鑒別柑橘單胚和多胚的共顯性InDel分子標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及相橘基因組學領(lǐng)域，具體地指一種鑒別相橘單胚和多胚的共顯性 InDel分子標記及其應(yīng)用，該分子標記可W作為相橘單/多胚育種標記輔助選擇，為鑒別相 橘單/多胚品種提供新的分子標記。
【背景技術(shù)】
[0002] 多胚現(xiàn)象在相橘類植物中很普遍，多胚類型的相橘一粒種子可產(chǎn)生2-10個胚，據(jù) 報道一個種子最多出現(xiàn)42個胚。多胚現(xiàn)象是一種特殊的無融合生殖現(xiàn)象，它和有性生殖(單 胚)有明顯的區(qū)別，不經(jīng)歷減數(shù)分裂和受精過程，由體細胞(珠屯、細胞)發(fā)育成胚。多胚過程 是無性繁殖方式，后代實際上是母體的無性復(fù)制(Clonal copy)。多胚性狀在相橘生產(chǎn)中廣 泛利用，尤其是在化木育種中通過無融合生殖產(chǎn)生的后代發(fā)芽和出苗率高、苗木均勻粗壯、 整齊一致、無病毒和管理方便。如何將多胚特性導(dǎo)入作物一直受育種學家的關(guān)注，特別在固 定雜種優(yōu)勢方面具有廣闊的應(yīng)用潛力。如果母本是雜種優(yōu)系，那么后代將永久保存運種基 因型。我國在水稻雜種優(yōu)勢利用方面處于國際領(lǐng)先，袁隆平院±提出了水稻雜種優(yōu)勢利用 S步曲：系法"到"兩系法"再到"一系法"，其中"一系"就指利用無融合生殖來固定雜種 優(yōu)勢。
[0003] 多胚和單胚的鑒定一般是通過肉眼在顯微鏡下觀察，存在著費時、費力、準確率不 高等問題，然而關(guān)于相橘多胚性狀共分離分子標記的開發(fā)，多年來進展緩慢。最重要的原因 是受制于基因組信息的缺乏，分子標記離多胚位點比較遠，難W有效利用開發(fā)共分離的分 子標記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的提供了一種鑒別相橘單胚和多胚的共顯性InDel分子標記及其應(yīng) 用，其為相橘胚性的早期診斷及相關(guān)分子育種提供一種簡單、快速和有效的輔助選育方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種鑒別相橘單胚和多胚的共顯性InDel分子標 記，所述共顯性InDel分子標記的核巧酸序列分別如SEQ ID NO: 1、沈Q ID N0:2和SEQ ID NO: 3所示。
[0006] 用于獲得上述分子標記的引物對，所述引物對分別為：
[0007] 引物對CK F/R [000引正向引物5'
[0009] 反向引物5' ，
[0010] 引物對INS F/R [00川正向引物5'
[0012]反向引物5'
[OOU] 引物對呢L F/R
[0014] 正向引物5'
[0015] 反向引物5'-〇：1'〔641614(：口'44〔641'1'-3'。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種上述適用于相橘單多胚鑒定的共顯性InDel分子標記的制備 方法，包括W下步驟：
[0017] 1)利用前期完成的107個相橘材料均進行深度約為30X的基因組測序，綜合已有對 多胚性狀的遺傳定位結(jié)果，選取甜澄4號染色體的2.355-3.83M區(qū)域為相橘單多胚相關(guān)候選 區(qū)域;運用blastn，分別在107份材料中找到該候選區(qū)段在各個基因組中的對應(yīng)同源區(qū)段序 列；
[0018] 2)根據(jù)材料所屬的相橘類別，用BWA軟件將107個材料的測序reads分別比對到各 自基因組的候選區(qū)段;利用IC0RN2軟件，W甜澄基因組候選區(qū)域中被注釋出來的208個基因 為參考序列，得到各個材料候選區(qū)域的208個基因序列；
[0019] 3)利用MEGA軟件，逐個查看多序列的比對結(jié)果，根據(jù)材料的單多胚表型情況，統(tǒng)計 位點的各種堿基/單體型的比率，并人工查看、篩選出與表型關(guān)聯(lián)性程度最高的序列多態(tài) 性，發(fā)現(xiàn)一個化P的InDel在多胚和單胚材料中差異明顯，此結(jié)果為基于測序結(jié)果預(yù)測的單 多胚連鎖標記；
[0020] 4)根據(jù)W上序列信息，設(shè)計了實驗驗證，將InDel序列TTTATG開發(fā)為共顯性PCR標 記，分別為檢測該InDel的插入并命名為INS-specific，檢測InDel的缺失并命名為DEレ specif iC，W及對照命名為CK，綜合S者結(jié)果，直接從膠圖上判斷各個材料該位點的基因 型。
[0021 ]作為優(yōu)選方案:所述步驟4)具體步驟如下：
[0022] 1)設(shè)計正向引物3 '端為TTTATG的INS-specif ic引物，如下所示：
[0023] 引物對INS F/R
[0024] 正向引物5 ' -GTATCCTAAAAATATAATCTTTATG-3 '，
[00 巧]反向引物5'-41'〔441'17610：1'1761'〔0：-3'；
[0026] 其PCR產(chǎn)物為SEQ ID NO:2所示，特異檢測該化P堿基插入的存在；
[0027] 2)設(shè)計正向引物跨越該InDel位點且缺失TTTATG序列的DEkspecific引物，如下 所示：
[002引 引物對DEL F/R
[0029] 正向引物5 ' -CAAAGATTATTGATATGGGAAAG-3 '，
[0030] 反向引物5 ' -CCTCGATGTACCTAACGATT-3 ' ；
[0031] 其PCR產(chǎn)物為SEQ ID NO:3所示，特異檢測該位點缺失此化P堿基的情況；
[0032] 3)在該InDel上游處設(shè)計正向引物，下游設(shè)計反向引物，組成一對CK引物，如下所 示：
[0033] 引物對CK F/R
[0034] 正向引物5 ' -CGTTCTTCAGACCCTTTCAG-3 '，
[0035] 反向引物5'-1610：1'1761'〔0：410：1'1'(：-3'；
[0036] 其PCR產(chǎn)物為SEQ ID NO: 1所示，綜合S者結(jié)果，直接從膠圖上判斷各個材料該位 點的基因型。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種上述分子標記在相橘單多胚鑒定中的應(yīng)用，利用共顯性 InDel分子標記在鑒別115個相橘材料的胚性。
[0038] 本發(fā)明還提供了一種上述特異性引物對CK F/R、INS F/R和DELF/R在相橘胚性鑒 定中的應(yīng)用，利用3個引物對進行PCR鑒定皿抽(單胚）X化irchild相(多胚)雜交群體100株 后代。
[0039] 本發(fā)明的意義
[0040] 遺傳標記作為生物個體或群體間遺傳差異的客觀表現(xiàn)，主要是指那些可明確反映 生物多態(tài)性的生物特征。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，遺傳標記的種類得到了迅速的發(fā)展和 豐富，先后出現(xiàn)了形態(tài)標記、細胞學標記、蛋白質(zhì)標記W及DNA標記。DNA分子標記與其他標 記技術(shù)相比，具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、受環(huán)境條件和發(fā)育階段影響小、檢測手段簡單、迅速 等優(yōu)點。因此，DNA標記作為一種理想的分子標記，已廣泛應(yīng)運與動植物的分子生物學研究， 在基因定位與克隆、物種起源W及馴化方面的研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。近年來，隨 著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，分子標記開發(fā)技術(shù)也得到了迅猛地發(fā)展。利用高通量技術(shù)開發(fā) 基于PCR技術(shù)、操作簡單、應(yīng)用價值大的分子標記，可為控制相橘重要農(nóng)藝性狀的基因定位 和分子標記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。
[0041 ] 基于全基因組DNA序列開發(fā)的新一代分子標記InDel (Inse;rtion/DeIetion 化Iymo巧M sms)插入缺失標記，指的是兩種親本中在全基因組中的差異，相對另一個親本 而言，其中一個親本的基因組中有一定數(shù)量的核巧酸插入或缺失。根據(jù)基因組中插入缺失 位點，設(shè)計一些擴增運些插入缺失位點的PCR引物，運就是InDel標記，是基因組中一種特殊 類型的二等位基因遺傳標記，表現(xiàn)為基因組中插入或缺失了不同大小的小片段DNA序列，屬 于共顯性標記，具有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性等優(yōu)點。
[0042] 通過全基因組序列信息挖掘為鑒定單多胚提供了一條快速、有效途徑。由于InDel 的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長度。InDel 被認為是繼RFLP和SSR之后最有前途的第=代分子標記，在植物領(lǐng)域的遺傳圖譜構(gòu)建、性狀 相關(guān)分子標記開發(fā)、W及生物學基礎(chǔ)研究正在快速應(yīng)用。
[0043] PCR擴增目的序列及瓊脂糖電泳是鑒別InDel最簡捷的方法。根據(jù)目的序列設(shè)計特 異性引物，W不同個體的基因組DNA為模板，用同一PCR反應(yīng)體系進行擴增，對所獲得的擴增 產(chǎn)物直接進行瓊脂糖電泳，仔細核對各個體是否有目的條帶就可查明該目的序列在所測各 個體基因組之間是否存在InDel。
[0044] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0045] 本發(fā)明成功得到了相橘胚性的共顯性InDel分子標記，運用該標記進行相橘胚性 的鑒別，可W克服傳統(tǒng)依靠肉眼鑒別胚性費時、費力、準確率不高的缺點；同時可W在雜交 后代早期（1年W內(nèi)）進行分子標記診斷，而傳統(tǒng)育種等待果實結(jié)果產(chǎn)生種子需要3-8年時 間，相比之下，該分子標記應(yīng)用于輔助育種具有時間早、成本低的優(yōu)勢。該標記可W應(yīng)用于 育種實踐中的不同目標，進行化木育種可利用該標記篩選多胚材料，而進行雜交育種則篩 選單胚材料，從而提高了相橘的育種效率。
【附圖說明】
[0046] 圖1為引物對CK F/R、INS F/R和DEL F/R設(shè)計示意圖。
[0047] 圖中左側(cè)膠圖為結(jié)果示例，單/多分別代表表型為單胚/多胚。圖2:引物對CK F/R、 引物對INS F/R和引物對DEL F/R分別在相橘自然群體115個品種基因組DNA中的擴增結(jié)果。
[004引圖中：1代表立花橘（多雜）；3代表道縣野橘（多雜）；6代表道縣野橘粗皮（多雜）；7 代表崇義野橘(多雜）；9代表紅皮酸橘(多雜）；11代表滑皮橘(多雜）；12代表碰相(多雜）；13 代表黃巖本地早（多雜）；14代表溫州蜜相（多雜）；16代表道縣-3(多雜）；21代表茶枝相（多 雜）；22代表冰糖橘（多雜）；25代表長沙南橘（多雜）；26代表紅橘（多雜）；27代表酸澄（多 雜）；28代表酸澄(多雜）；29代表酸澄(多雜）；30代表酸澄(多雜）；31代表酸澄(多雜）；33代 表暗柳澄(多雜）；34代表錦澄(多雜）；35代表哈姆林(多雜）；36代表桃葉澄(多雜）；37代表 華廝(多雜）；38代表雪相(多雜）；39代表夏澄(多雜）；40代表血澄(多雜）；41代表冰糖澄(多 雜），2代表印度野橘(單胚）；15代表南豐蜜橘(單胚）；32代表班巧甜澄(單胚）；55代表寧波 金相(單胚）；56代表山金相(單胚）；57代表積殼(單胚）；58代表克里曼下(單胚）；59代表沃 相(單胚）；60代表威爾金(單胚）；61代表清見(單胚），62代表臨武酸澄(單胚）；63代表紫皮 抽（單胚）；64代表化州橘紅(單胚）；65代表沙田抽（單胚）；66代表擅溪蜜抽（單胚）；67代表 無酸抽(單胚）；68代表吉安抽子(單胚）；69代表瑞麗抽子(單胚）；70代表華農(nóng)紅抽(單胚）； 71代表高斑抽（單胚）；72代表桂林抽子(單胚）；73代表晚白抽（單胚）；74代表重慶抽子(單 胚）；75代表浙江抽子(單胚）；76代表馬家抽（單胚）；78代表元橘（單胚）；79代表莽山野相 (單胚），80代表小花大翼澄(單胚）；84代表宜昌澄2(單胚）；85代表宜昌澄3(單胚）；88代表 構(gòu)祿(單胚）；90代表構(gòu)祿(單胚）；92代表構(gòu)祿(單胚）；94代表構(gòu)祿(單胚）；95代表佛手（單 胚）；96代表積殼2(單胚）；97代表積殼3(單胚）；98代表Amo(單胚）；99代表Cpo(單胚）；103代 表Sdi(單胚）；106代表酒餅勒(單胚）；107代表嚷殼刺(單胚）；83代表宜昌澄(單胚）；110代 表Ace