檢測f8基因突變的擴增引物、試劑盒及方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外基因檢測領域，尤其設及一種檢測F8基因突變的擴增引物、試劑 盒及方法
【背景技術】
[0002] 血友病化emo地ilia)是一種遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，患者由于凝血因 子基因突變而導致凝血因子濃度下降或缺乏，從而造成凝血時間延長、輕微創(chuàng)傷后有出血 傾向性。根據缺乏凝血因子的不同，臨床上分為血友病A(hemophiIia A，HA)和血友病B 化emopMlia B，皿）。其臨床表現主要為自發(fā)性、輕微外傷后出血難止或創(chuàng)傷、手術后嚴重 出血等。出血的部位常見于負重的大關節(jié)（如膝、肘、踩、腕、骼、肩等）和肌肉/軟組織，也可 表現為內臟出血(如腹腔內、腹膜后、泌尿、消化、呼吸道等）、皮膚、黏膜出血(如皮膚渺血、 鼻出血、口腔出血、牙銀出血等）。由于凝血因子VDKVDI因子)和凝血因子K(IX因子）的編碼 基因位于X染色體上，因此大多數血友病患者分布于男性，男性人群中血友病A和B的發(fā)病率 分別約為1/5000和1/30000。其中，血友病A化emophilia A，HA)是最常見的X連鎖隱性遺傳 性出血性疾病，由于FVIII的遺傳性缺陷或缺乏所致，從而引起凝血功能障礙，發(fā)病率在男 性中約為1/5000，女性通常為攜帶者，約60 %患者有遺傳病家族史?；颊叱３０l(fā)生自發(fā)性或 者外傷后出血不止，反復關節(jié)出血往往導致關節(jié)崎形，重要臟器出血可危及生命，目前尚無 有效的根治方法，患者主要輸注FVIII制品或新鮮全血預防和治療出血。由于HA的危害性、 遺傳性及終生性，有必要開展HA的基因檢測，為臨床干預和遺傳咨詢提供依據。遺傳學研究 表明血友病A主要由F8基因突變引起;該基因位于X性染色體長臂末端（（Xq28，ChrX: 154， 064,070-154,250,998，in hgl9)，其長度約有18化b并轉錄形成大約化b的mRNA;該基因含 有26個外顯子(exon)，各外顯子的大小不一，范圍在69bp至3106bp之間。F8基因結構復雜， 突變種類多，包括基因點突變、缺失、插入和倒位等，可能設及整個基因，幾乎覆蓋了所有外 顯子的區(qū)域，因此特異性檢巧權8基因突變較為困難。很多年來，F8基因的復雜性導致很難對 F8基因進行有效地突變分析。直到1991年，Higuchi等人首次使用變性梯度凝膠電泳法 (denaturing gradient gel elec1:;rophoresis，DGGE) W分析F8基因的整個編碼區(qū)，在29個 輕度或中度血友病A患者(包括15名德國人和14名日本人）中發(fā)現25名（86 % )患者F8基因致 病突變，而在重度血友病A患者中僅發(fā)現53%的患者F8基因致病突變。在1998年，Liu等首先 基于LD-PCR技術建立了Inv22突變檢測方法，隨后Bagnall等在2002年基于LD-PCR技術建立 了 Invl突變檢測方法，運兩種方法一直沿用至今。隨后，多種突變篩查方法，如單鏈構象多 態(tài)性（single strand conformation polymorphism, SSCP)、構象敏感凝膠電泳 (conformation sensitive gel electrophoresis)、DGGE和化學裂解錯配（chemical cleavage mismatch)分析方法，被使用于許多實驗室。但運些分析方法仍只能檢出的血友 病A患者中80-90 %的F8基因突變。對F8基因的直接測序(PCR擴增+Sanger測序），并且針對 血友病A患者的F8基因突變檢出率可達97%。最近幾年隨著二代測序技術的發(fā)展，二代測序 技術也逐漸在各實驗室使用并應用于血液疾病的遺傳檢測分析。目前，對PCR產物進行直接 Sanger測序是常用的F8基因檢測方法，雖然該方法更為準確，但測序工作量巨大、效率低， 對操作人員要求較高，限制了該方法的大規(guī)模臨床應用，僅能在有條件的實驗室開展。
[0003] 當前，CN102230002A公開了一種檢測血友病致病基因 F8基因和F9基因是否發(fā)生突 變的試劑盒，但其在擴增F8基因過程中所需要使用的引物組達24對，每對引物需要單獨擴 增，雖然較為準確，但方法過于繁瑣，反應體系需要后續(xù)純化，再結合Sanger進行后續(xù)處理， 檢測成本過高、效率低、分析困難。蔡曉紅等(女性血友病A FVIII基因的雙重雜合突變一例 基因分析，《血栓與止血學》，2005年，第11卷第02期，52-56頁)采用的方法與CN102230002A 類似，也有類似的缺陷。
[0004] 第二代測序技術（next-generation sequencing,NGS)具有高通量、快速、準確和 成本低的優(yōu)點，可實現多樣本、多個基因、多外顯子的同時檢測。其中，Life Technologies 公司的Ion torrent PGM高通量測序平臺是其中的代表，它是基于半導體忍片的新一代革 命性測序技術，使用一種布滿小孔的高密度半導體忍片，一個小孔就是一個測序反應池；當 DNA聚合酶把核巧酸聚合到延伸中的DNA鏈上時會釋放出一個H+，反應池中的pH值發(fā)生變 化，位于池下的離子感受器感受到此信號，把化學信號直接轉化為數字信號，從而讀出DNA 序列。Ion Torrent測序平臺原理不同于其他第二代測序技術，不屬于核酸標記、巧光檢測 的生化技術，相比其他測序技術，更簡單、經濟，具有強大的擴展性。在上千萬個納米孔中， 同時對上百萬的序列進行大規(guī)模平行測序，此項技術的產生擺脫了一代測序技術效率低， 費時費力的特點。因此，Ion torrent PGM測序技術可W對PCR產物進行直接測序，而不需要 片段化處理，而且采用標簽技術，不需要對每個樣本單獨建庫，可W顯著提高檢測通量，降 低單個樣品的檢測成本。目前還未有將多重PCR技術和Ion torrent PGM測序技術結合，并 將其應用于F8基因檢測的研究。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了克服W上不足，將多重PCR技術和Ion torrent PGM測序技術 結合，并將其應用于F8基因檢測。本發(fā)明通過設計了一組多重的引物，結合多重PCR技術，實 現了對F8基因26個外顯子編碼區(qū)的同步擴增富集，大大簡化了實驗操作;再結合標簽技術， 使多個樣本混合成一個文庫通過Ion Torrent PGM測序文庫構建環(huán)節(jié)同時處理，大大簡化 了實驗操作，最終每個樣本的檢測結果可W通過其獨特的標簽序列找回，實現多樣本平行 測序，提高了檢測效率，降低了檢測成本。而在本發(fā)明的優(yōu)化PCR引物設計，采用65個PCR反 應可W在單管中同步擴增獲得F8基因全部外顯子序列及側翼內含子序列，與其它目標區(qū)域 捕獲技術(如忍片捕獲技術)相比，該方法操作更為簡單，成本較低，而且結合Ion Torrent 半導體測序技術后更為節(jié)約了檢測時間和檢測成本，彌補了已有二代高通量測序方法工作 時間過長的缺陷
[0006] 本發(fā)明提供的技術方案為：
[0007] 用于多重PCR特異性擴增檢測F8基因突變的引物組，所述PCR引物共65對，分別如 下：
[000引用于擴增F8基因外顯子1和內含子1的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 1所示，反向 引物如沈Q ID NO:2所示；
[0009] 用于擴增F8基因內含子巧Ij外顯子2的引物，其正向引物如SEQ ID N0:3所示，反向 引物如沈Q ID NO :4所示；
[0010] 用于擴增F8基因外顯子巧Ij內含子2的引物，其正向引物如SEQ ID N0:5所示，反向 引物如沈Q ID NO:6所示；
[0011]用于擴增F8基因內含子巧IJ內含子3的引物，其正向引物如SEQ ID N0:7所示，反向 引物如沈Q ID NO:8所示；
[001引用于擴增F8基因內含子巧Ij外顯子4的引物，其正向引物如SEQ ID N0:9所示，反向 引物如SEQ ID NO: 10所示；
[001引用于擴增F8基因外顯子巧IJ內含子4的引物，其正向引物如SEQ ID N0:11所示，反 向引物如沈Q ID NO: 12所示；
[0014]用于擴增F8基因內含子巧IJ內含子5的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 13所示，反 向引物如沈Q ID NO: 14所示；
[001引用于擴增F8基因內含子巧IJ內含子6的引物，其正向引物如SEQ ID NO: 15所示，反 向引物如沈Q ID NO: 16所示；
[0016]用于擴增F8基因內含子巧IJ外顯子7的引物，其正向引物如SEQ ID N0:17所示，反 向引物如沈Q ID NO: 18所示。
[0017]用于擴增F8基因外顯子巧IJ內含子7的引物，其正向引物如SEQ ID N0:19所示，反 向引物如SEQ ID NO: 20所示。
[0018]用于擴增F8基因內含子7到外顯子8的引物，其正向引物如SEQ ID N0:21所示，反 向引物如SEQ ID NO: 22所示。
[0019]用于擴增F8基因外顯子巧IJ內含子8的引物，其正向引物如SEQ ID N0:23所示，反 向引物如SEQ ID NO: 24所示。
[0020]用于擴增F8基因內含子8到外顯子9的引物，其正向引物如SEQ ID N0:25所示，反 向引物如SEQ ID NO: 26所示。
[0021 ]用于擴增F8基因外顯子巧IJ內含子9的引物，其正向引物如SEQ ID N0:27所示，反 向引物如SEQ ID NO: 28所示。
[0022] 用于擴增F8基因內含子9到外顯子10的引物，其正向引物如SEQ ID N0:29所示，反 向引物如SEQ ID NO: 30所示。
[0023] 用于擴增F8基因內含子10到外顯子11的引物，其正向引物如SEQ ID N0:31所示， 反向引物如SEQ ID NO: 32所示。
[0024] 用于擴增F8基因外顯子11到內含子11的引物，其正向引物如SEQ ID N0:33所示， 反向引物如SEQ ID NO: 34所示。
[0025] 用于擴增F8基因內含子11到內含子12的引物，其正向引物如SEQ ID N0:35所示， 反向引物如SEQ ID NO: 36所示。
[0026] 用于擴增F8基因外顯子12到內含子12的引物，其正向引物如SEQ ID N0:37所示， 反向引物如SEQ ID NO: 38所示。
[0027] 用于擴增F8基因內含子12到外顯子13的引物，其正向引物如SEQ ID N0:39所示， 反向引物如SEQ ID NO:40所示。
[002引用于擴增F8基因外顯子13到內含子13的引物，其正向引物如SEQ ID N0:41所示， 反向引物如SEQ ID N0:42所示。
[0029] 用于擴增F8基因內含子13到外顯子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:43所示， 反向引物如SEQ ID NO:44所示。
[0030] 用于擴增F8基因外顯子14到外顯子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:45所示， 反向引物如SEQ ID NO:46所示。
[0031 ] 用于擴增F8基因外顯子14到外顯子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:47所示， 反向引物如SEQ ID NO:48所示。
[0032] 用于擴增F8基因外顯子14到外顯子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:49所示， 反向引物如SEQ ID NO: 50所示。
[0033] 用于擴增F8基因外顯子14到外顯子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:51所示， 反向引物如SEQ ID NO: 52所示。
[0034] 用于擴增F8基因外顯子14到外顯子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:53所示， 反向引物如SEQ ID NO: 54所示。
[003引用于擴增F8基因外顯子14到外顯子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:55所示， 反向引物如SEQ ID NO: 56所示。
[0036] 用于擴增F8基因外顯子14到外顯子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:57所示， 反向引物如SEQ ID NO: 58所示。
[0037] 用于擴增F8基因外顯子14到外顯子14的引物，其正向引物如SEQ ID N0:59所示， 反向引物如SEQ ID N0:60所示。
[003引用于擴增F8基因外顯