一種熒光恒溫擴增技術的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種熒光核酸恒溫擴增技術，特別涉及一種不依賴于高能能量分子的熒光恒溫擴增技術。
【背景技術】
[0002]1983年，Mullis等發(fā)明了聚合酶鏈式反應(PCR)技術，30多年間，PCR技術得到長足發(fā)展，由于其在靈敏度和特異性方面的優(yōu)勢，PCR技術被迅速運用到科學研究和臨床研究的各個方面。這種類似于DNA的天然復制過程的PCR技術，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。主要包括三個基本反應步驟:(I)模板DNA的變性:通過加熱一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，成為單鏈；(2)模板DNA與引物的退火(復性):溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；(3)引物的延伸:DNA模板一引物結合物在72°C、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性一退火一延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。這一技術的開發(fā)極大地促進了生物研究的進展。
[0003]PCR在技術應用上也有幾點限制:第一，PCR技術需要昂貴的實驗室儀器，同時儀器要具備精細的溫度控制程序和加熱模板，從而實現很高的溫度下的DNA模板鏈的變性，較低的溫度下引物探針退火延伸模板，這樣重復溫度變化幾十個循環(huán)之后實現模板量的放大。由于每一個循環(huán)時間都較短，儀器必須能快速準確升降溫度，這就需要銀制或金制的加熱模塊，加大儀器研制的成本。第二，PCR擴增體系中有用的聚合酶必須具有耐受高溫的能力，否則則必須在每一個循環(huán)中重新加入新酶，以實現下一循環(huán)的擴增，這樣極容易造成污染也加大了成本。第三，在PCR循環(huán)中，每一個循環(huán)引物退火的時間都很短(幾秒到十幾秒)這就要求引物必須快速找到模板上同源匹配的區(qū)段，以實現延伸。這就要求PCR體系必須有過量的PCR引物。過量的引物會與模板錯配，錯誤引發(fā)擴增，引物二聚體等等，進而抑制PCR擴增，特別是在模板量低的情況，會使這種情況加劇。
[0004]與傳統(tǒng)的PCR技術相比，恒溫擴增技術主要利用重組酶的活性，不進行核酸解鏈和退火即可在恒溫條件下(如37°C)進行核酸的擴增，因此不需要昂貴的儀器，也避免了高溫對酶的損耗。同時恒溫擴增技術在體系中不需要加入過量的引物，降低了引物與模板錯配或生成引物二聚體的可能性。恒溫擴增技術日益受到重視。
[0005]熒光PCR可以更為方便用于定量分析，越來越受到人們的重視，熒光恒溫擴增技術也得到了進一步的發(fā)展。
[0006]常見的等溫擴增技術有以下幾種:滾環(huán)恒溫擴增(RCA)，環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)，依賴解旋酶恒溫擴增(HDA)等?，F有的恒溫擴增技術，其反應體系比較復雜，同時絕大部分恒溫擴增體系要么依賴于ATP，要么依賴于肌酸激酶和磷酸肌酸，或其他高能能量分子，所需的試劑種類繁多，擴增速度受限于能量的供給，這導致恒溫擴增技術成本比較高，限制了其應用。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種不依賴于高能能量分子的核酸熒光恒溫擴增反應試劑及方法。
[0008]本發(fā)明所采取的技術方案是:
一種熒光恒溫擴增反應試劑，溶劑為水，其組成如下:
Tris-緩沖液OmM—500mM
乙酸鎂3mM—50mM
二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-5M
Tween200%-10%
DMSO0%-10%
海藻糖0%-10%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—10mg/mL
dNTPs180uM—100uM
熒光染料、聚合酶、單鏈結合蛋白、重組酶，各適量；
重組酶為不依賴于能量分子的重組酶。
[0009]優(yōu)選的，熒光恒溫擴增反應試劑的組成如下:
Tris-緩沖液1mM-1OOmM
乙酸鎂5mM—20mM
二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-2M
Tween200%-1%
DMSO0%-10%
海藻糖0%-10%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—lmg/mL
dNTPs200uM—500uM
熒光染料、聚合酶、單鏈結合蛋白、重組酶，各適量。
[0010]優(yōu)選的，熒光恒溫擴增反應試劑用到的TriS-緩沖液的pH為7?9。
[0011 ] 熒光恒溫擴增反應試劑用到的Tr i S-緩沖液選自Tr i S-乙酸，Tris-H2SO4,
Tris-HCl0
[0012]熒光恒溫擴增反應試劑用到的熒光染料為SYBR green I，SYTO-9，SYT0-12，
SYT0-60，SYTO-62，SYTO-16，SYT0-82 或 P0P0-3，T0T0-3，T0-PR0-3 中的一種。
[0013]優(yōu)選的，熒光恒溫擴增反應試劑用到的重組酶選自E.coli RecT蛋白；λ噬菌體
β蛋白；啤酒酵母S印I/STP β ;啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPa蛋白；粟酒裂殖酵母
P14VExo 蛋白以及 Rrp 1、HPP- 1、v-SEP、ICP8 蛋白。
[0014]優(yōu)選的，熒光恒溫擴增反應試劑中添加有逆轉錄酶，用于檢測RNA。
[0015]一種核酸熒光恒溫擴增方法，包括將探針、引物、模板與恒溫擴增反應試劑混合，恒溫擴增至預期量后，將恒溫擴增反應體系的酶滅活，完成恒溫擴增，其中，恒溫擴增反應試劑如上所述。
[0016]優(yōu)選的，恒溫擴增的溫度為37?42°C。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的熒光恒溫擴增體系，不依賴于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相對現有的恒溫擴增體系，其組成更為簡單，成本更為低廉，使用更為方便。
[0018]本發(fā)明的恒溫擴增體系可以對DNA和RNA序列實現擴增，適用于復雜模板的擴增，擴增速度快且穩(wěn)定，可以在30 min以內完成擴增反應，擴增的靈敏度和準確性高，不易出現錯配，擴增效果好。
【附圖說明】
[0019]圖1是實施例1的熒光恒溫擴增結果圖；
圖2是實施例2的熒光恒溫擴增結果圖；
圖3是實施例3的熒光恒溫擴增結果圖；
圖4是實施例4的熒光恒溫擴增結果圖；
圖5是實施例5的熒光恒溫擴增結果圖；
圖6是實施例6的熒光恒溫擴增結果圖；
圖7是實施例7的熒光恒溫擴增結果圖；
圖8是實施例8的熒光恒溫擴增結果圖。
【具體實施方式】
[0020]一種熒光恒溫擴增反應試劑，溶劑為水，其組成如下:
Tris-緩沖液OmM—500mM
乙酸鎂3mM—50mM
二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-5M
Tween200%-10%
DMSO0%-10%
海藻糖0%-10%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—1mg/mL
dNTPs180uM—100uM
熒光染料、聚合酶、單鏈結合蛋白、重組酶，各適量；
重組酶為不依賴于能量分子的重組酶。
[0021]優(yōu)選的，其組成如下:
Tris-緩沖液1mM-1OOmM
乙酸鎂5mM—20mM 二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-2M
Tween200%-1%
DMSO0%-10%
海藻糖0%-10%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—lmg/mL
dNTPs200uM—500uM
熒光染料、聚合酶、單鏈結合蛋白、重組酶，各適量。
[0022]Tris-緩沖液的作用在于維持一定的pH，以便酶在最適pH或較優(yōu)的pH下進行擴增反應。其濃度可以根據需要進行相應的調整。作為上述反應試劑的進一步改進，所使用的 Tris-緩沖液的 pH 為 7 ?9，包括 Tris-乙酸，Tris-H2SO4, Tris-HCl。
[0023]乙酸鎂在于提供一定的離子強度，其用量可以根據核酸擴增情況進行一定的調整。
[0024]作為上述反應試劑的進一步改進，恒溫擴增反應試劑中還添加有熒光染料。熒光染料為 SYBR green I，SYT0-9，SYT0-12, SYT0-60，SYTO-62, SYTO-16, SYT0-82 或 P0P0-3，T0T0-3，T0-PR0-3 中的一種。
[0025]聚合酶、單鏈結合蛋白、重組酶的用量可以根據需要調整其添加量，或通過預實驗確定其用量。聚合酶為恒溫擴增反應中常用的聚合酶，優(yōu)選為Bsu或klenow。
[0026]作為上述反應試劑的進一步改進，重組酶選自E.coli RecT蛋白；λ ■菌體β蛋白；啤酒酵母S印I /STP β ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STP α蛋白；粟酒裂殖酵母ρ14°/Exo 蛋白以及 Rrp 1、HPP- 1、v-SEP、ICP8 蛋白。
[0027]作為上述反應試劑的進一步改進，恒溫擴增反應試劑中添加有逆轉錄酶，用于檢測 RNA0
[0028]一種核酸熒光恒溫擴增方法，包括將引物、模板與熒光恒溫擴增反應試劑混合，恒溫擴增至預期量后，將恒溫擴增反應體系的酶滅活，完成恒溫擴增
作為上述方法的進一步改進，恒溫擴增的溫度為37?42°C。
[0029]下面結合實施例，進一步說明本發(fā)明的技術方案。
[0030]實施例1:
依賴重組酶恒溫擴增反應試劑的具體成分如下:
Tris-H2SO4 (pH7.4)1mM
硫酸銨10mM
乙酸鎂14mM
二硫蘇糖醇5mM
甜菜堿0.8M
DMSO5%
海藻糖3%
PEG5%
BSA0.lmg/mL dNTPs200uM
聚合酶Bsu5U
單鏈結合蛋白250ng/ul 重組酶(λ噬菌體β蛋白)120ng/ul。
[0031]實施例2:
依賴重組酶恒溫擴增反應試劑的具體成分如下:
Tris-乙酸(ρΗ8.0)50mM
乙酸鎂14mM
甜菜堿0.5M
Tween200.34%
DMSO5%
二硫蘇糖醇4mM
PEG8%
BSA0.lmg/mL
dNTPs200uM
聚合酶 klenow50ng/ul
單鏈結合蛋白350ng/ul
重組酶(STPa)100ng/ul。
[0032]實施例3:
依賴重組酶恒溫擴增反應試劑的具體成分如下:
Tris-HCl (pH8.3)50mM
KCl60mM
乙酸鎂1mM
二硫蘇糖醇2mM
甜菜堿IM
海藻糖5.5%
PEG5.5%
BSA0.lmg/mL
dNTPs200uM
聚合酶Bsu50U
單鏈結合蛋白262