn)的新亞型禽流感H7N9等事件愈演愈烈。目前，H10N8、冊(cè)N6、冊(cè)N8等眾多新亞型不斷出 現(xiàn)。運(yùn)種頻繁變異重組給傳統(tǒng)的HI檢測(cè)、特異HA/NA引物檢測(cè)方法帶來了困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種適用性廣的擴(kuò)增各亞型禽 流感病毒全基因組的引物體系。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種擴(kuò)增禽流感病毒全基因組的引物體系，包括1對(duì)擴(kuò)增禽流感病毒全基因組的 引物對(duì)：
[0007] Uaiv-F：agcraaagcagg；
[0008] Ua"-R:AGTAGAAACAAGG。
[0009] 作為優(yōu)選，還包括擴(kuò)增禽流感病毒8個(gè)節(jié)段的引物對(duì)：
[0010] PB2-F：AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTC ；
[0011] PB2-R：AGTAGAAACAAGGTCGTTT；
[0012] PBl-F：AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTG ；
[0013] FBl-R：AGTAGAAACAAGGCATTT；
[0014] PA-F：AGCRAAAGCAGGTACTGATCC ；
[0015] PA-R：AGTAGAAACAAGGTACTT；
[0016] HA-F：AGCRAAAGCAGGGGT；
[0017] HA-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT； 陽(yáng)0 化]NP-F:AGCRMAGCAGGGTT
[0019] 或AGCRMAGCAGGGTT A ;
[0020]NP-R：AGTAGAAACAAGGGTATTTTT； 陽(yáng)02U NA-F :AGCAAAAGCAGGAGT ;
[0022] NA-R ：AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT；
[0023] M-F ：AGCRAAAGCAGGTAGATATTG；
[0024] M-R：AGTAGAAACAAGTAGTTTTTT； 陽(yáng)0巧]NS-F :AGCAAAAGCAGGGTGAC ;
[0026] NS-R :AGTAGAAACAAGGGTGTTTT。
[0027] 一種擴(kuò)增禽流感病毒全基因組的方法，W上述Uaiv-F和UAIV-R為引物對(duì)病毒RNA 進(jìn)行一步法RT-PCR，得到禽流感病毒全基因組。 陽(yáng)02引作為優(yōu)選，上述方法的RT-PCR反應(yīng)體系如下：10. 0 yL病毒RNA、10. 0 μ L5*buffer、10. 0 μ L lOmM dNTP、1. 0 μ LUa"-F、1. 0 μ LUa"-R、1. 0 μ L酶、DEPC &0 補(bǔ)足50. ΟμΙ ;
[0029] 其中，Uaiv-F與Uaiv-R的濃度均為lOpmol/μL。
[0030] 作為優(yōu)選，上述方法的RT-PCR反應(yīng)條件如下：58°C30min，94°C預(yù)變性3min，然后 加入循環(huán)：94°C30s，48°C30s，72°C7.Omin;進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)后，72°ClOmin。
[0031] 一種擴(kuò)增禽流感病毒全基因組的方法，包括W下步驟： 陽(yáng)03引 1)cDNA的合成：WRT引物AGCRMAGCAGG為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)病毒RNA進(jìn)行PCR，合 成cDNA;
[0033] 2)8個(gè)節(jié)段的擴(kuò)增cDNA為模板，分別使用上述8個(gè)節(jié)段的引物對(duì)進(jìn)行PCR反 應(yīng)，分別得到禽流感病毒全基因組8個(gè)節(jié)段的PCR產(chǎn)物；
[0034] 扣拼接：將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離，檢測(cè)，目的條帶送交測(cè)序或克隆后測(cè)序， 拼接，得到禽流感病毒全基因組。
[0035] 作為優(yōu)選，步驟2)中，PCR反應(yīng)體系如下：12. 5μLTakarapremixExTaq、0. 5μL F引物、0. 5μΙR引物、cDNAO. 5μレ滅菌雙蒸水補(bǔ)足25.ΟμΙ;
[0036] 所述F引物和R引物的濃度均為1化mol/μL。
[0037] 作為優(yōu)選，其PCR反應(yīng)條件如下：95 °C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入循環(huán)：94°C30s， 48-58Γ30s，72°Cl-3min，35 個(gè)循環(huán)后，72°ClOmin。
[0038] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0039] 經(jīng)過對(duì)眾多A型流感病毒基因組進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)所有A型流感病毒基因組 vRNA8個(gè)節(jié)段的5'末端的13個(gè)核巧酸及3'末端的12個(gè)核巧酸高度保守，5'末端的核巧 酸序列為AGUAGAAACAAGA，3'末端的核巧酸序列為UCGUCUUUGUCC;由于每一個(gè)RNA節(jié)段的 5'末端和3'末端分別有部分序列互補(bǔ)，使病毒RNA環(huán)化形成鍋柄樣的結(jié)構(gòu)，W保護(hù)病毒基 因組。本發(fā)明提供的擴(kuò)增各亞型禽流感病毒全基因組的引物體系是針對(duì)亞型禽流感病毒高 度保守序列設(shè)計(jì)的，既包括了上述禽流感病毒的基因組，還包括了兩端極其保守的非編碼 區(qū)，其中包括一對(duì)擴(kuò)增各亞型禽流感病毒全基因的引物對(duì)，可采用一步法快速地獲得禽流 感病毒基因組，另外8對(duì)分別用于擴(kuò)增8個(gè)節(jié)段PB2/PB1/PA/HA/NP/NA/M/NS的引物對(duì)，可 選擇性地對(duì)8個(gè)節(jié)段進(jìn)行擴(kuò)增并拼接得到禽流感病毒基因組。
[0040] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0041]圖1為采用一步法RT-PCR擴(kuò)增禽流感病毒全基因組的凝膠電泳圖； 陽(yáng)0創(chuàng) 圖2為H7N9和H9N2的PCR擴(kuò)增禽流感病毒8個(gè)節(jié)段的凝膠電泳圖；
[0043] 圖3為冊(cè)N8病毒的凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] W下實(shí)施例中，所采用的PCR儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)均為常規(guī)設(shè)備，所 用試劑如未特殊說明，均為市售或通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法獲得。
[0045] 要施巧1[ 1 ;病料的米用與病毒的分齒
[0046] 1)病料的采集
[0047] 無菌采集病禽泄殖腔拭子和氣管拭子；氣管、肺臟、腸道及腸道內(nèi)容物、肝臟、脾 臟、腎臟和腦等組織的混合樣品。
[0048] 2)病毒的分離
[0049] 采集的泄殖腔拭子和氣管拭子先浸在滅菌生理鹽水中，將鼻拭子在管壁反復(fù)擠壓 后取出，充分振蕩管中液體，加入適量抗生素，室溫靜置作用30m，4000巧m罔屯、5min，取上 清液，迅速用RNA提取試劑盒提取病毒總RNA，-70°C保存。
[0050] 采集的病料組織，如：氣管和肺臟等組織，首先用滅菌的玻璃研磨器在無菌的條件 下研磨，用化證3液制成10%勻漿，加入雙抗至最終濃度分別為20001]/1^和200011肖/1^， 4°C感作4h后，取液，迅速用RNA提取試劑盒提取病毒總RNA，-70°C保存。
[0051] 上述處理的病料上清液經(jīng)尿囊腔羊膜腔雙腔接種9-lldSPF雞胚，0.2血/胚， 37°C解育，每天照蛋2次，連續(xù)觀察6天，棄去24h污染死胚。將死亡或溯死雞胚置4°C地 W上，剖檢，觀察胚胎病變、收獲尿囊液，取尿囊液，用RNA提取試劑盒提取病毒總RNA，得到 病毒總RNA，-70°C保存。
[0052] 本實(shí)施例中，采用TaKaRa公司病毒總RNA提取試劑盒提取病毒總RNA。 陽(yáng)化引 連施例2:-巧法RT-PCR擴(kuò)蠟禽流威病毒倉(cāng)基閑紀(jì)
[0054]RT-PCR反應(yīng)體系：10. 0μL病毒總RNA、10. 0μL5*buffer、10. 0μLlOmMdNTP、1. 0μLUaiv-F、1. 0μLUaiv-R、1. 0μL酶、DEPC&0 補(bǔ)足 50. 0μL; 陽(yáng)化引其中，Uaiv-F與Uaiv-R的濃度均為lOpmol/μL。
[0056]RT-PCR反應(yīng)條件：58°C30min，94°C預(yù)變性 3min，然后加入循環(huán)：94°C30s， 48°C30s，72°C7.Omin;進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)后，72°ClOmin。取加^RT-PCR產(chǎn)物于 1. 5% 的瓊脂 糖凝膠上樣孔中，130V電泳30min，檢測(cè)有梯度7條帶，對(duì)H9N2亞型某毒株的擴(kuò)增結(jié)果如圖 1所示?？寺『鬁y(cè)序或者直接測(cè)序。
[0057]圖 1 中，Ml泳道為DL5000DNAMarker;
[0058] 1泳道為H9N2亞型某毒株全基因組，其中，PB2/PB1 2：34化P、PA2233bp、HA 1742bp、NP156化p、NA1458bp、M1027bp、NS890bp。其電泳條件為：1%瓊脂糖凝膠，120v 條件下電泳30min條帶中形成PB2/PB1-PA、HA-NP-NA、Μ和NS四條帶型；電泳2h，PB2/PB1 與PA，HA、NP與ΝΑ均可W分開。
[0059] 2泳道為Η7Ν9亞型某毒株全基因組，其中，ΡΒ2/ΡΒ1 2：34化Ρ、ΡΑ2233bp、 HA1683bp、NP156化p、NA1398bp、M102化p、NS890bp。其電泳條件為：1%瓊脂糖凝膠， 120v條件下電泳30min條帶中形成PB2/PB1-PA、HA-NP-NA、M和NS四條帶型；電泳化，PB2/ PB1與PA，HA、NP與NA均可W分開。
[0060] 3 泳道為冊(cè)N2 亞型某毒株全基因組；PB2/PB1 2：34化P、PA2233bp、HA1779bp、NP 156化p、NA1458bp、M1027bp、NS890bp。其電泳條件為：1%瓊脂糖凝膠，120v條件下電泳 30min條帶中形成PB2/PB1-PA、HA-NP-NA、M和NS四條帶型；電泳化，PB2/PB1 與PA，HA、NP 與ΝΑ均可W分開。
[0061] 4泳道為陰性對(duì)照；
[0062]M2 泳道為：DL2000DNAMarker。
[0063] 連施例3:二巧法PCR擴(kuò)蠟禽流威病毒倉(cāng)基閑紀(jì)
[0064] 1)cDNA的合成： 陽(yáng)0化]W RT引物AGCRMAGCAGG為反轉(zhuǎn)錄引物，對(duì)病毒總RNA進(jìn)行PCR，合成cDNA;
[0066] 其中，該P(yáng)CR的反應(yīng)液如表1所示：
[0067] 表1基因組cDNA合成反應(yīng)液
[0068]
W例將上述反應(yīng)液混勻后，于70°C水浴5min，冰上冷卻2min，加入到表2所述體系中進(jìn) 行反應(yīng)：
[0070] 表2基因組cDNA合成反應(yīng)體系
[0071]
[0072] 室溫下放置10min，55°C水浴70min，94°C作用5min，反應(yīng)產(chǎn)物直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增 或-20°C保存?zhèn)溆茫玫絚DNA。
[0073] 2) 8個(gè)節(jié)段的擴(kuò)增：W cDNA為模板，分別使用上述的8個(gè)節(jié)段的引物對(duì)進(jìn)行PCR反 應(yīng)，分別得到禽流感病毒全基因組8個(gè)節(jié)段的PCR產(chǎn)物； 陽(yáng)074] 其中，PB2節(jié)段PCR反應(yīng)體系如表3所示，為25μL體系：
[0075] 表3 ΡΒ2節(jié)段PCR反應(yīng)體系
[0076]
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